DB45_T 1673-2018荸荠茎尖组织培养技术规程.pdf

ICS 65.020.99 B 30/39 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T 16732018 荸荠茎尖组织培养技术规程 Technical specification for tissue culture seedling of Chinese water chestnut 2018-03-25 发布 2018-04-25 实施广西壮族自治区质量技术监督局 发 布 DB45/T 16732018 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 引用规范性文件.1 3 术语和定义.1 4 设施设备及常用化学试剂.1 5 设施、设备及用具的清洁与消毒.1 6 培养室环境条件控制.2 7 工艺流程及操作要求.2 8 合格组培苗形态指标.3 9 生产管理规章制度.3 附录 A（资料性附录）MS 培养基成分及母液配制.4 附录 B（资料性附录）培养基植物生长调节剂的常用浓度及配制方法.5 DB45/T 16732018 II DB45/T 16732018 III 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区农业科学院提出并归口。本标准起草单位：广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所、广西标准化协会。本标准主要起草人：陈丽娟、江文、高美萍、董伟清、蔡炳华、颜梅新、何芳练、蒋慧萍、张尚文、欧昆鹏、王艳、黄诗宇、韦绍龙、闭志强、罗松、谢宏昭、桂杰、韦泽昭、苏宾。DB45/T 16732018 1 荸荠茎尖组织培养生产技术规程 1 范围 本标准规定了荸荠（Elocharis tuberose Schulut）茎尖组织培养的术语和定义、设备设施及常用化学试剂、设施、设备及用具的清洁与消毒、培养室环境条件控制、工艺流程及操作要求、合格组培苗形态指标、生产管理规章制度等技术要求。本标准适用于广西境内荸荠茎尖组培苗生产。2 引用规范性文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 23062013 花卉种苗组培快繁技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 荸荠 荸荠又称马蹄。莎草科荸荠属浅水性宿根草本植物。3.2 荸荠茎尖组织培养 以荸荠球茎主芽茎尖或侧芽茎尖作为外植体，在人工控制的条件下，放在含有营养物质和植物生长物质等组成的培养基中，使它得以继续生长、分化形成完整植株的过程。4 设施设备及常用化学试剂 参照NY/T 23062013中的第4章执行。5 设施、设备及用具的清洁与消毒 参照NY/T 23062013中的第6章、8.1、8.4、8.5、8.6、8.7和11.5执行。DB45/T 16732018 2 6 培养室环境条件控制 6.1 温度 2530。6.2 湿度 保持相对湿度3040。6.3 光照 接种后，先培养室全暗培养5 d7 d，然后转入光培养，光照强度1 000lx2 000lx，10 h/d12 h/d。7 工艺流程及操作要求 7.1 工艺流程 培养基母液配制与保存培养基配制材料选择与消毒接种初代培养(单芽)继代培养（丛芽）生根材料选择与培养炼苗(淘汰不合格苗)。7.2 操作要求 7.2.1 培养基母液配制与保存 MS基本培养基成分及母液配制见附录A。植物生长调节剂的配制方法参见附录B。配制好的母液可放入4 的冰箱中保存待用。具体操作参照NY/T 23062013中的7.3。7.2.2 培养基配制 5060热水+卡拉胶+量取母液+糖加水定容搅匀调整pH分装封口灭菌凝固。具体操作参照NY/T 23062013中的7.4。7.2.3 材料选择与消毒 选用种质纯正、遗传性状稳定的品种。取无病虫危害球茎，用清水漂洗干净，凉干表面水，用70酒精擦拭表面，切取健壮的顶芽和侧芽，置于无菌瓶内，然后在超净台上，用70酒精浸泡2 min，无菌水冲洗2次后，再用0.1升汞浸泡10 min15 min,再用无菌水冲洗35次。7.2.4 接种 在无菌虑纸（或铝片）上切取含12个节(0.1 cm0.2 cm)的芽尖放入备好的MS培养基。7.2.5 初代培养(单芽)在(262)条件下培养15d后，选择生长势强的材料转接到MS+6-BA 1 mg2.5 mg/L+NAA 0.01 mg0.1 mg/L培养基上进行初代培养，诱导丛生芽。同时取材送病毒检测，淘汰带毒株系。7.2.6 继代培养（丛芽）将检测合格的丛生芽分切成带有23个芽点的小块放入备好的MS继代培养基上培养。一个继代周期25 d30 d。在培养过程中，控制增殖系数在3.05.0范围，继代次数10周期。DB45/T 16732018 3 7.2.7 生根材料选择与培养 在继代材料中选择叶色正常、生长健壮的材料，接种于袋装MS+PP333 0.1 mg/L0.35 mg/L+NAA 0.5 mg/L1 mg/L生根培养基上,然后放置在温度(282)的光照培养室内培养7 d10 d，待根系萌动,苗高5 cm8 cm时，即可移到炼苗棚培养。7.2.8 炼苗(淘汰不合格苗)在常温（1540）自然散射光较强的大棚炼苗25 d35 d，使叶状茎转粗变绿、根系粗壮、株高7 cm，即可成为商品组培苗。淘汰生长异常（畸形、白化、,缺绿、叶状茎细弱等）的不合格苗。8 合格组培苗形态指标 无污染，植株形态正常，且符合表1指标要求。表1 荸荠组培苗形态指标 指标名称 指标值 株高(cm)7 叶状茎粗（mm）0.5 单株叶状茎数 3 白根数(条)2 植株叶色 浅绿色浓绿 9 生产管理规章制度 9.1 生产管理制度 制定完善的规章制度和操作规程，并有效执行。9.2 生产记录及档案建立 生产记录及档案建立内容包括有：母液配制及培养基配制记录、培养基高压蒸汽灭菌工作记录、员工接种工作记录、组培材料继代和生根入出库记录、品种材料生产档案和产品销售记录。DB45/T 16732018 4 A A 附 录 A（资料性附录）MS 培养基成分及母液配制 MS培养基成分及母液配制见表A.1。表A.1 MS 培养基成分及母液配制表 母液编号 成分种类 化合物名称 规定用量（mg/L）扩大倍数 称取量（mg）母液体积（mL）配制 1 L 培养基吸取母液量（mL）母液 1 大量元素 NH4NO3 KNO3 MgSO47H2O KH2PO4 CaCl22H2O 1 650 1 900 370 170 440 10 10 10 10 10 16 500 19 000 3 700 1 700 4 400 1 000 100 母液 2 微量元素 MnSO44H2O ZnSO47H2O H3BO3 KI NaMoO42H2O CuSO45H2O CoCl26H2O 22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 100 100 100 100 100 100 100 2 230 860 620 83 25 2.5 2.5 1 000 10 母液 3 螯合铁 Na2-EDTA FeSO47H2O 37.3 27.8 100 100 3 730 2 780 1 000 10 母液 4 有机质 甘氨酸 VB1 烟酸 VB6 肌醇 2.0 0.1 0.5 0.5 100 50 50 50 50 50 100 5 25 25 5 000 500 10 蔗糖 20 000 mg/L30 000 mg/L 固化物 3 500 mg/L5 000 mg/L 琼脂或卡拉胶 pH 5.86.2 水 母液用蒸馏水或重蒸水，培养基可用去离子水或自来水。B DB45/T 16732018 5 附 录 B（资料性附录）培养基植物生长调节剂的常用浓度及配制方法 培养基植物生长调节剂的常用浓度及配制方法见表B.1。表B.1 培养基植物生长调节剂的常用浓度及配制方法 类别 种类 常用浓度(mol)配制方法 细胞分裂素 6BA 13 用适量 0.1M 盐酸（HCl）溶解，然后加蒸馏水定容。KT 0.52.5 生长素 IAA 0.011.0 用适量0.1 M盐酸（HCl）或0.1 M氢氧化钠(NaOH)溶解，然后加蒸馏水定容。NAA 0.011.0 植物延缓剂 PP333 0.10.35 用少量纯酒精溶解，然后加蒸馏水定容。中华人民共和国广西地方标准 荸荠茎尖组织培养技术规程 DB45/T 16732018 广西壮族自治区质量技术监督局统一印刷 版权专有 侵权必究