微生物碳氮磷测定.doc

土壤微生物量碳氮磷测定方法
一、 试剂配制
微生物量碳试剂：
1 硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]：称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。最后定容至1L；（需大量配制）
2 生物量C氧化剂：1.2800g在130℃下烘干两个小时的K2Cr2O7与400mlH2O，2L的优级纯浓硫酸混合，配成2.4L的混合氧化剂溶液，在室温，棕色瓶中保存；
3 葡萄糖标准储备液（100mg/L）：准确称取0.2502g的无水葡萄糖溶于1000mL的容量瓶中，存放在4℃冰箱，使用时稀释为所需标准溶液；
微生物量氮试剂：
4 醋酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOH·H2O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50％的氢氧化钠溶液调节pH 至5.2；
5 茚三酮试剂：23g分析纯水合茚三酮溶解于750ml二甲基亚砜，加入250ml醋酸锂缓冲液，混合30min，使氧气和氮气排出；（注意此试剂在使用前一天配置，室温下密封保存）
6 氢氧化钠溶液（10mol/L）：400g分析纯氢氧化钠溶于去离子水，稀释至1L；
7 柠檬酸缓冲液：42.0g分析纯柠檬酸和16.0g氢氧化钠，溶于900ml去离子水，用10mol/L氢氧化钠调节Ph至5.0，再用水稀释至1L；
8 乙醇溶液：95%分析纯乙醇与去离子水按体积比1：1比例混合；
9 1mg/ml的硫酸铵标准储存液：称取4.7167g分析纯硫酸铵(称前105℃烘2h)溶于0.5moL/L硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000mL，摇匀，于4℃冰箱中保存。
10 0.1mg/ml的硫酸铵[(NH4)2SO4]标准液：吸取10mL1mol/L的硫酸铵标准储存液于100mL容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液定容至100mL．摇匀。此溶液最好现配现用。
11 工作曲线的制备：分别吸取0.00mL、0 .50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL 0.1mg/ml的硫酸铵标准液于1000mL容量瓶中,用0.5moL／L硫酸钾溶液定容至100mL，摇匀。然后取1.5ml，按照样液的步骤进行显色和比色。
微生物量磷试剂：
12 1mol L-1 HCl溶液：用8.33 mL的浓盐酸用蒸馏水定容至100 mL。
13 碳酸氢钠浸提液 [c（NaHCO3）= 0.5mol L-1，pH 8.5]：42.0g分析纯碳酸氢钠溶于800ml蒸馏水，用1mol L-1 NaOH溶液缓慢调节pH至8.5，再用蒸馏水定容至1L。注意该浸提液放置时期过长时，因CO2释放使溶液pH升高。
14 硫酸溶液[c（H2SO4）= 2.5mol L-1]：70.0ml分析纯浓硫酸（H2SO4，ρ= 1.89g ml-1），用蒸馏水稀释定容至500ml。
14 钼酸铵溶液（4%）：20.0g分析纯钼酸铵溶于蒸馏水，定容至500ml。
16 抗坏血酸溶液[c（C6H8O6）= 0.1mol L-1]：1.32g抗坏血酸溶于75ml蒸馏水。抗坏血酸溶液极易被氧化，应在使用时当天配制。如需保存可于75ml此溶液中加入25mg乙烯二胺四烷基醋酸二钠和0.5ml蚁酸使其稳定。
17 酒石酸锑钾溶液[ρ（Sb）= 1mg ml-1]：0.2743g分析纯酒石酸锑钾溶于蒸馏水，定容至100ml。
18 混合显色液：取上述125ml硫酸溶液与37.5ml钼酸铵溶液混合，再加入75ml抗坏血酸溶液和12.5ml酒石酸锑钾溶液，混匀。此溶液保存时间不宜超过24h。
19 标准磷酸二氢钾溶液[ρ（KH2PO4）= 4µg P ml-1]：0.1757g分析纯磷酸二氢钾（称量前先经105℃烘2～3h），溶于少量蒸馏水，再加入少量硫酸，用蒸馏水定容至1L，即为40µg P ml-1磷贮存液，置4℃下保存。取50ml贮存液稀释至500ml，即得到浓度为4µg P ml-1磷溶液，此溶液不宜久存。

二、样液制作
1 土壤灭菌
（1）土壤混合均匀后过2mm筛，除去根、秸秆、石头等杂质，烘干法测定土壤样品含水量，以及土壤田间饱和持水量（一般是土壤质量的30%）；
（2）调节土壤含水量到田间饱和持水量的80%（水稻土适当冷冻干燥）左右。一般调节土壤含水量到25%；
（3）每个样品称取相当于10克干土的土壤样品于100毫升塑料瓶中 。（或称10克样品后根据含水量换算）；
（4）塑料瓶盖上盖（注意盖上要钻孔以防止微波炉加热样品时爆炸），放入微波炉加热；
（5）加热量：每1克土800焦耳热量。即为：每1克土应在功率为800W的微波炉加热1秒。每个样品10克土，则为10秒。若有10个样品（100克土），加热100秒。依次类推，注意样品不能太多。微波炉1层较适宜；
（6）在加热时间到一半时，从微波炉中拿出样品来均匀搅拌后再继续加热，杀灭效果更好。
2 浸提
微生物量碳氮：
将灭菌和未灭菌的两批土样每瓶加入40ml 0.5M K2SO4溶液（土水比为1:4），盖紧瓶塞，振荡30分钟（25℃），用慢速定量滤纸过滤到150ml大三角瓶中，应立即测定。如不立即测定，用保鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在-20℃的冰箱。同时做不加土壤的空白对照。
微生物量磷：
将灭菌与不灭菌土壤完全无损地转入250ml塑料浸提瓶中，加入200ml 0.5mol L-1 NaHCO3浸提液（土水比为1 : 20，w : v），充分振荡浸提30min，用慢速定量滤纸过滤。如果滤液浑浊，应使用双层滤纸，或先离心再过滤。浸提液应立即测定或在–18℃下保存。做不加土壤的空白对照。

三、 分析测定
1 微生物量碳测定
（1）吸取土壤灭菌浸提液1.6ml于50ml锥形瓶中，再加入2.4ml的生物量C氧化剂，摇匀；（2）将锥形瓶放置在140℃的消煮炉上维持30min（待温度达到140℃后开始计时），冷却后用1cm石英比色皿在350nm波长下进行比色，读取吸光值A。同时测定不灭菌土壤浸提液，3次重复；
（3）工作曲线：用葡萄糖储备液分别稀释成含碳量为0，10，20，30，40和50mgC·L-1的标准溶液，然后分别吸取1.6ml加入硬质玻璃管中，在加入2.4ml的生物量C氧化剂后，摇匀与样品一起在消煮炉中进行消煮，在350nm条件下进行比色。以A值为纵坐标，碳的浓度为横坐标绘制工作曲线，根据样品A值查得测定溶液中碳的浓度。

2 微生物氮测定
（1）取1.5ml浸提液和标准曲线溶液于40ml硬质试管中，加入3.5ml柠檬酸缓冲液，使浸提液中的硫酸钙和硫酸钾彻底溶解，再缓慢加入2.5ml茚三酮试剂，彻底混匀；
（2）将试管置于沸水浴中加热25min（放入试管2min后水浴应再次沸腾），使加入试剂时产生的沉淀彻底溶解；
（3）待溶液冷却至室温，加入9.0ml乙醇溶液，混匀，于570nm波长下比色。

3 微生物量磷测定
（1） 取适量的浸提液（1.5～5ml）于20ml比色管中，加入适量的1mol L-1 HCl溶液进行中和，HCl溶液的加入量通常为浸提液体积的1/2；
（2） 放置4h并间隙摇动以排除CO2。补充蒸馏水至约10ml，加入4ml混合显色液，再加蒸馏水定容，完全显色后在882nm波长处比色。
（3） 工作曲线：分别取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml 4µg P ml-1标准磷溶液于20 ml比色管中，加入与样液等量的NaHCO3浸提剂，同上进行显色和比色，得到浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8µg P ml-1标准磷工作曲线。

四、 结果计算
1 微生物生物量碳的计算
ω(C)=Ec/KEc
式中：ω(C)——微生物生物量碳（Bc）质量分数，mg·kg-1；
Ec——灭菌土样有机碳与未灭菌土样有机碳之差，mg·kg-1；
KEc——氯仿灭菌杀死的微生物体中的碳（C）被浸提出来的比例，一般取0.33

2 微生物生物量氮的计算
BN=m*Emin-N
式中，Emin-N为灭菌和未灭菌土壤的差值（通过标准曲线查得样品中硫酸铵含量，mg）；m为转换系数，取值为5.0。

3 微生物量磷的计算
BP = EPi /kP
式中：EPi = 灭菌土壤浸提的Pi –不灭菌土壤浸提的Pi
kP为所浸提并测定出来的微生物生物量磷占土壤微生物生物量磷的比例，亦即浸提效率，也称转换系数，取值0.4。