DB22_T 3440-2023人粪便中华支睾吸虫虫卵检测 PCR和实时荧光PCR法.pdf

ICS 07.00.01 CCS C 62 22 吉林省地方标准 DB 22/T 34402023 人粪便中华支睾吸虫虫卵检测 PCR 和实时荧光 PCR 法 Detection of Clonorchis sinensis eggs in human feces-PCR and real time PCR methods 2023-01-13 发布 2023-03-01 实施 吉林省市场监督管理厅 发 布 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 试剂、材料和引物.1 试剂.1 材料.2 引物.2 6 仪器和设备.2 7 样品采集.3 8 核酸提取.3 9 DNA 的浓度和纯度测定.3 10 PCR 检测.4 普通 PCR 检测.4 实时荧光 PCR 检测.5 附录A （资料性）试剂配制.6 附录B （规范性）华支睾吸虫虫卵特定的 DNA 序列.7 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由长春海关提出并归口。本文件起草单位：吉林国际旅行卫生保健中心（长春海关口岸门诊部）、长春海关技术中心。本文件主要起草人：马文晨、孟庆峰、赵大力、王玮琳、刘金华、孟日增、王伟利。人粪便中华支睾吸虫虫卵检测 PCR 和实时荧光 PCR 法 1 范围 本文件规定了人粪便中华支睾吸虫虫卵PCR和实时荧光PCR法的试剂、材料和引物，仪器和设备，样品采集，核酸提取，DNA 的浓度和纯度测定，检测方法和结果判定。本文件适用于人粪便中华支睾吸虫虫卵核酸检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。bp：碱基对（base pair）CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid）FAM：6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)OD：光密度值（optical density）PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）Taq 酶：DNA 聚合酶（thermus aquaticu）TE 缓冲液：Tris-HCl、EDTA 缓冲液（Tris-EDTA buffer solution）Tris：三(羟甲基)氨基甲烷tris(hydroxymethyl)aminomethane MGB：小沟结合物（minor groove binder）5 试剂、材料和引物 试剂 5.1.1 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。试验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规定。5.1.2 液氮。5.1.3 EDTA 缓冲液（0.5 mol/L、pH 8.0）。5.1.4 CTAB 提取缓冲液（2.0%）。5.1.5 CTAB 沉淀液（0.5%）。5.1.6 蛋白酶 K 溶液（20 mg/mL）。5.1.7 NaCl 溶液（1.2 mol/L）。5.1.8 三氯甲烷。5.1.9 三氯甲烷/异戊醇（24:1，V/V）。5.1.10 异丙醇。5.1.11 70%乙醇。5.1.12 TE 缓冲液。5.1.13 加样缓冲液。5.1.14 Golden View 核酸染料（或其他等效核酸染料）。5.1.15 Premix Taq 反应预混液（市售商品化 PCR 基础试剂）。5.1.16 Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2）反应预混液（市售商品化荧光 PCR 基础试剂）。5.1.17 琼脂糖凝胶。5.1.18 1TAE 电泳缓冲液。试剂配制 试剂配制参见附录 A。材料 5.3.1 无 DNA 酶污染的离心管（1.5 mL、2.0 mL）。5.3.2 PCR 反应管。5.3.3 无 DNA 酶污染的吸头（10 L、100 L、200 L、1 000 L）。引物 5.4.1 普通 PCR 引物序列见表 1。表1 普通 PCR 引物序列 名称 序列 片段大小 上游引物 5-TTGTCTGGGTAGGGTGGTTTG-3 231 bp 下游引物 5-ACTATCCCAGTAACCCCGCC-3 5.4.2 实时荧光 PCR 引物与探针序列见表 2。表2 实时荧光 PCR 引物、探针序列 名称 序列 上游引物 5-TATAGTTTGTCTGGGTAGGGTGGTT-3 下游引物 5-AACAGCAGTCCCCAAATCCA-3 探针 5-FAM-AGCTCATCATATGTTTACTG-MGB-3 6 仪器和设备 PCR 仪。实时荧光 PCR 仪。电泳仪。凝胶成像系统。生物安全柜。离心机（离心力不小于 12 000 g）。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。移液器（2.5 L、10 L、20 L、100 L、200 L、1 000 L）。研钵或冷冻粉碎装置。恒温水浴锅或干式恒温器。天平（感量 0.01 g）。高压灭菌器。7 样品采集 采集人体粪便，避免污染。样品应-20 保存，冷藏运输，不能在 24 h 内送达实验室的样品应冷冻状态运送。8 核酸提取 在生物安全柜内取 200 mg500 mg 黄豆粒大小粪便，在液氮中充分研磨；或使用组织研磨仪对样品进行充分地研磨。取研磨后的样品 200 mg 于 2.0 mL 离心管中，加入 1.5 mL CTAB 提取缓冲液（2.0%）和 10 L 蛋白酶 K 溶液，65 孵育 30 min，期间每隔 10 min 振荡混匀；12 000 g 离心 10 min，转移上清于洁净的离心管中。加 750 L 三氯甲烷/异戊醇，混匀，12 000 g 离心 5 min，转移上清液于洁净的离心管中。加 2 倍体积 CTAB 沉淀液（0.5%），室温静止 60 min，12 000 g 离心 15 min，弃上清。加入 350 L NaCl 溶液将沉淀重悬浮。再加入 350 L 三氯甲烷，旋涡振荡进行混匀，12 000 g 离心 10 min。转移上清后加入 0.6 倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置 20 min，12 000 g 离心 10 min，弃上清。加入 500 L 70%乙醇洗涤一次，晾干。加入 100 L TE 缓冲液或超纯水，溶解沉淀。立即使用或 20 保存备用。可使用等效的商品化 DNA 提取试剂盒，按操作说明书进行操作。9 DNA 的浓度和纯度测定 样品 DNA 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A260 和A280。DNA 的浓度按式（1）进行计算:c=AN50 (1)式中：c DNA 浓度,单位为纳克每微升(ng/L)；A 260 nm 处的吸光值；N 核酸稀释倍数。当 DNA 浓度高于 10 ng/L，A260/A280 比值在 1.42.5 之间时，可用于 PCR 检测和实时荧光PCR 检测。10 PCR 检测 普通 PCR 检测 10.1.1 反应体系 按表 3 配制 25 L 反应体系，检测过程中设立阳性对照、阴性对照和空白对照，用合成的质粒作阳性对照，用不含目标基因的核酸做阴性对照，用水做空白对照。表3 PCR 反应体系 成分 用量（L）Premix Taq（含 PCR 缓冲液、dNTP、Mg 2+、Tap 酶）12.5 上游引物（10 mol/L）1.0 下游引物（10 mol/L）1.0 DNA 模板 5.0 ddH2O 水 5.5 10.1.2 扩增程序及反应条件 10.1.2.1 将 PCR 反应管置于 PCR 扩增仪，反应参数设置：第一阶段，94 预变性 2 min；第二阶段，94 变性 30 s、60 退火 30 s、72 延伸 30 s，共 30 个循环；第三阶段，72 延伸 5 min，最后 4 保存。10.1.2.2 反应体系浓度和反应条件可根据仪器和试剂不同作相应调整。10.1.3 PCR 产物的电泳 10.1.3.1 用 1TAE 电泳缓冲液配制成 1%琼脂糖凝胶，加入 Golden View 核酸染料或其他等效核酸染料，浓度为 5 L/50 mL。将平板放入水平电泳槽中，加入 1TAE 电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面。10.1.3.2 将 PCR 扩增产物 5 L 与 1 L 加样缓冲液混合后加入样品孔。在电泳时设立 DNA 标准分子量作对照，使用 100 bp DNA 分子量标准。5 V/cm 恒压电泳 30 min45 min。10.1.4 结果判定与表述 10.1.4.1 用凝胶成像系统进行分析。阳性对照扩增一条大小为 231 bp 的特异性条带，阴性对照和空白对照应无该特异性条带；在阴性和阳性对照成立情况下，如被检样品无条带，则判定为华支睾吸虫虫卵核酸阴性，表述为“未检出华支睾吸虫虫卵核酸”；如被检样品有条带，大小为 231 bp，即判定为华支睾吸虫虫卵核酸阳性，表述为“检出华支睾吸虫虫卵核酸”。10.1.4.2 必要时取 PCR 扩增产物进行序列测定，测序结果与附录 B 华支睾吸虫虫卵的 DNA 序列的符合程度在 97%及以上的，判定为华支睾吸虫虫卵核酸阳性；符合程度在 97%以下的，判定为华支睾吸虫虫卵核酸阴性。10.1.4.3 如果出现与设计长度不同的条带，为非特异性反应，需重复试验，两次试验都为非特异性反应时，可判为阴性。实时荧光 PCR 检测 10.2.1 反应体系 按表 4 配制 25 L 反应体系，检测过程中设立阳性对照、阴性对照和空白对照，用合成的质粒作阳性对照，用不含目标基因的核酸做阴性对照，用水做空白对照。表4 实时荧光 PCR 反应体系 成分 用量（L）Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2）（含 PCR 缓冲液、dNTP、Mg2+、Tap 酶）12.5 上游引物（10 mol/L）1.0 下游引物（10 mol/L）1.0 探针（10 mol/L）1.0 DNA 模板 5.0 ddH2O 水 4.5 10.2.2 反应参数 10.2.2.1 将 10.2.1 中加样后的 PCR 管放入实时荧光 PCR 检测仪内。反应参数设置：第一阶段，95 30 s；第二阶段，95 5 s、60 30 s（在此收集荧光），40 个循环。10.2.2.2 反应体系浓度和反应条件可根据仪器和试剂不同作相应调整。10.2.3 质量控制 10.2.3.1 阴性对照和空白对照无 Ct 值并且无扩增曲线。10.2.3.2 阳性对照有对数扩增曲线，而且 Ct 值32。10.2.3.3 如阴性对照和阳性对照条件不满足 10.2.3.1 和 10.2.3.2，实验视为无效。10.2.4 结果判定与表述 10.2.4.1 无 Ct 值并且无扩增曲线，判定为华支睾吸虫虫卵核酸阴性，表述为“未检出华支睾吸虫虫卵核酸”。10.2.4.2 检验样本 Ct 值35，出现典型的 S 型扩增曲线，判定为华支睾吸虫虫卵核酸阳性，表述为“检出华支睾吸虫虫卵核酸”。10.2.4.3 检验样本 35Ct 值40 时，重复一次，如果 Ct 值40 时，并且出现典型 S 型扩增曲线，判定为华支睾吸虫虫卵核酸阳性，否则判定为华支睾吸虫虫卵核酸阴性。A A 附录A （资料性）试剂配制 A.1 EDTA 缓冲液（0.5 mol/L、pH 8.0）：称取 18.6 g EDTA 溶解于 70 mL 水中，用 10%的 NaOH 溶液，调节 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL，103.4 kPa 蒸汽压（121）条件下灭菌 20 min，室温保存。A.2 Tris-HCl 溶液（1mol/L、pH 8.0）：12.1 g Tris，加 80 mL 水溶解后，用浓 HCl 调节 pH 值到8.0，然后再定容到 100 mL，103.4 kPa 蒸汽压（121）条件下灭菌 20 min，室温保存。A.3 Tris-HCl 溶液（10 mmol/L、pH 8.0）：量取 1 mL Tris-HCl 溶液（1mol/L、pH 8.0），加水稀释,调节 pH 8.0，,定容至 100 mL。A.4 CTAB 提取缓冲液（2.0%）：称取 2 g CTAB,取 10 mL 的 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），28 mL 的 5 mol/L NaCl，4 mL 的 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），加水定容至 100 mL，103.4 kPa 蒸汽压（121）条件下灭菌 20 min，室温保存。A.5 CTAB 沉淀液（0.5%）：称取 0.5 g CTAB，取 0.25g NaCl，用适量水溶解后，调节 pH 8.0，定容至 100 mL，103.4 kPa 蒸汽压（121）条件下灭菌 20 min，室温保存。A.6 蛋白酶 K 溶液（20 mg/mL）：称量 0.2g 蛋白酶冻干品，加无菌水溶解，加水定容至 10 mL，分装后于-20 保存。A.7 NaCl 溶液（1.2 mol/L）：称取 8 g NaCl 溶解于 80 mL 无菌水中，加水定容至 100 mL，103.4 kPa 蒸汽压（121）条件下灭菌 20 min，室温保存。A.8 三氯甲烷/异戊醇（24:1，V/V）：将三氯甲烷和异戊醇按照 24:1 的体积比例配制。A.9 70%乙醇：量取 70 mL 无水乙醇，加水至 100 mL。A.10 TE 缓冲液：将 0.5 mL 的 10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液、0.1 mL 的 0.5 mol/L EDTA 缓冲液（pH 8.0）溶液加入到 50 mL 容量瓶中，调节 pH 8.0，加水定容，103.4 kPa 蒸汽压（121）条件下灭菌 20 min，4 保存。A.11 加样缓冲液：称取 0.88 g Na2 EDTAH2O、50 mg 溴酚蓝、50 mg 二甲苯腈蓝 FF，加 40 mL 去离子水、36 mL 丙三醇充分搅拌均匀，用 10%的 NaOH 溶液调节 pH 至 7.0，加去离子水定容至 100 mL，室温保存。B B 附录B （规范性）华支睾吸虫虫卵特定的 DNA 序列 B.1 PCR 扩增产物序列（231 bp，GenBank No.：OM810331.1）如下：TTGTCTGGGTAGGGTGGTTTGAGCTCATCATATGTTTACTGTTGGGCTGGATTTGGGGACTGCTGTTTTTTTTAGCTCGGTTACTATGATTATAGGTGTGCCTACAGGGATCAAGGTTTTTTCATGGTTATATATGCTTGCTGGAACTCGGGAGCGTCTATGAGATCCAATCATGTGGTGGATAATCGGGTTTGTGGTGCTTTTCACTATAGGCGGGGTTACTGGGATAGT