(高清正版）DB43_T 1968-2020穗状狐尾藻生长抑制试验操作技术规程.pdf

湖南省地方标准DB43湖南省市场监督管理局发 布DB43/T 1 682020 92020-12-29发布2021-03-29实施穗状狐尾藻生长抑制试验操作规程Guideline for L.Growth Inhibition TestMyriophyllum VerticillatumICS 65.020CCS B 16 目 次 前言 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 3.1 扦插 1 3.2 预培养 1 3.3 植物长 1 3.4 植物鲜重 1 3.5 植物干重 1 4 试验条件 2 4.1 温度 2 4.2 光照 2 4.3 曝气 2 4.4 暴露方式 2 4.5 试验周期 2 5 材料准备 2 5.1 沉积物的制备 2 5.2 培养基的制备 2 5.3 生物试材的预培养 2 6 试验仪器设备 3 7 试验方法 3 7.1 试验准备 3 7.2 预试验 3 7.3 正试验 3 7.4 限度试验 3 7.5 参比试验 3 8 观察记录 3 9 浓度检测 4 10 数据处理 4 11 质量保证与质量控制 5 附录 A（资料性）SMART and BARKO 培养基配制方法 6 附录 B（资料性）预培养土培法“沉积物-狐尾藻”系统图 7 附录 C（资料性）试验“沉积物-狐尾藻”系统图 8 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020 给出的规则起草。本文件某些内容可能涉及专利。本文件发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由湖南省农业农村厅提出。本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：湖南省植物保护研究所,长沙艾格里生物科技有限公司。本文件主要起草人：刘勇、陈昂、张德咏、张战泓、蒋桂芳、罗杰、熊浩、陈武瑛、罗香文。穗状狐尾藻生长抑制试验操作规程 1 范围 本文件规定了穗状狐尾藻（Myriophyllum Verticillatum L.）生长抑制试验的试验条件、材料的准备、操作方法、观察记录、数据处理、质量保证与质量控制等。本文件适用于湖南省穗状狐尾藻生长抑制试验的试验操作。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 扦插 Cuttage 扦插也称插条，是一种培育植物的常用繁殖方法。可以剪取某些植物的茎、叶、根、芽等，插入土中、沙中，或浸泡在水中，等到生根后就可栽种，使之成为独立的新植株。3.2 预培养 Pre-Culture 在与试验系统相同的环境下进行预备试验，目的是使试验植株能够提前适应试验环境，提高植株的成活率，从而保证试验的质量。3.3 植物长 Plant Length 是指将穗花狐尾藻从花盆完整取出，包括水面上植物和沉积物中植物根系部分，将植物垂直从上到下的长度。3.4 植物鲜重 Plant Fresh Weight 轻轻的将狐尾藻从烧杯中取出，包括根部，洗去泥沙。如果有断裂的根部在泥土中，将断裂的根部一同取出，并洗净。将植物放在吸水纸上吸干植物的多余水分，然后称重。3.5 植物干重 Plant Dry Weight 轻轻的将穗状狐尾藻从烧杯中取出，包括根部，洗去泥沙。如果有断裂的根部在泥土中，将断裂的根部一同取出，并洗净。放在烘箱中，60 烘干至恒重，然后测干重。4 试验条件 4.1 温度 2025。4.2 光照 采用 LED 灯光照。每天光照时间 16 h。光照强度约 800010000 Lux。4.3 曝气 试验开始前，每个容器内增氧曝气 12 h。试验期间，试验容器内不能曝气。4.4 暴露方式 静态法。4.5 试验周期 14 天。5 材料准备 5.1 沉积物的制备 应准备两种人工土，无营养盐人工土和加入营养盐的人工土（表 2）。为了狐尾藻根部可以吸收到营养盐，保证植物正常生长。含营养盐的人工土需要加入 300 mg/kg 的 Na3PO412H2O 和 150 mg/kg 的NH4Cl。详细配制方法见附录 A 的表 A1、表 A2。5.2 培养基的制备 试验选用 SMART and BARKO 培养基，应在试验开始前配制好足够用量的培养基，确保配制用水不含氯，用水水质应符合 NY5051 的规定。SMART and BARKO 培养基配制方法参见附录 A 的 A.3。5.3 生物试材的预培养 5.3.1 预培养（水培）试验前 14 天，从保种藻中剪取新枝条，均长约 5 cm，在配有 SMART and BARKO 培养基中进行预培养 7 天。5.3.2 预培养（土培）试验前 7 天，从 SMART and BARKO 培养基中选取藻枝条，剪取没有异种侵染，长势良好，没有侧枝的主枝条进行试验前的预培养。5.3.3 沉积物预培养（土培系统的制备）于大玻璃缸中底部加入 4 cm 已配制好的有营养的沉积物，再铺上 1 cm 无营养的沉积物，最后铺上一层约 35 cm 厚的石英砂，以防加入培养基时使沉积物移位。再加缓慢加入约 25 cm 高的 SMART and BARKO 培养基。最后将水培好的藻枝条插入沉积物中进行预培养，7 天的后用于试验。参见图附录 B 的B.1。6 试验仪器设备 游标卡尺、培养架、照度计、pH 计、溶解氧仪、EC 测定仪、2 L 烧杯、量筒、容量瓶、剪刀、移液器、色谱分析仪、质谱分析仪等。7 操作方法 7.1 试验准备 7.1.1 狐尾藻枝条的剪切 于预培养系统中挑取长约 8 cm 的枝条用于试验。7.1.2 试验沉积物系统的制备 2L 玻璃烧杯。底部加入 350 g 已配制好的有营养的沉积物，再铺上 200 g 无营养的沉积物，最后铺上一层约 35 cm 厚的石英砂，以防加入培养基时使沉积物移位。再加缓慢加入约 1.5 L SMART and BARKO 培养基。一天后将 9.1.1 中剪切好的枝条扦插在 OECD 沉积物上。参见图附录 C 的 C.1。7.2 预试验 按正试验的要求以较大间距设置 45 个浓度处理组，求出供试物使试验用藻生长受抑制的最低浓度和不受抑制的最高浓度，在此范围内设置正式试验，试验对照组设置 5 个重复，试验处理组设置 3个重复，每重复扦插一根新枝。7.3 正试验 在预试验确定的浓度范围内以一定比例间距（几何级差控制在 3.2 倍以内）设置 57 个浓度组，并设置一个空白对照组，使用助溶剂的还应增设溶剂对照组，对照组设置 10 个重复，试验处理组设置10 个重复，每重复扦插一根新枝。7.4 限度试验 设置上限浓度为 100 mg a.i./L，即在供试物达到 100 mg a.i./L 时，未对藻产生影响。对照组10 个重复，试验处理组 10 个重复，每重复扦插一根新枝。7.5 参比试验 为检验实验室的设备、条件、方法及供试生物的质量是否合乎要求，设置参比物质作方法学上的可靠性检验。推荐使用 3,5-二氯苯酚作为参比物质对穗状狐尾藻生长抑制试验进行检测，EC50范围在 4.7 mg/L 至 6.1 mg/L。8 观察记录 8.1 在试验第 0 天，随机选取 15 棵试验所用狐尾藻，测定并记录其植物鲜重和植物干重。8.2 在试验第 0、7、14 天，详细记录试验各处理每颗狐尾藻的植物根长、总茎长（包括侧枝长度）、植物总长。8.3 在试验第 0、7、14 天，记录 pH 值、水温、光照强度、溶解氧。8.4 在试验第 14 天，测定并记录试验各处理组狐尾藻的鲜重和干重。8.5 在试验第 0、7、14 天，观察主茎的发育状况，是否有畸形，是否发黄、萎蔫；细菌滋生或藻类污染；生长状态异常，如发育不良、节间距变化、茎/叶扭曲、侧枝增殖、叶组织受损、松弛现象、茎节片断化等。根的状态（试验结束时），观察与对照组组相比，是否出现下列情况：无根；少根；生长情况一般；生长状况良好，与对照组相似。9 浓度检测 在试验第 0、7、14 天，采集试验溶液样本进行真实浓度检测。10 数据处理 10.1 评估参数 植物根长的总增长率，植物根长的总生物量；总茎长的总增长率，总茎长的总生物量；植物总长的总增长率，植物总长的总生物量；植株鲜重增长率，鲜重生物量；干重增长率，干重总生物量。10.2 统计分析 所有数据运用适当的统计软件如 SAS、SPSS、DPS 进行方差分析。确定供试物对供试生物的 LOEC和 NOEC 值。选取处理组和对照组中穗状狐尾藻的茎、根、整株植物的长度、鲜重和干重分别作为计算平均比生长率抑制百分率和生物量增长量抑制百分率的响应变量。10.2.1 平均比生长率抑制百分率 穗状狐尾藻平均比生长率的抑制百分率（Ir），其计算按式（1）：100%ctcIr（1）式中：Ir 植物平均比生长率抑制百分率（）；c空白对照组植物生长速率平均值；t处理组植物生长速率平均值。生长速率是指植株长度、鲜重和干重的对数随时间的变化。处理组和对照组中的每一个重复计算得出一个生长速率值，每个处理组和对照组得到一个平均植株生长速率值和方差值，计算公式按式（2）：tNNijj-ilnln（2）式中：i-j从试验开始时间 i 到结束时间 j 的平均比生长率；Ni 在时间 i 时处理组或对照组的测量变量；Nj 在时间 j 时处理组或对照组的测量变量；t 从 i 到 j 的时间。10.2.2 生物量增长量抑制百分率 平均生物量增长量抑制百分率（Iy）的计算按式（3）：100%bcbtbcIy（3）式中：Iy 平均生物量增长量抑制百分率（）；bc对照组最终生物量与初始生物量之差；bt处理组最终生物量与初始生物量之差。11 质量保证与质量控制 11.1 用于试验的新枝条长度规格应尽量一致，不能超过 20误差。11.2 供试新枝条必须没有其他异种的侵染，如绿藻等。11.3 试验过程中空白对照组的 pH 变化不能超过 1.5 个单位。试验区域光照强度偏差不能超过 15。附 录 A（资料性）SMART and BARKO 培养基配制方法 表 A.1 人工土的配方 成分 试剂用量 备注 泥炭藓 4-5 pH 尽量接近 5.5-6.0；泥炭是粉末状的，粒径1 mm，干燥的。高岭土 20 高岭石含量最好超过 30。石英砂 75-76 50以上细沙粒径在 50 um 和 200 um 之间。(0.0 5mm-0.2 mm)湿度 20-30 加入去离子水，湿度控制在 20-30。pH 70.5 加入 CaCO3调 pH。表 A.2 沉积物配比 OECD 沉积物 泥炭藓（kg）高岭土（kg）石英砂（kg）去离子水（kg）总重（kg）含营养物 6*5=0.3 6*20=1.2 6*75=4.5 1 L 含(Na3PO4 1.8 g；NH4Cl 0.9 g)6 不含营养物 3*5=0.15 3*20=0.6 3*75=2.25 0.5 L 3 注：1）计算的土壤含水率为 14。（不是最终的含水率）2）将 Na3PO4和 NH4Cl 溶于去离子水，用配制好的溶液与土混匀。A3 SMART and BARKO 培养基的配制 表 A.3 SMART and BARKO 培养基配制表 化学成分 浓度(mg/L)CaCl2*2H2O 91.7 MgSO4*7H2O 69 NaHCO3 58.4 KHCO3 15.4 pH 7.5-8 附 录 B（资料性）预培养土培法“沉积物-狐尾藻”系统图 图 B.1 预培养土培法“沉积物-狐尾藻”系统图 附 录 C（资料性）试验“沉积物-狐尾藻”系统图 图 C.1 试验“沉积物-狐尾藻”系统图