DB22T3375-2022高血压用药指导基因检测 实时荧光定量PCR法.pdf

ICS 11.020 CCS C 05 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 33752022 高血压用药指导基因检测 实时荧光定量PCR 法 Real-time fluorescent quantitative PCR for the detection of hypertension medication guidelines genetic testing technical guidelines 2022-06-23 发布 2022-07-23 实施吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 33752022 I 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由吉林省卫生健康委员会提出并归口。本文件起草单位：吉林大学。本文件主要起草人：姜艳芳、胡馨元、郝思嘉、胡欣彤、何佳雪、刘勇、刘思文、张鹏、邹红雁、王多、肖云萍。DB22/T 33752022 1 高血压用药指导基因检测 实时荧光定量 PCR 法 1 范围 本文件规定了高血压用药基因检测原理、生物安全要求、材料与试剂、样本、检测、数据处理、质量控制、结果判定与表述、检测报告、废弃物处理与防止污染的措施。本文件适用于高血压用药基因检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 WS/T 230 临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用 卫医发200673号 医疗机构临床实验室管理办法 国务院令第588号 医疗废物管理条例 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 脱氧核糖核酸 deoxyribonucleic acid，DNA 核酸的一种，是由特殊序列的脱氧核糖核苷酸单元（dNTP）构成的多聚核苷酸，起携带遗传信息的功能。DNA为一种双链分子，通过核苷酸碱基对间的氢键维系。DNA包含的4种核苷酸包括：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（G）。人类存在两种类型的DNA：来自染色体的基因组DNA（gDNA）和线粒体DNA(mtDNA)。3.2 药物基因组学 pharmaeogenomies，PGx 药理学或基因组学的一个分支，是在遗传学、基因组学、遗传药物学基础上发展起来的，是研究基因组或基因变异对药物在人体内吸收、代谢、疗效及不良反应的影响，利用基因组学信息解答不同个体对同一药物反应上存在差异的原因的一门学科。3.3 聚合酶链式反应法 polymerase chain reaction，PCR 一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段.可看作生物体外的特殊DNA复制。3.4 实时荧光定量 PCR 法 quantitative Real-time PCR,qPCR DB22/T 33752022 2 在DNA扩增反应中加入荧光基团，以荧光信号累积实时检测每次PCR循环后产物总量，进而对待测样品中的目的序列进行定量分析的方法。3.5 基因 gene 遗传物质的最小功能单位，是指具有一定生物学意义的一段DNA。3.6 单核苷酸多态性 single nucleotide polymorphism，SNP 由单个核苷酸A、T、C或G的改变而引起的DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。3.7 阈值 threshold 计算机根据基线的变化所任意选择的，是指3到15个循环的基线荧光信号均值标准差的10倍。3.8 内标基因 endogenous reference gene 在反应体系中加入的一段在所有细胞类型都正常表达的基因，不受实验处理的影响，可以正常表达。3.9 Ct 值 cycle threshold，Ct 荧光定量PCR反应的荧光强度超过设定的阈值所需的循环数。Ct值位于PCR反应的指数期初期，与标本中待测核酸分子的原始拷贝数呈反比，即样本中原始拷贝数越多，荧光强度升高的就越多，相应的Ct值就越小。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。EDTA:四元羧酸乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)。PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)。SNP:单个核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism）5 原理 采用细胞裂解方法从外周血细胞中将基因组DNA提取出来后，针对人类CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE、CYP3A5、NPPA基因各个SNP位点的不同多态性，基于荧光定量PCR平台，首先针对SNP位点上下游设计特异性引物，分别针对野生型及突变型位点设计不同荧光基团标记的特异性探针，然后对引物及探针进行科学的配比组合，配置SNP位点检测体系，通过荧光定量PCR仪对临床样本DNA进行PCR扩增，同时收集扩增信号，如果信号为野生型探针信号，那么样本为纯合野生型；如果信号为突变型探针信号，那么样本为纯合突变型；如果信号同时有野生型及突变型探针信号，那么样本为杂合突变型。高血压相关基因参见附录A。6 生物安全要求 采样及检测过程所涉及的实验操作应按 GB 19489 规定执行。DB22/T 33752022 3 7 材料与试剂 7.1 仪器与耗材 7.1.1 II 级生物安全柜。7.1.2 涡旋混合仪。7.1.3 金属浴或水浴锅。7.1.4 高压灭菌器。7.1.5 微量移液器：10 L、100 L、200 L、1000 L。7.1.6 微量带滤芯吸头：10 L、100 L、200 L、1000 L。7.1.7 医用冰箱：2 8、-20、-80。7.1.8 低温高速离心机，最高离心力达 15 000 g/min 以上。7.1.9 低速离心机，最高离心力达 3 000 g/min 以上。7.1.10 荧光定量 PCR 仪。7.1.11 离心管：200 L、1.5 mL、15 mL。7.2 试剂 7.2.1 试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合 GB/T 6682 规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。7.2.2 DNA 提取试剂：对样本进行 DNA 提取。7.2.3 DNA 扩增试剂。7.2.4 对照品：弱阳性对照是一段基因型为 AGTR1 1166 A、AGTR1 1166 C、ACE I、ACE D、ADRB1 1165 G、ADRB1 1165C、CYP2D6*10C、CYP2D6*10T、CYP2C9*3A、CYP2C9*3C、CYP3A5*3A、CYP3A5*3G、NPPA 2338T 和 NPPA 2338C 的质粒混合液。空白对照是 Tris-HCL 缓冲液。7.2.5 质控品：阴性质控样本可以是无相关基因的同类样本和不含任何核酸的水样本。阳性样本可以为已确认的 CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE、CYP3A5、NPPA 基因分型样本或体外构建的已含 CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE、CYP3A5、NPPA 基因分型的质粒。8 样本 8.1 采集 采血前核对病人姓名、性别、年龄、编号及检验项目等。使用含有EDTA抗凝剂的真空采血管采集受检者静脉全血样本2 mL，采集后将采血管颠倒混匀数次，保证抗凝效果，并在抗凝管外部标签纸上详细登记好血样信息，包括住院号或门诊号、姓名、性别、采样日期和时间、样本类型等。样本接收记录表参见附录B。8.2 保存运输 8.2.1 抗凝全血在室温保存不超过 7 天，2 8 不超过 1 个月，-20 不超过 7 周，血液样品反复冻融不超过 5 次。8.2.2 在 2 8 条件下运输。8.3 接收拒收 8.3.1 样本接收 DB22/T 33752022 4 实验室应安排专人接收样本，接收人在接收样本时应进行仔细检查。首先确认送检样本的相关信息是否完全，样本标识清楚。到达时需要确认样本使用符合要求的的容器进行采集，有无开盖，全血样本量是否达到2 mL，样本接收时送样人和接收人在样本接收登记表见附录B，实行双签名制度。8.3.2 拒收样本 主要包括以下情况对于不符合要求的样本应该拒收，并在样本接收登记表中予以登记。a)申请单信息填写不完整，不清楚，与样本标识不符；b)样本采集容器不符合要求，送检过程中容器有破损或者开盖情况；c)全血样本量少于 2 mL，血液样本出现凝血或溶血。8.4 检测 8.4.1 样本 DNA 提取 参考血液基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作，所提取DNA需测定浓度及纯度，要求DNA的A260/280在1.82.0之间，-20 以下保存，避免反复冻融。待测样本的基因组DNA推荐浓度为5 ng/L15 ng/L。8.4.2 样本 DNA 扩增 8.4.2.1 试剂准备 8.4.2.1.1 从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温，各组分充分融解混匀。8.4.2.1.2 核算当次实验所需要的反应数 n，按照试剂盒说明装量将每种反应液分别分装到 n 个反应管内。8.4.2.1.3 PCR 反应管转移至样本准备区。8.4.2.2 加样 8.4.2.2.1 将待测样本的基因组 DNA、弱阳性对照、空白对照、质控品分别加入已装有 PCR 反应液的反应管中，即每个待测样本分别用此 PCR 反应液进行检测。8.4.2.2.2 盖好 PCR 反应管盖，记录样本加样情况。8.4.2.2.3 将 PCR 反应管瞬时离心，转移到核酸扩增区进行上机检测。若 PCR 反应管内加入模板后遇临时情况不能立即上机，建议将加好模板的 PCR 反应管放于 2 8 条件暂时保存，并在 24 小时内尽快上机检测。8.4.2.3 PCR 扩增 8.4.2.3.1 开机，并进行仪器性能自检；8.4.2.3.2 取样本准备区准备好的 PCR 反应管，放置在仪器样品槽相应位置。并记录放置顺序。设置仪器扩增相关参数，并开始进行 PCR 扩增，参数见表 1。DB22/T 33752022 5 表1 仪器扩增相关参数 9 数据处理 实验结束后，机器判断阈值，判断受检者基因型。10 质量控制 10.1 质控品对照 检测到已知确认基因型。10.2 弱阳性对照 按照说明书Ct值判断，扩增曲线有明显指数增长期；10.3 空白对照 相应通道无扩增曲线，或者扩增曲线为直线或轻微斜线；10.4 内标基因 内标相应通道按照说明书Ct值判断，有明显扩增曲线，说明血液DNA提取完整，PCR扩增过程良好。11 结果判定与表述 AGTR1 1166A-通道采集荧光信号 AGTR1(1166AC)反应液 AGTR1 1166C-通道采集荧光信号 ACE I-通道采集荧光信号 ACE（I/D）反应液 ACE D-通道采集荧光信号 ADRB1 1165G-通道采集荧光信号 ADRB1（1165GC）反应液 ADRB1 1165C-通道采集荧光信号 CYP2D6*1-通道采集荧光信号 CYP2D6*10 反应液 CYP2D6*10-通道采集荧光信号 CYP2C9*1-通道采集荧光信号 CYP2C9*3 反应液 CYP2C9*3-通道采集荧光信号 CYP3A5*1-通道采集荧光信号 CYP3A5*3 CYP3A5*3-通道采集荧光信号 NPPA 2338T 通道采集荧光信号 信号采集 NPPA 2338TC 反应液 NPPA 2338C 通道采集荧光信号 DB22/T 33752022 6 11.1 质控品对照、弱阳性对照、空白对照、内标基因满足 10 质量控制 11.2 样本：检测样本的反应管中，若通道有信号，内标通道信号较低或无信号，此为样本基因组 DNA加入过量，建议将样本稀释至合适浓度后进行检测。结果判读见表 2。表2 结果判定 反应液 基因多态性 说明书相应通道 A/A 参照说明书 Ct 值 A/C 参照说明书 Ct 值 AGTR1(1166AC)C/C 参照说明书 Ct 值 I/I 参照说明书 Ct 值 I/D 参照说明书 Ct 值 ACE(I/D)D/D 参照说明书 Ct 值 G/G 参照说明书 Ct 值 G/C 参照说明书 Ct 值 ADRB1(1165GC)C/C 参照说明书 Ct 值 C/C 参照说明书 Ct 值 C/T 参照说明书 Ct 值 CYP2D6*10 T/T 参照说明书 Ct 值 A/A 参照说明书 Ct 值 A/C 参照说明书 Ct 值 CYP2C9*3 C/C 参照说明书 Ct 值 A/A 参照说明书 Ct 值 A/G 参照说明书 Ct 值 CYP3A5*3 G/G 参照说明书 Ct 值 T/T 参照说明书 Ct 值 T/C 参照说明书 Ct 值 NPPA(2238 TC)C/C 参照说明书 Ct 值 DB22/T 33752022 7 12 检测报告 检测报告包括以下信息：患者信息、送检样本信息、接收时间、检测项目、检测结果等应由具备临床医学检验技术资质的医务人员审核并签发，报告模板参见附录C。13 废弃物处理和防止污染的措施 13.1 废弃物的处理应按医疗废物管理条例执行。13.2 污染的预防和控制措施应按 WS/T 230 中执行。DB22/T 33752022 8 A A 附 录 A（资料性）高血压用药相关基因 A.1 CYP2D6 基因 CYP2D6 基因是编码酶的细胞色素 P450 家族重要基因之一，CYP2D6是CYP酶家族重要基因，在人22号染色体上，参与了20%30%药物的代谢。该基因在人群中具有高度多态性；不同的CYP2D6等位基因位点导致代谢表型不同，导致代谢酶底物的能力不同。A.2 ACYP2C9 基因 CYP2C9基因是编码细胞色素 P450 家族重要基因之一，占肝微粒体P450蛋白总量的20%。目前约有16%的的临床药物由CYP2C9负责代谢。这种酶可以代谢许多外源性物质，包括苯妥英、甲苯磺丁脲、布洛芬和 S-华法林，氯沙坦等药物。A.3 AGTR1 基因 AGTR1基因位于人染色体3q2125，该基因编码1型受体，该受体被认为介导血管紧张素II的主要心血管作用。该基因可能在恢复缺血或梗塞心肌的血流后产生再灌注心律失常中起作用。A.4 ACE 基因 ACE基因编码血管紧张素转化酶，位于人染色体17q23.3，并在血管张力的调节和血管平滑肌细胞的增生中起重要作用。该基因编码一种参与血压调节和电解质平衡的酶，催化血管紧张素I转化为生理活性肽血管紧张素II。血管紧张素II是一种有效的血管加压剂和醛固酮刺激肽，可控制血压和液体电解质平衡。因此，编码的酶会增加血压，并且是 ACE 抑制剂的药物靶点，ACE 抑制剂通常用于降低血压。A.5 NPPA 基因 NPPA基因主要位于人1号染色体上，可编码心房利钠肽前体。该基因编码的蛋白质属于利钠肽家族。利钠肽与细胞外液体积和电解质稳态的控制有关,该基因的突变与家族性6型心房颤动有关。A.6 CYP3A5 基因 CYP3A5基因是编码细胞色素 P450 家族重要基因之一。CYP3A5基因位于人体第7号常染色体上，是CYP3A亚家族中的一种。CYP3A5*3位点对硝苯地平有显著影响。A.7 ADRB1 基因 DB22/T 33752022 9 ADRB1基因位于人染色体10q24-q26，编码1肾上腺素能受体。肾上腺素能受体是一个典型的鸟嘌呤核苷酸结合调节蛋白偶联受体家族，介导了激素肾上腺素和神经递质去甲肾上腺素的生理效应。-1肾上腺素受体主要位于心脏。该基因的特定多态性已被证明会影响静息心率，并可能与心力衰竭有关。DB22/T 33752022 10 B B 附 录 B（资料性）样本接收记录表 样本接收记录表见表B.1。表B.1 样本接收记录表 序号 姓名 性别 开 单 科室 住院号/门诊号 检 测项目条码号 接 收日期 样本类型样 本 状态 门 诊 接收人 实验室接收人检测者?男?女?正 常?_?男?女?正 常?_?男?女?正 常?_?男?女?正 常?_?男?女?正 常?_?男?女?正 常?_?男?女?正 常?_?男?女?正 常?_?男?女?正 常?_?男?女?正 常?_?男?女?正 常?_?男?女?正 常?_?男?女?正 常?_?男?女?正 常?_?男?女?正 常?_?男?女?正 常?_?男?女?正 常?_?男?女?正 常?_ DB22/T 33752022 11 C C 附 录 C（资料性）报告模板 报告模板见表C.1 表 C.1 高血压用药基因检测报告单高血压用药基因检测报告单 姓名：性别：年龄：样本类型：诊断：科室：住院号：送检医生：病区：床号：条码号：样本号：目标药物 检测基因 检测亚型 检测结果 *1/*1（CC）*1/*10（CT）CYP2D6*10/*10（TT）1165G/G 1165G/C 受体阻断药 ADRB1(1165GC)1165C/C 阴性 阴性 阳性 +阴性 阳性 +阴性 1166 A/A 1166 A/C AGTR1(1166AC)1166 C/C *1/*1(AA)*1/*3(AC)血管紧张素 II受体阻滞剂 CYP2C9*3/*3(CC)阳性 +阴性 阴性 阳性 +阴性 阴性 I/I I/D 血管紧张素转化酶抑制剂 ACE D/D 阴性 阳性 +阴性 *1/*1(AA)*1/*3(AG)钙离子拮抗剂 CYP3A5*3/*3(GG)阴性 阳性 +阴性 T/T T/C 利尿剂 NPPA C/C 阳性 +阴性 阴性 采样时间：检测者：接收时间：报告时间：审核者：_