DB35T+1553-2016水仙大褐斑病检疫鉴定方法-(高清版）.pdf

ICS 65.020.01 B16 DB35 福建省地方标准 DB35/T 15532016 水仙大褐斑病检疫鉴定方法 Technical Standard for Detection and Identification of Stagonospora curtisii(Berk.)Sacc 2016-04-06 发布 2016-07-06 实施福建省质量技术监督局 发 布 DB35/T 15532016 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则给出的规则编写。本标准由福建出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国福州出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李敏、林星辉、沈建国、虞赟、陈艳、陈智明、于文涛。DB35/T 15532016 1 水仙大褐斑病检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了水仙大褐斑病检疫鉴定的病原菌信息、鉴定原理、仪器与试剂、现场检疫方法、检测方法和样品保存等。本标准适用于水仙、文殊兰、孤挺花等寄主植物中水仙大褐斑病的检疫和鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2589 植物病原真菌检测规范 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3 基本信息 中文名：水仙大褐斑病 英文名：Leaf scorch of narcissus 病原菌：水仙大褐斑病菌 Stagonospora curtisii(Berk.)Sacc 病原菌分类地位：水仙大褐斑病菌Stagonospora curtisii属于半知菌亚门(Deuteromycotina)，球壳孢目（Sphaeropsidales），球壳孢科（Sphaeropsidaceae），壳多隔孢属(Stagonospora)。其他信息参见附录A和附录B。4 原理 水仙大褐斑病的为害症状，病原菌的分离培养性状、形态特征观察、致病性测定等，作为该病检疫鉴定方法的主要依据。5 仪器设备和主要试剂 5.1 仪器设备 生物显微镜、体视显微镜（具测量功能）、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、培养箱、-20 冰箱、-80 冰箱。5.2 主要试剂 5.2.1 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合 GB/T 6682。5.2.2 1%次氯酸钠。DB35/T 15532016 2 5.2.3 75%乙醇。5.2.4 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯浸粉 5.0 g，葡萄糖 20.0 g，氯霉素 0.1 g，琼脂 13.0 g，蒸馏水定容至 1000 mL，调整 pH 值至 5.6，121 高压灭菌 20 min。6 现场检疫 按照SN/T 2589的要求，检查寄主植物的叶片、花瓣、鳞茎等部位是否出现疑似症状（参见附录A）。检查叶片尖端有无褐色病斑；叶片和花梗上有无褐色斑点，有无椭圆形、纺锤形、半圆形或不规则的病斑。对可疑植物和繁殖材料应取样送实验室做进一步检测，取样方法和步骤应符合SN/T 2122的要求。7 检测方法 7.1 症状检查 水仙大褐斑病主要为害叶片。发病初期在叶尖或叶片上部产生近椭圆形的黄褐色至褐色斑点，以后病斑伸长并可连接成不规则的褐色或红褐色的条斑，病斑周围失绿呈黄绿色，且与健康部分分界明显，后期病斑表面粗糙，略呈疮痂状，坏死组织上产生黑褐色小点，即为病菌的分生孢子器。植株受害后，病叶自叶尖向基部逐渐枯焦，甚至全株枯萎。该病亦可侵害花梗和鳞茎。在花梗上形成斑点，并扩展为褐色病斑；受害的鳞茎表现茎腐和溃疡。观察进境的寄主植物有无上述症状，疑似的叶片、花梗、鳞茎等进行显微镜检查和病原菌分离。7.2 分离培养 将新鲜病叶、花瓣、鳞片洗净，用75%酒精棉球擦洗病健交界处表面，用无菌剪剪成2 cm长片段，再剪成细小碎片，转入1%次氯酸钠3 min，在灭菌水中洗涤3次，灭菌滤纸将水份吸干，置于PDA培养基上。挑取表面消毒的病组织放入灭菌的离心管中，加少许无菌水，将其轻轻捣碎，使分生孢子器破裂释放出分生孢子，将离心管中捣碎的组织置于PDA培养基上，均匀涂布。将培养基置于28 温箱中12 h：12 h光暗交替培养，逐日检视，在菌落形成后，挑取边缘菌落于PDA培养基上纯化。7.3 形态学观察 在PDA上25 培养4 d的菌落直径为4.5 cm5.5 cm。培养一天的菌落呈淡灰色；培养两天的菌落呈暗绿色，边缘菌丝淡灰色；培养三天的菌落呈暗绿色，呈放射状，边缘菌丝淡褐色；培养四天的菌落呈暗绿色并逐渐变为黑褐色至黑色，绒毛状，边缘纤毛状，菌落上有同心环，略隆起，有光泽。可长出众多的初为蜡黄色，后略呈肉红色的颗粒状物，该颗粒状物为分生孢子器中涌出的孢子堆。经显微镜观察，分生孢子器为球形或扁球形，直径110 m275 m，病菌形态参见附录B；分生孢子无色，长椭球形或圆柱形（19 m27 m）（5.5 m7.5 m），含有油球。7.4 致病性测定 选取健康的感病品种的水仙，将疑似水仙大褐斑病菌的菌株用无菌水配制成每毫升107个分生孢子悬浮液，针刺接种叶片表皮，接种处用棉球保湿，放入植物培养箱培养，置于16 20 下生长、观察。接种6 d后，接种点附近出现类似水仙大褐斑的症状，对发病水仙再做病原菌分离。DB35/T 15532016 3 8 结果判定 若检测样品的病原分离物的形态特征符合7.3中描述，可报告检出水仙大褐斑病菌。需要时可做致病性测定实验。9 样品保存 9.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出水仙大褐斑病菌的样品应保存于4 冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。9.2 菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为水仙大褐斑病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于PDA培养基斜面上，20 25 培养5 d，然后4 冰箱保存，或将菌丝块转入20%灭菌甘油并混匀，-80 长期保存。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理(103.4 Kp,121.3,20 min)。9.3 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。DB35/T 15532016 4 A A 附 录 A（资料性附录）水仙大褐斑病危害症状 水仙大褐斑病菌初次侵染发生在水仙叶尖，褐色焦枯。再次侵染发生于叶和花梗的中部和边缘。褐色椭圆形，纺锤形或半圆形的病斑，周围黄色。严重时叶形扭曲，直到叶片全部死亡，提前28 d56 d枯死。水仙大褐斑病在水仙上危害症状见图A.1。水仙大褐斑病在孤挺花上危害症状见图A.2。a)b)c)d)图 A.1 水仙大褐斑病在水仙上危害状 DB35/T 15532016 5 a)b)图 A.2 水仙大褐斑病在孤挺花上危害状 DB35/T 15532016 6 B B 附 录 B（资料性附录）水仙大褐斑病菌形态及地理分布信息 B.1 水仙大褐斑病菌形态 水仙大褐斑病菌形态见图B.1。图B.1 水仙大褐斑病菌形态图 B.2 分布信息 水仙大褐斑病主要分布在英国、荷兰、法国、美国、加拿大、阿根廷、新西兰、日本、中国等地。_ DB35/T 15532016福建省地方标准水仙大褐斑病检疫鉴定方法DB35/T 15532016*2016 年 9 月第一版2016 年 9 月第一次印刷