DB15T 2727-2022牛冠状病毒腹泻诊断技术规范.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 27272022 牛冠状病毒腹泻诊断技术规范 Technical specification for diagnosis of bovine coronavirus diarrhea 2022-07-29 发布 2022-08-29 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、金宇保灵生物药品有限公司、通辽市农业技术推广中心。本文件主要起草人：徐晓静、谢梦圆、王建龙、常继涛、马立峰、郭宇、黄海碧、陈坚、刘景龙。牛冠状病毒腹泻诊断技术规范 1 范围 本文件规定了牛冠状病毒腹泻的临床诊断和实验室诊断技术方法、操作程序和判定标准。本文件适用于奶牛饲养场（户）、肉牛饲养场（户）和动物诊疗单位对牛冠状病毒腹泻的检测、诊断和检疫等。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。BCoV：牛冠状病毒（Bovine coronavirus）CPE：致细胞病变效应（Cytopathic Effect）DMEM：最低营养需要培养基（DuLbeccos Modified Eagle Medium）FBS：胎牛血清（Fetal Bovine Serum HRT-18 细胞：人直肠肿瘤 18 细胞（Human Rectal tumor-18 cell）PBS：磷酸盐缓冲盐水（Phosphate Buffer Saline）PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）TCID50：半数组织培养物感染量（Median Tissue Culture Infective Dose）5 生物安全措施 样品处理的生物安全措施符合GB 19489的规定。样品采集的生物安全措施符合GB/T 27401的规定。6 病原 牛冠状病毒属冠状病毒科，乙型冠状病毒属，病毒颗粒为球状，直径通常在80 nm120 nm，具有囊膜和棒状纤突，核衣壳螺旋状对称。基因组为单股正链RNA。7 临床诊断 流行病学 7.1.1 易感动物 7日龄的犊牛易感，其他日龄犊牛及成年牛也可感染。7.1.2 传染源 病牛是本病自然流行的主要传染源，犊牛一旦感染，可排出大量病毒粒子。7.1.3 传播途径 经消化道、呼吸道及接触传播。7.1.4 流行特点 冬春季节多发，腹泻通常在同一牛场连续发生。临床症状 犊牛感染后发生腹泻，发病初期出现带血的黄色黏性粪便，后期发展为水泻，有时出现脱水、虚弱、体温低，少数犊牛出现发热、卧地不起等症状，严重的犊牛会出现昏迷甚至死亡。成年牛常突然暴发，排出深褐色带血稀粪，伴有产奶下降、沉郁及厌食等症状。病理变化 小肠肠壁变薄、透明，肠腔液体增多，严重者引起腹腔积水，胃内有未消化的凝乳块。感染的牛可能伴随呼吸道症状，表现为气管黏膜充血、局限性肺炎等。结果判定 符合6.1、6.2、6.3，可判定为牛冠状病毒腹泻疑似病例。8 实验室诊断 主要仪器设备 电镜、低温高速离心机、倒置显微镜、T25细胞培养瓶、CO2细胞培养箱、96孔细胞培养板、PCR仪、PCR管、电泳仪、凝胶成像仪、酶标仪。主要试剂 PBS、2%磷钨酸、DMEM培养基、细胞培养液、细胞维持液、胰酶、HRT-18细胞、PCR Taq酶、DNA Marker、TAE电泳缓冲液。主要试剂配制见附录A。样品采集与处理 8.3.1 粪便样品 将棉拭子伸入肛门内刮取新鲜粪便，也可无菌采集地上刚排出的新鲜粪便。分别放入装有 3 mL PBS的采样管中，编号并记录相关信息。漩涡振荡器充分振荡，12000 r/min 4 离心5 min8 min，取上清编号备用。8.3.2 组织样品 取病死牛小肠及内容物等，置于无菌密封袋或采样杯内。称取1 g样品置于研钵，充分研磨后加5 mL PBS混匀，8000 r/min 4 离心5 min，取上清编号备用。8.3.3 血液样品 一次性采血管采集血液2 mL4 mL，犊牛采用颈静脉采血，成年牛采用尾静脉采血。室温静置30 min，3000 r/min4000 r/min 离心5 min10 min。分离血清编号备用。样品运输与保存 采集的样品应低温运送，尽量12 h内运送至实验室。采集或处理后的样品在2 8 保存，一般不超过24 h，若长期保存，应置于-70 以下条件保存。病原学检测 8.5.1 电镜检查 将采集的粪便或肠内容物用PBS制成1:4 悬液，于盛有玻璃珠的管内充分震荡30 min，取悬液 3000 r/min 离心30 min，取上清，15000 r/min 离心30 min，取上清，以40000 r/min50000 r/min 离心4 h5 h，弃上清，加12滴蒸馏水悬浮，滴加铜网，2%磷钨酸染色，电镜下观察病毒粒子形态。8.5.2 病毒分离鉴定 8.5.2.1 单层细胞制备 HRT-18 细胞可用于牛冠状病毒分离培养。用胰酶消化细胞，加入至少等体积的细胞培养液终止，吹打混匀，使其分散浓度为12106个/毫升，分装到T25细胞培养瓶，置于5%CO2 培养箱中37 培养24 h48 h。随时观察细胞生长情况，待细胞长成单层备用。8.5.2.2 接种细胞 将处理后的样品用细胞维持液制成1:5悬液，漩涡振荡器混匀，3000 r/min 4 离心10 min，用0.22 m 滤膜过滤后取上清，添加浓度为20 g/mL30 g/mL胰酶，37 水浴激活1 h。每份样品接种 3 瓶细胞，设置正常细胞对照组。接种前，先弃去细胞培养瓶中液体，按细胞维持液终体积的10%加入处理好的样品，37 吸附1 h，期间每隔20 min摇晃一次，吸附完成后补加含15 g/mL25 g/mL 胰酶的细胞维持液。对照组不接种样品，弃去培养液后加入等量细胞维持液。均置于5%CO2 培养箱中37 静置培养。8.5.2.3 观察和记录 每天观察细胞状态并记录，连续观察4 d5 d。如对照组细胞单层完好，细胞生长正常，接种样品的细胞出现CPE，且80%以上细胞出现时，置-70 以下冻存。若接种的细胞无CPE出现，反复冻融3次，进行盲传。8.5.2.4 盲传 将第1代无 CPE 的细胞培养物冻融3次后混合，8000 r/min 4 离心5 min，取上清继续接种细胞，进行观察、记录、收毒，盲传第2代。此过程中培养物仍无CPE则按同样的方法盲传57代，若出现CPE，达到80%以上时收毒，置-70 以下冻存。8.5.2.5 中和试验 8.5.2.5.1 单层细胞制备 将细胞浓度制备为12106个/毫升，于96孔板培养，每孔100 L，加细胞培养液补齐至1毫升/孔，置于5%CO2 培养箱37 培养24 h。8.5.2.5.2 固定血清-稀释病毒法 用DMEM培养基将病毒液进行梯度稀释（10-110-8）；将不同稀释梯度的病毒液和已灭活的血清等体积混合，37 水浴感作1 h；取混合液200 L分别加至已长成单层细胞的96孔细胞培养板，每个稀释梯度接种4孔；同时设对照非免疫血清（对照组）和正常细胞各4孔。于5%CO2 培养箱37 培养，计算每组的TCID50和中和指数。8.5.3 PCR 检测 8.5.3.1 总 RNA 提取 将采集的样品或细胞培养物进行处理，按RNA提取试剂盒方法提取核酸。在-20 条件下可短时间保存，若需长期保存，应置于-70 以下条件，避免反复冻融。8.5.3.2 引物合成 根据BCoV N基因设计引物。采用常继涛等人文章“载牛冠状病毒N蛋白壳聚糖微球的免疫效果评价”中BcoV引物序列：BCoV-N-F：GCAATCCAGTAGTAGAGCGT；BCoV-N-R：CTTAGTGGCATCCTTGCCAA。8.5.3.3 反应体系 按25 L反应体系配制。一步法：模板2 L，上、下游引物各1 L，One step Taq 酶12.5 L，RNase-Free H2O 8.5 L。两步法：按反转录试剂盒反转为 cDNA；模板2 L，上、下游引物各1 L，Taq 酶12.5 L，RNase-Free H2O 8.5 L。8.5.3.4 反应参数 一步法：50 30 min；95 15 min；94 1 min，55 30 s，72 1 min，35个循环；72 10 min。两步法：95 15 min；94 1 min，55 30 s，72 1 min，35个循环；72 10 min。8.5.3.5 电泳检测 制备琼脂糖凝胶，取5 L8 L PCR扩增产物加入上样孔，同时加入阳性和阴性对照以及DNA Marker，于1TAE电泳缓冲液中进行电泳，凝胶成像仪观察结果。8.5.3.6 测序分析 PCR扩增产物经胶回收纯化后测序，于NCBI中Blast分析是否为BCoV N基因。8.5.4 ELISA 检测 待检粪便样品按牛冠状病毒抗原诊断 ELISA 试剂盒操作方法进行样品检测。8.5.5 结果判定 8.5.5.1 电镜检查结果 可看到直径为80 nm120 nm的病毒颗粒，外周突起排列成“皇冠”状，即判定样品为BcoV阳性。8.5.5.2 中和试验结果 当正常对照组孔内细胞单层生长良好，证明试验成立；可根据 Reed-Muench 法计算中和指数（见附录B），待检血清的中和指数 大于50(Log 1.7)，即可判定为阳性；1049(Log=11.6)为可疑；小于10(Log 1)为阴性。8.5.5.3 PCR 检测结果 阳性对照、PCR 产物与预期片段大小一致（460 bp），同时阴性对照无条带；即判定为阳性。测序分析 Blast 比对为 BCoV N 基因，即判定为阳性。8.5.5.4 ELISA 检测结果 按ELISA试剂盒结果进行判定，样品结果符合阳性标准即判定为阳性。血清学检测 采用中和试验（固定病毒-稀释血清法）进行血清学检测。8.6.1 检测时间 发病初期和发病后2周各检测1次。8.6.2 血清稀释 于1.5 mL离心管中加入 DMEM 培养基，每管100 L；取56，30 min 灭活的血清100 L 加入管内，从第一个管开始做10倍连续稀释，从最后一管内弃去100 L液体。8.6.3 感作 每个不同稀释度的血清内均加入100 L BCoV 病毒液，充分混匀，37水浴感作 1 h。8.6.4 接种 取200 L感作后的液体分别加至已长成单层细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释梯度接种4孔；同时设血清毒性对照（细胞内加最低稀释度的血清）、1:10 稀释的BcoV阳性血清对照、1:5 稀释的阴性血清对照和正常细胞对照各4孔及BCoV病毒液回归对照10010-3 的4个稀释度，每个稀释度各4孔。8.6.5 观察和记录 将细胞板置于5%CO2 培养箱37 培养，连续观察5 d7 d，观察并记录各孔CPE。8.6.6 结果判定 当正常对照组孔内细胞单层生长良好，阳性血清呈现预期的中和效价，阴性血清没有中和效价，证明试验成立。记录血清各稀释度的4个孔中出现CPE 的孔数，按照Reed-Muench法（见附录 B）分别计算血清中和BCoV的抗体效价，抗体效价大于1:5 时，中和试验结果为阳性。发病初期和发病后2周中和试验结果均为阳性，且发病后2周抗体效价达发病初期的4倍，即判定为牛冠状病毒感染。9 综合判定 疑似 符合6.1、6.2、6.3，可判定为牛冠状病毒腹泻疑似病例。确诊 符合6.1、6.2、6.3，同时病原学检测中任一检测（电镜检查、病毒分离鉴定、PCR 检测、ELISA 检测）结果为阳性可确诊牛冠状病毒腹泻。符合6.1、6.2、6.3，同时符合7.6.6，可确诊牛冠状病毒腹泻。A A 附录A （规范性）试剂配制 A.1 PBS 缓冲液 NaCl 8 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.24 g 蒸馏水定容至 800 mL，HCl调其pH至7.4左右，加蒸馏水定容至1000 mL，121 15 min 高压灭菌。A.2 细胞培养液 DMEM 培养基 44.5 mL FBS 5 mL 青链霉素(10000 U/mL)500 L 混合均匀后，4 密封保存，建议现配现用。A.3 细胞维持液 DMEM 培养基 44.5 mL 胰酶 0.25 g/mL 青链霉素(10000 U/mL)500 L 混合均匀后，4 密封保存，建议现配现用。A.4 50TAE 电泳缓冲液 三羟甲基氨基甲烷（Tris）242 g EDTA-2Na 37.2 g 冰乙酸 57.1 mL 去离子水 942.9 mL Tris 和 EDTA-2Na 溶于800 mL 去离子水，搅拌均匀；加入冰乙酸，充分溶解；用1 moL/L NaOH 调pH值至8.3，灭菌去离子水定容至1000 mL 后，室温保存。使用时稀释50倍即为1TAE电泳缓冲液。B B 附录B （规范性）中和试验结果计算方法 B.1 固定血清-稀释病毒法 在固定量的血清中，加入等量但不同稀释度的病毒，用对照组和待检血清同时进行测定，计算每一组的 TCID50，然后计算中和指数。中和指数=待检血清组 TCID50/对照组 TCID50 待检血清的中和指数 大于50(Log 1.7)，即可判定为阳性；1049(Log=11.6)为可疑；小于10(Log 1)为阴性。B.2 固定病毒-稀释血清法 中和抗体效价以半数保护数（PD50）的反对数表示，PD50 计算方法如下:PD50 等于或低于50%CPE 百分数的血清稀释度的对数加上距离比例与稀释系数的对数的乘积。其中，距离比例按 Reed-Muench 法计算，以50%减去低于50%的CPE百分数的差作为分子，高于50%的CPE 百分数减去低于50%的 CPE 百分数作为分母，求分子与分母的比值即为距离比例。即：距离比例=(高于50%的百分数-50%)/(高于50%的百分数-低于50%的百分数)求 PD50 的反对数，结果以1:的格式表示，即为相应样品的中和抗体效价。