细菌室工作流程.doc

细菌室工作流程简介
一、标本接种与涂片染色
（一)标本的接种：
⑴培养基选择及接种方式：
标本类型            培养基组合                接种方式
痰、咽拭子    血平皿+中国蓝平皿+流感嗜血杆菌平皿     三区划线法
尿            血平皿+中国蓝平皿          血：直、曲线法，中：三区划线法
分泌物        血平皿+中国蓝平皿                      三区划线法
大便          SS平皿+TCBS平皿                      三区划线法
输液液体、腹水、      普通肉汤管                      直接倾倒
胆汁、胃液、脓液等
血、脑脊液、骨髓、      血培养瓶                      用注射器注入
胸水、关节液
培养类别             选择性培养基                  接种方式
真菌                 沙氏培养基                    直接划线
淋球菌               巧克力淋球菌培养基            直接划线
结核杆菌             罗氏结核菌培养管              直接划线
L—型细菌           高渗肉汤培养管                 直接接种
霍乱弧菌            碱性蛋白胨培养管               直接接种
⑵血培养瓶选择如下:
培养瓶瓶的颜色抽血量（ml）
标准需氧培养瓶蓝色5—10
标准厌氧培养瓶紫红色5—10
中和抗生素需氧培养瓶绿色5—10
中和抗生素厌氧培养瓶橙黄色5-10
小儿血培养瓶浅黄色1—2
结核杆菌血培养瓶黑色5—10
(二)标本涂片和染色
1、看湿片（未染色片)：
⑴正常人体的下呼吸道是无菌的,上呼吸道有正常菌群栖居。下呼吸道标本来源有多种:痰、支气管肺灌洗吸出液、气管抽出液或刷子、肺穿刺或活组织等。
痰标本在接种前需涂片镜检，以确认留取的标本是否有临床意义。在低倍镜下计数每低倍视野白细胞和上皮细胞的平均数目，按照以下标准判定标本是否适合做培养:
白细胞         上皮细胞         是否适合
A：       ＞25             ＜10              是
B：       ＞25             ＜25              是
C：       ＜10             ＞25              否
不合格的标本应电话告诉临床科室重留标本。
⑶霍乱弧菌（投标样动力，运动似流星）
2、革兰氏染色：
⑴涂片革兰氏染色找细菌:革兰氏阳性菌:球菌（G+C）、杆菌少（G+b）
革兰氏阴性菌:杆菌（G—b)、球菌少（G—C）
⑵涂片革兰氏染色找真菌:找菌丝、孢子
⑶菌群分析：大便标本球、杆菌比例.
备注:加德纳尔氏菌是细菌性阴道症的主要致病菌之一，此症有如下特点：
1）阴道排出物过多;
2）阴道PH＞4。5;
3）阴道上皮细胞被G-小b覆盖形成为线索或线球细胞；
4）KOH试验阳性：阴道分泌物滴加10%KOH后,立即出现鱼腥味和氨味；
3、抗酸染色：
查找抗酸杆菌.如结核杆菌、麻风杆菌。
4、墨汁染色：
查找新型隐球菌。特点：有荚膜，夹膜折光性强。
5、看菌落形态：
1。肉眼看：
  血平皿上：有脐窝状的可能是草绿色链球菌,微黄色可能是奈瑟氏菌，干燥的可能是真菌，乳白色的可能是葡萄球菌，湿润的可能是肠球菌。
  中国蓝上：微黄色可能是奈瑟氏菌，有选择性地促进革兰氏阴性菌生长，发酵型革兰氏阴性杆菌因分解乳糖能力不同,在此平皿上的菌落颜色不同。
 流感嗜血杆菌平皿上：微黄色可能是奈瑟氏菌，
（三）转种：
1。阳性血培养瓶:1)涂片革兰氏染色：找到细菌→向临床科室报告；
未找到细菌→暂不报告，待转种生长后再报；
2）转种：血平皿、中国蓝平皿。
2。肉汤管:1）培养3天后仍然透明清亮：转种血平皿一个；
2)浑浊：转种血平皿、中国蓝平皿各一个。
二、细菌鉴定（视标本、科室而定）
（一）标本培养的菌落计数及有意义菌落的筛选
1、痰：
（1）菌落计数
1)只有第一区生长，计103/ml；
2）第一、二区生长,第三区不长,计105/ml；
3）三个区均生长，计107/ml;
（2）菌落筛选
1）＜103/ml ：视科别而定，除ICU、CCU、急诊科、老年科和呼吸科危重病号外，一般报告为：无致病菌生长;
2）＝103/ml ：除非细菌生长较纯或可能为葡萄球菌需进一步处理外一般报告为：无致病菌生长；
3）＞103/ml :①根据菌落形态将其中意义不大的标本报告单发出，一般报告为:无致病菌生长；微黄色报告奈瑟氏菌；
血平皿上有脐窝状可能为草绿色链球菌,需做如下鉴定：
4）血平皿：草绿色链球菌做OPTOCHIN;
  中国蓝:真菌（YBC)转沙氏、种芽管。
2、尿：
1)菌落计数：
定量接种环涂抹法:用10μl定量接种环取一环尿液在血平皿上做均匀划线接种，置于35℃24h培养，计数生长的菌落数，再乘以100，即为每毫升菌落数。菌落生长过多不可计数时，报告＞105cfu/ml。
2)一般情况下细菌数不会超过103cfu/ml，诊断泌尿系感染的细菌学标准是：菌落计数≥105cfu/ml.
3、前列腺液：
1）密集生长→分纯（选乳白色的菌落）→鉴定
2)偶有生长→报告为：无致病菌生长
3）无菌生长→报告为：无细菌生长
4、大便：
中国蓝及SS平板：找细小、无色、透明的菌落→KIA试验
＋：血清学鉴定
－：报告无致病菌生长
TCBS平板：黄色菌落→氧化酶：+：O/F试验：＋：上机药敏
                                        －：报告无致病菌生长
                                        －：很少，可能为梅氏弧菌，报告无致病菌生长
5、其他标本（血、脑脊液、静脉管等）的细菌鉴定：一般不需计数，只要有细菌生长（污染菌除外）,就需进行鉴定处理.
三、鉴别试验:
1、血平板（链球菌属）    细小、圆形、表面光滑、灰白色、半透明
（1）选血平皿上有脐窝状的菌落（可能是草绿色链球菌):在血平皿上做OPTOCHIN(奥卜托欣）试验:1)＋：报告肺炎链球菌       2）－：报告草绿色链球菌
（2）牛奶美蓝试验:1）＋：粪肠球菌 2）－：手工生化反应组鉴别菌类
（3)卫星现象（用金黄色葡萄球菌做)：
1)血平皿:＋:流感或付流感→M—H平皿:＋：付流感：无致病菌生长
         －：无致病菌生长              －：流感
2）细菌与生长因子:
血平皿上有V+X因子,（药平皿）M-H平皿上有V因子。
细菌名称所需生长因子
流感嗜血杆菌Ⅴ+Ⅹ
付流感嗜血杆菌Ⅴ
杜克氏菌Ⅹ
2、涂片：
阳性杆菌→上机BAC卡
阳性球菌→做触酶(H2O2)
阴性杆菌→做氧化酶(OX)
真菌(YBC)→转沙氏（分纯）、种芽管（看是不是白色念珠菌）
可疑金黄色葡萄球菌要加做凝固酶加以确定
3、用KOH（氢氧化钾)拉丝试验（鉴别阴性菌还是阳性菌）
拉丝＋：是阴性菌           拉丝－：是阳性菌
4、触酶（H2O2):
先挑取菌落1个，加1滴H2O2，马上出现气泡的为阳性,其次为阴性。在革兰氏阳性菌中，链球菌触酶试验阴性，葡萄球菌、微球菌均阴性。
5、凝固酶：
可疑为金黄色葡萄球菌做凝固酶：100ul血浆＋300ul生理盐水＋1个菌落。
6、上机、药敏：
G—b做氧化酶，G+C做触酶（CAT）
革兰氏阴性菌G-b要做氧化酶（试纸片法)。
中国蓝上生长G—b的菌落（非真菌）：氧化酶＋：上机GNI反应卡〇涂黑→●、革兰氏阴性菌药敏3板（①②③)
                                   氧化酶－:上机GNI反应卡〇→〇、革蓝氏阴性菌药敏4板（①②③④）
中国蓝不生长G+C的白色菌落做触酶：1）＋→凝固酶：
玻片法＋→试管法＋:报金黄色葡萄球菌、G＋药敏＋葡萄球菌＋（OX）苯唑          －：上机GPI○、G＋药敏＋葡萄球菌＋（OX）苯唑西林 －：上机GPI○、G＋药敏＋链球菌
                               2）－：牛奶美蓝1）＋:粪肠球菌、肠球菌药敏
                                               2）－：手工生化反应组鉴别菌类
7、种芽管（鉴定是否是白色念珠菌）同时转沙氏：
种芽管：300ul血清＋1个真菌菌落
1）＋:报告为白色念珠菌不用上机→直接做真菌药敏；
2）－：上机YBC(真菌）卡室温放置24h后放入检测仪，如不能鉴定其种属，需再室温放置24h后放入检测仪鉴定,如仍不能鉴定其种属则需做手工生化鉴定→真菌药敏。
四、分纯
平板上不纯的菌落经涂片
1）一般原则是血→血，中国兰→中国兰，沙氏→沙氏。
2）革兰氏阳性菌:转血平板;
3）革兰氏阴性菌：转中国兰；
4)真菌:转沙氏培养基。
五、上机药敏
1、常用的几种生化反应卡
1）革兰氏阴性菌：GNI反应卡,将菌液充入卡中直接上机;
2）革兰氏阳性球菌：GPI反应卡，将菌液充入卡中直接上机；
3）革兰氏阳性杆菌:BAC反应卡，将菌液充入卡中直接上机；
4)真菌：YBC反应卡，将菌液充入卡中于室温放置24h后再上机读卡。
2、上机孔标记：
1）革兰氏阴性菌：GNI反应卡,氧化酶阳性（○→●）
2)革兰氏阴性菌：GNI反应卡，氧化酶阴性(○→○)
3）革兰氏阳性菌：GPI反应卡，触酶阳性(○→●）
4）革兰氏阳性菌:GPI反应卡，触酶阴性（○→○）
5）BAC反应卡：不需涂黑
6）YBC反应卡：室温放置24h,读卡，（○→●）室温放置48小时。
3、药敏
1）革兰氏阴性菌:氧化酶：＋:1、2、3号革兰氏阴性菌药敏板
                     －：1、2、3、4号革兰氏阴性菌药敏板
2）革兰氏阳性球菌：触酶:＋：1革兰氏阳性菌药敏板、葡萄球菌药敏板及苯唑西林(OX)
                     －：1号革兰氏阳性菌药敏板、链球菌药敏板
3）革兰氏阳性杆菌：一般不做药敏，如临床医生要求，则使用Etest法判读最小抑菌浓度MIC。
4)真菌：1、2号真菌药敏板
5）ESBL：
4、次日测量药敏结果并在计算机细菌鉴定系统中查记鉴定出的前一天上机细菌的菌名，如非真菌类细菌未被鉴定出，则须人工查阅鉴定手册,如仍不能查出，可进行手工生化鉴定或重新上机；如真菌类细菌未被鉴定出，则须将生化反应卡再于室温放置24h后上机读卡即可获得结果。
六、报告结果
1）将中文菌名印于原始化验单上;
2）对于痰标本培养，将其湿片结果及菌落计数印于化验单上;
  对于尿标本培养，将其菌落计数印于化验单上；
3）打印非真菌（革兰氏阴性、阳性菌）药敏单，贴于化验单上；
4)打印真菌药敏单，贴于化验单上;
5）超广谱β—内酰胺酶（ESBL）阳性的要在报告单上注明；
6)将报告日期、报告者姓名印于化验单,然后在登记本上记录结果，最后向临床科室发出报告单（包括化验单和药敏单)。
七、其他项目
（一）接种项目
1、淋球菌培养：35℃48h培养后,细小、透明似水滴状,凸起、光滑、圆形、无色素菌落→氧化酶（1）＋：糖类分解试验及有关试验：葡萄糖(＋）麦牙糖、乳糖、蔗果糖、硝亚硝(—）多糖体合成及DNA酶（－)（2）－：报告为无淋球菌生长，阳性的要加做纸片法药敏.
2、L型细菌：由串珠状链杆菌变异而来，形态及染色性多变，最突出的特点是细胞壁缺失，确认通常靠观察菌落形态和染色性。
低倍镜下：细胞壁缺失的细菌
⑴典型的L型：“油煎蛋”样菌落，中心部位致密，透光度差，嵌入生长,周围透明;
⑵不典型的G型：比L型菌落大，无透光度差的核心，整个菌落呈透明颗粒状；
⑶不典型的F型：菌落有时可见致密核心，其周边或全部由长丝构成；
⑷备注：L型细菌具“返祖"特性，利用此点可与支原体（不返祖）相鉴别，而且只有反祖后才能进行种别鉴定，其对作用于细胞壁的抗生素（如青霉素、头孢霉素等）常有耐药性，而能干扰细菌蛋白合成的抗生素（如卡那霉素、链霉素、庆大霉素等）对L型细菌的抑制作用较强.
3、支原体培养专用肉汤管： 1）红色清亮透明：报告为有尿素支原体生长；
2）红色浑浊：可能有其他细菌污染，报告为无支原体生长；
3）培养3天后不变红、保持原色，报告为无支原体生长；
4）药敏有专用试剂盒:判断药敏结果的方法与判断有无支原体生长的方法基本相同：颜色变红的为耐药,即生长；颜色不变的为敏感，即不长；药物浓度高的不变色，浓度低的变红为中介，即在高浓度的药物中不生长，而在低浓度的药物中可生长。
4、空气培养（计数）：
所有平板的菌落数之和÷平板数×157＝报告结果.
（二）试剂盒项目（免疫法）
原理：抗原抗体反应，凝集反应。
沙眼衣原体抗原（免疫法）肺炎支原体抗体（免疫法)
肺炎衣原体抗体(免疫法)军团菌抗体（免疫法）
八、细菌培养基制备
（一)平板基础液
血平皿中国蓝平皿药敏平皿空气平皿沙氏平皿SSTCBS
（二)肉汤管
普通肉汤管高渗肉汤管碱性蛋白胨管支原体肉汤管
（三）斜面
罗琼氏培养基（结核杆菌培养基)枸橼酸盐管双糖管
（四）生化反应管
糖类氨基酸类醇类其他
（五）倒好培养基后要做无菌试验
（六）储存于冰箱冷藏备用.