电泳知识总结.doc

1. 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生定向迁移（与其本身所带电荷相反的电极移动)的现象。利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术。2.生物大分子在电场中移动的速度由什么决定?答:样品性质方面：粒子大小，形状，带电荷多少，带电性质；电泳条件方面：介质阻力，电场强度，溶液黏度。3.粒子的移动速度（泳动速度V）与电场强度(E）、粒子所带电荷量（Q)成正比，而与粒子半径（r)及溶液粘度()成反比。非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关.4. 迁移率与下列（ D )因素无关？A。电荷数量 B。粒子大小 C。溶液黏度 D.电场强度电泳迁移率（/泳动度/淌度）m：带电颗粒在单位电场强度下的移动速度。m = V/E = Q/6r 【影响迁移率的因素：1. 待分离大分子的性质 ：所带的电荷、分子大小和形状，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形,则其电泳迁移速度越快；2。 缓冲液pH和离子强度：pH值距pI愈远,Q越大，V越大 ;pH过高或过低蛋白变性缓冲液;缓冲液通常要保持一定的离子强度；离子强度过低或过高的不利影响；3。 电场强度：E高，带电颗粒泳动快。过高，产生焦耳热，样品和Buffer扩散增加，条带增宽；蛋白变性.过低，电泳时间增加,扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置；4。 电渗 :在 电场中液体对固体支持物的相对移动;当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时,会减慢颗粒泳动速度；5. 支持介质：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大；介质的纯度影响聚焦效果；介质的非特异性吸附会增大电渗。】5. 等电点的定义？蛋白质在等电点时有哪些特点？ 答:当溶液的pH为一定数值时，其中的蛋白质正负电荷相等,即净电荷为零，此时的pH值就是该蛋白质等电点pI。蛋白质在等电点时的溶解度最小。6.下列不是区带电泳的是（ C ）A.纸电泳 B.醋酸纤维素薄膜电泳 C. 等电聚焦电泳 D.聚丙烯酰胺凝胶电泳7. 等电聚焦与等速电泳的差别?答：区带窄，分辨率高。自由界面电泳：部分分离 8. 电渗现象:外加电场作用下，与固体支持物接触的液体层发生移动的现象。电渗流：电渗现象中液体的整体流动。是毛细管电泳分离的主要驱动力，是毛细管中的溶剂因轴向直流电场作用发生的定向流动。其大小直接影响分析结果的精确度,准确度。9.（凝胶电泳）为什么要用支持介质？支持介质应具备哪些特性?答：抗对流；抗扩散。物理化学性质稳定;化学惰性不干扰大分子的电泳过程；均匀,电内渗小,结果重复性好.10. 两大类支持介质薄膜类和凝胶类的特点？答：薄膜类化学惰性好,能将对流减到最小；分离主要原理：生物大分子的电荷密度.凝胶类高粘度和摩擦阻力对流和扩散都小;具有分子筛作用。分离主要原理：电荷密度+分子大小。11. 在聚丙烯酰胺凝胶方法中，引发剂和加速剂的作用？答：引发剂：提供原始自由基，通过自由基传递，使Acr成为自由基，启动聚合反应。加速剂：加快引发剂释放自由基的速度。Bis是交联剂.12. 决定PAG特性的主要因素：单体和交联剂的总浓度；单体和交联剂的比例。凝胶总浓度一定时，Bis的含量影响凝胶孔径.PAG的分子筛效应取决于凝胶孔径与样品分子大小接近的程度.选择合适的凝胶浓度,完成不同的分离任务。a:b100 凝胶呈糊状;a:b30 凝胶富有弹性，且完全透明；a2%和b0.5 凝胶不可能聚合。什么是分子筛效应?分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大,移动慢.醋酸纤维素薄膜电泳的特点是什么？分离速度快、电泳时间短、样品用量少。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测.简述聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及应用范围。特点:具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小（1g100g）、分辨率高等。应用范围：可用于蛋白质、核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和定量分析。还可结合去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS），以测定蛋白质亚基的相对分子质量。13.聚丙烯酰胺凝胶电泳有什么优点？（1）可以在天然状态分离生物大分子；（2）可分析蛋白质和别的生物大分子的混合物;（3）电泳分离后仍然保持生物活性。14.琼脂糖凝胶的特点：（1)属于大孔胶。可以分析107的大分子，其电泳分辨率低于PAGE的。琼脂糖浓度决定形成凝胶后的孔径。（2）物理化学性质稳定,吸附小，分辨率高，重复性好；（3)机械强度较高；(4)琼脂糖无毒，热可逆，制备简单;（5)利于样品回收；(6）琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，染色、脱色程序简单快速。15简述电泳的基本操作。一，安装膜具；装封胶条，注意封胶条平面朝下，不能有裂口；盖上凹玻璃；将凹玻璃冲外装进槽里；将楔子插进，将底部插紧.二，配制凝胶溶液三，灌胶，加到顶部，来回倾斜去气泡四,样品制备。五，加样:通过电极缓冲液,小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。六,电泳七，剥胶：电泳结束后,取下凝胶模，卸下胶框，用凝胶铲小心撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记。八，染色与脱色16。电泳技术的优点:快速、准确、重现性好。(1）电泳性质高度特异性；(2）电泳方法温和性。17. 常见的不正常电泳现象有：涂抹痕迹;条纹拖尾;条带变浅;前段指示剂缺失；条带仅在凝胶顶部;混杂因素等.等电聚焦电泳：18.IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。 等电聚焦就是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。19.IEFE的特点？答：优点：1。分辨率高（精密度可达0。01pH单位）, 灵敏度高（最低检出量达0.1ng）。2.电泳区带相当狭窄.3。重复性好。缺点：1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀.2。样品中的成分必须停留在其pI,不适用在pI不溶或发生变性的蛋白质。20. 进行IEFE必须具备3个条件：有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的pH梯度有一个抗对流的电泳材料,使已经分离的样品不再重新混合电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带在电泳介质中放入载体两性电解质,当通入直流电时,两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH区。21. 理想的载体两性电解质应具备的特征：分子量要小，以便与被分离大分子物质分离;化学性质稳定;各成分的pI彼此接近,并在其pI值附近有良好的缓冲能力;在pI处具有足够的电导，导电性均匀；两性电解质载体的数目要足够多;可溶性好；对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定。简述等电聚焦电泳的限制条件。答：（1）要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀； (2)样品中的成分必须停留在其pI,不适用在pI不溶或发生变性的蛋白质。列举几个等电聚焦电泳的应用.答:（1）分析分离制备蛋白质、多肽：区分人血清蛋白;测出异常免疫球蛋白；基因分型 （2)测定pI可鉴定蛋白质、多肽； （3）双相电泳中，IEFE作为第一相。理想的载体两性电解质应具备的特征有？答：（1）分子量要小,以便与被分离大分子物质分离； (2）化学性质稳定； （3）各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的缓冲能力； （4）在pI处具有足够的电导，导电性均匀; (5）两性电解质载体的数目要足够多； （6)可溶性好； （7)对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定.SDSPAGE22. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠)。它是根据SDS和还原剂将蛋白质分子解聚后亚基的大小,在恒定pH（碱性)缓冲系统的分离。主要用于测定蛋白质亚基分子量。23. SDS电泳的迁移速率主要取决于分子大小，为什么？SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷.因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物.这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了.从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用 。24. SDS的其他作用包括：阴离子去污剂:作为变性剂和助溶性试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂：断裂二硫键。25.样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度十分重要，影响它们结合的因素主要有三个：溶液中SDS单体的浓度： SDS在水溶液中是以单体和SDS-多肽胶束的混合形式存在的,能与蛋白质结合的是单体。单体的浓度与SDS总浓度，温度和离子强度有关。为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3。样品缓冲液的离子强度： 因为SDS结合到蛋白质分子上的量仅决定于平衡时SDS的单体浓度，不是总浓度,而只是在低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度.所以SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，常为10100mmol/L。二硫键是否完全被还原 ：只有二硫键被彻底还原后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量的结合到亚基上而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系.样品缓冲液中的巯基乙醇的浓度通常为4%-5%，二硫苏糖醇的浓度通常为2-3%。前者有挥发性，所以最好在配置样品前加入.26. 配制凝胶过程中的注意事项： 凝胶配制过程要迅速, 加速剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。 * 水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡 胶凝好的标志:胶与水层之间形成清晰的界面 梳子需一次平稳插入，梳口处不得有气泡,梳底需水平 *剥胶时要小心，保持胶完好无损,染色要充分27。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲系统的选择和凝胶浓度的选择应注意什么？缓冲系统的选择：在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用凝胶浓度的选择：不同分子质量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度28.提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺.蛋白溶液中SDS过量会引起什么变化？答：(1)蛋白质本身电荷被屏蔽； （2）氢键断裂； （3）疏水作用被取消; （4）多肽折叠被破坏.试列举几个影响蛋白质恢复活性的因素。答：（1）SDS的纯度； (2）蛋白酶； （3）二硫键; （4）蛋白的结构； （5)辅助因子和辅酶.为什么带出现拖尾现象？ 答：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法:加样前离心；选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。阴离子染料的三个缺点是什么？答：(1)溶液系统中的甲醇会引起NC膜皱缩或破坏; （2）不能用于带正电荷的膜，如尼龙膜,会使膜本身染色; （3）灵敏度较低。净电荷：29.蛋白质的电泳行为:蛋白质的净电荷是组成它的氨基酸残基的侧链基团上所有正、负电荷的总和。等电点是蛋白质的物理化学常数，与其组成有关;pH=pI ,蛋白质的净电荷是零。30.电泳槽与凝胶中缓冲液的成分、pH值和离子强度均不相同。使得不连续电泳过程中有三种物理效应：样品的浓缩效应；凝胶的分子筛效应；一般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。 31。不连续体系对蛋白的分离作用- 样品的浓缩效应 A. 凝胶孔径不连续性 B. 缓冲体系离子成分的不连续性 C. pH值的不连续性 D。电位梯度的不连续性高效毛细管电泳分析法HPCE：32。与普通电泳相比，毛细管电泳有什么优点？答：使用细内径毛细管,抑制了对流和减小热扩散；分析速度快；分离效率很高;可使用在线检测法；进量少。33。.毛细管电泳有什么缺点?答：制备能力差,光学检测器的光路太短，非高灵敏度的检测器难以测出样品峰；凝胶、色谱填充管需专门的灌制设备；大的侧面/截面积比能”放大吸附作用，导致蛋白质等的分离效率下降或不出峰，同时也会影响分离的重现性。34.高效毛细管电泳有什么特点？答:仪器简单,易自动化；分析速度快，分离效率高；操作方便，消耗少；应用范围极广。35。HPCE中电渗流的流动为平流还是塞流？答：塞流。36。HPCE中影响电渗流的因素是什么?答：1）电场强度的影响；2）毛细管材料的影响;3)电解质溶液性质的影响；4)温度的影响；5）添加剂的影响37.改变电渗流方向的方法？答：（1）毛细管改性表面键合阳离子基团； (2)加电渗流反转剂，内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。38。电內渗的利弊是什么? 答：（1）利：对流电泳中增加阳离子大分子的分辨率。 （2）弊：高电内渗时阻碍大分子的迁移，耗时长。39.HPCE中电渗流的作用是什么？答：（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离; (2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速; （3）电渗流的微小变化影响结果的重现性.40。HPCE中影响电渗流的因素有哪些？答：(1）电场强度的影响，电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时,电渗流速度正比于工作电压。 （2）毛细管材料的影响，不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同. （3）电解质溶液性质的影响：（1）溶液pH的影响；(2）阴离子的影响。 （4）温度的影响毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热。 (5）添加剂的影响。41. 简述毛细管电泳基本工作原理：溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力，沿毛细管通道，以不同速度向与其所带电荷相反的电极方向迁移，并依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离。42.高效毛细管电泳分析在技术上采取了哪两项重要改进？一是采用了0。05mm内径的毛细管； 二是采用了高达数千伏的电压。蛋白质印迹43。叙述什么是蛋白质印迹，且简述其优势。答:（1）定义:把电泳或色谱分离的蛋白质转移到固定基质上，再对其进行进一步分析的方法。 （2）优势： 一旦转移到固定基质上，Pr比在凝胶中容易接近探针，且几乎所有被转移的Pr 都有相同的机会接触探针; 转移到固定基质上的Pr带在探测过程中不会因扩散而失去分辨率； Pr转移到膜上后能进行多种分析,能得到多份结果； 印迹法只需很少试剂（ng级）,处理时间相对短，固定化膜容易操作和保存。 蛋白质印迹法是高分辨电泳和灵敏、专一的免疫探测技术的结合！ 蛋白质印迹法中分析蛋白质时使用的探针： 用针对蛋白质特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针； 通常使用抗体做探针； 抗体与附着于固定基质上的靶蛋白发生特异性反应免疫印迹； 免疫印迹实现了高灵敏和特异性的结合。44。什么是电泳印记？答：生物大分子物质（如核酸或蛋白质）印迹到固相载体上经封阻试剂处理后，可与相应的探针反应接着用适当的溶液漂洗，置含底物的溶液中培育，即可显出谱带。如所用探针是放射性同位素标记物时，则应将漂洗后的载体进行放射自显影，即可检测出样品中特异的成分。45.蛋白质印迹的应用有哪些？分析和制备特异成分；检测生命大分子物质之间的相互作用；可作为诊断某些疾病的工具46。蛋白质印迹蛋白质转移条件的选择：离子强度：导电性；低离子强度.pH:合适的pH值使Pr远离其pI而带负电荷.稳定性：好，耐受高电场强度，易于转移。蛋白质双向电泳47.影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括哪些方面？1、待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析;2、电泳的目的;3、待研究蛋白的丰度；4、样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白,需要反复实验才能完成，如果将待测样品被富集以后则更易分析；5、IPG胶条的PH范围。48.蛋白质双向电泳中核酸对电泳有何影响，为了消除影响如何去除呢？对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。解决方法:用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA)同核酸结合形成复合物的能力,再通过超速离心来去除复合物。试49。双向电泳分析中的样品制备其制备原则是什么？答：1、应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白）,且制备方法应具有可重现性.2、防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。3、防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰(如酶性或化学性降解等）。4、完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。5、尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而保证待研究蛋白的可检测性.