病原菌分离培养总结.doc

病原菌的分离培养方法一、 基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其他菌生长的环境,从而得到纯菌株.植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化,纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。二 病原真菌的分离培养（花生褐斑病为例）1. 分离的准备工作(1)分离材料准备:花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色,淡黄色晕圈。背面有许多黑色小点，呈同心轮纹状排列.（2）培养基的准备： PDA培养基，加热熔化，紫外灭菌后倒板；（3)分离工作仪器与用品:超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针）、70酒精、01升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。（升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心）。2. 组织分离法（1） 工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70酒精擦拭双手;在使用无菌操作间时，呼吸要轻,不要说话。（2） 酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境；（3） 取花生褐斑病的症状典型病叶(或其他分离材料），选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘（病健交界处）切取小块病组织数块。（选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离.）（4） 表面消毒：用菌培养皿一次准备流程（75%酒精-0.1升汞无菌水无菌水无菌水），将病组织放人70%酒精中浸3-5s后，按无菌操作法将病组织移人01%升汞液中分别表面消毒1 min左右（如植物组织柔嫩,则表面消毒时间宜短；反之则可长些）,然后放入灭菌水中连续漂洗三次,除去残留的消毒剂。（5） 用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放35块。（在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染）。（6） 将培养皿倒置放人25 左右恒温箱内培养。一般34d后观察待分离菌生长结果；若病组织小块上均长出较为一致的菌落,则多半为要分离的病原菌。（7） 除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，并且根据保湿培养的结果进一步确定；（8） 在无菌条件下，用打孔菌落边缘挑取小块移入培养基上，在25左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得该分离病菌纯菌种，便可保存。三 病原细菌的分离培养（萝卜黑腐病为例)1。分离的准备工作（1）分离材料准备：萝卜黑腐病俗称黑心、烂心,该病是由细菌引起的病害。主要危害叶和根.幼苗期发病子叶呈水浸状，根髓变黑腐烂。叶片发病，叶缘多处产生黄色斑,后变”V”字形向内发展,叶脉变黑呈网纹状，逐渐整叶变黄干枯。病菌沿叶脉和维管束向短缩茎和根部发展，最后使全株叶片变黄枯死。萝卜肉质根受浸染后，透过日光可看到暗灰色病变；横切萝卜可看到维管束呈放射线状、黑褐色;重者呈干缩空洞,维管束溢出菌脓，这一点与缺硼引起的生理性变黑不同.(2)培养基的准备：PDA,后划线纯化NB;（3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、70酒精、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等.2.黑腐病菌分离(1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻,不要说话。（2）酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境;（3）取萝卜黑腐病块茎，用75 酒精进行表面消毒；用灭菌解剖刀切去表面，并向内切取病组织，切成长条小块（2mm*3mm），用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放35块。（在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染）。（4)将培养皿倒置放人28 左右恒温箱内培养。一般34d后观察待分离菌生长结果；若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌.(5）根据菌落的一致性初步确定长出的菌落，选择长出的三种菌落(黄、红、生防），分别在无菌条件下在NB培养基进行划线；在28左右恒温箱内培养，数经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致,并与典型描述的特征相一致时,即表明已获得纯培养；最好要经过连续三次单菌落的分离,才能确保纯化。（6）观察到的菌落特征：萝卜黑腐病菌，圆形,同心环状，内环呈金黄色，外围白色菌脓,湿润，随环隆起、凹陷,半透明，边缘不整齐.四资料查询其他分离培养方法1.病原真菌稀释分离法（1）取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。(2）用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入0510ml。（3）用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。（4)将熔化开冷却到4550C的培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入1-2滴25%乳酸），摇匀,凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，而成为起伏不平的表面，不利于分离。为大体估计培养基温度,可将盛培养基的器皿靠在人手背上，如果手背感到烫但尚可以忍耐，则大体为4550C.（5)将培养皿翻转后置恒温箱（25）中培养,数日后观察菌落生长情况。（6）挑菌。将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，置25左右培养。待菌长出后，检查菌是否单纯，若有其他菌混杂,就要再一次进行分离纯化，直到获得纯株培养。2。病原细菌病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。在进行分离之前，首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断,即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离工作。稀释分离法是最经典的标准分离法，方法同上述真菌分离。除去上述稀释分离法以外，较为方便的是划线分离法:（1)预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒在培养皿中,凝成平板后,翻转放在30C恒温箱中24h,使表面无水滴凝结。也可凝成平板后直接使用。(2）将病组织先用01%升汞表面消毒05-2min，再用无菌水换洗3次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡2060min，让细菌释放到灭菌水中.（3)用灭菌的接种铒(接种环)蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线，尽量不要把平板表面划破。划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线.灭菌后再划第三次线。提示:划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要，这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大。（4）用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后,翻转培养皿，放在2628C恒温箱中培养.13d后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中的优势单菌落应为待分离菌形成的。（5）仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上。同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离，经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时,即表明已获得纯培养。最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。五 常用的几种典型的病原菌分离方法 1斑点病原菌的分离。从病斑部分切取每边3-5mm的小块组织，在70酒精中浸数秒钟后，移人01%的升汞水溶液中处理35rain，以灭菌水冲洗3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。2维管束组织内病原菌的分离。从根茎维管束组织分离病菌,可先将寄主病部表面用70酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后，用灭菌水冲洗几次,移置培养基面上.3根腐病病原菌的分离。根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。4肉质组织中病原菌的分离。多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织,切取小块病组织分离。如有杂菌感染可采用“直接接种法，待出现症状后，用此法再行分离。5种子内病原菌分离。将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉），用灭菌水洗涤后，移置培养基上。6孢子分离法。能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。7土壤带菌分离法。为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形,从有病的土壤中分离它们是必要的。分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。