外泌体提取方法总结.doc

1、 细胞培养上清：即在4下，首先300g离心10 min,吸取上清液，然后2 000g离心10 min；吸取上清液后，10 000g 高速离心30 min，吸取上清液；140000g超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000g 再次离心90 min，100 L PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于-80备用。2、 将小鼠或人血收集在1。5mL管中，并使其在37下凝结1小时而不进行抗凝。 此后，将其以2，000g离心持续10分钟获得血清。接着将血清以3，000g离心10分钟. 将上清液以无菌PBS以1：1的比例稀释并离心再次以10,000g保持30分钟，然后以200,000g进行2小时超速离心。 将颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0。2-m注射器过滤器过滤,并以200,000g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。血浆用紫色的管子,EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。在4C下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化.外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同,但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度.该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005)。基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。材料液体(例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离；淋巴，血清,尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水(PBS;附录） 2A）冷冻离心机50毫升聚丙烯离心管0。22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表3。22。1)适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表3。22） 0。1）注意：所有离心均应在4下进行。1.用等体积的PBS稀释液体。将稀释的液体转移到50毫升管中。在2，000g，4下离心30分钟.2。将上清液转移到超速离心管或瓶中，没有颗粒污染（参见基本方案1，步骤3注释)。在12,000g,4下离心45分钟。3。小心地将上清液转移到超速离心管或瓶中（根据处理的液体体积,可参见表3.22。1中的管).在110,000g,4下离心2小时.4。将沉淀重悬于1ml PBS中，并将其在其中一个管中汇集。用PBS填充管以大量稀释再悬浮液.5。通过0。22m过滤器过滤悬浮液，并收集在新鲜的超速离心管或瓶中。6。在110，000g，4下离心70分钟。倒出上清液。7。将沉淀重悬于1ml PBS中,然后用PBS填充管。在110，000g，4下离心70分钟。倒出上清液。8。将沉淀重悬于50至200lPBS中。在80下储存长达1年。