DB45_T 2312-2021《水牛体细胞核移植技术操作规程》.pdf

ICS 65.CCS B 4广The te2021-020.30 43 西壮水牛echnical-04-25 发壮族牛体细protoco发布 广西壮族自细胞核l for the壮族自治区自治 核移植e somati 区市场监督区植技术c cell nu督管理局 地DB术操作uclear t 发 布 45方标B45/T 23作规程ransfer 2021-0布 5 标准122021 程 in buffa05-31 实准 alo实施DB45/T 23122021 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 药品试剂、耗材、设备和实验室.2 5.1 药品试剂.2 5.2 耗材.2 5.3 设备.2 5.4 实验室.2 6 卵母细胞和供体细胞准备.2 6.1 工作液配制.2 6.2 卵母细胞的收集.2 6.4 卵母细胞体外成熟培养.3 6.5 卵母细胞成熟的判定.3 6.6 供体细胞的培养.3 7 胚胎生产.3 8 胚胎分级.4 8.1 A 级.4 8.2 B 级.4 8.3 C 级.4 8.4 D 级.4 附录 A（规范性）工作液的配制.5 DB45/T 23122021 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由广西壮族自治区农业农村厅提出并宣贯。本文件由广西畜牧业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：广西壮族自治区水牛研究所。本文件主要起草人：杨春艳、尚江华、郑海英、黄加祥、罗华、李玲玉、唐丽萍。DB45/T 23122021 1 水牛体细胞核移植技术操作规程 1 范围 本文件规定了水牛体细胞核移植的试剂、耗材、设备、实验室、卵母细胞受体和供体细胞准备、胚胎生产、胚胎分级与选择等要求。本文件适用于广西行政区域内水牛体细胞核移植胚胎的操作。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 体外成熟 in-vitro maturation 从活体或离体卵巢上获取体内未成熟的卵母细胞，在适宜的条件下进行体外成熟培养，使卵母细胞恢复减数分裂至第二次减数分裂中期(M期)并具备受精能力的过程。3.2 体细胞核移植 somatic cell nuclear transfer 将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透即可被激活、分裂并发育成新个体，并使得核供体的基因得到完全复制。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。BSA：牛血清白蛋白（bovine serum albumin）COCs：卵丘卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes）6-DMAP：6二甲氨基嘌呤（6-dimethylaminopurine）DMEM：伯克改良伊格尔培养基(dulbecco modified eagle medium)DMSO：二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide）FBS：胎牛血清（fetal bovine serum）Hepes：羟乙基哌嗪乙硫磺（2-4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinylethanesulfonic acid）PBS：磷酸缓冲盐溶液（phosphate balanced solution）Pb1：第一极体（first polar body）TCM199：组织培养基199（tissue culture medium 199）DB45/T 23122021 2 5 药品试剂、耗材、设备和实验室 5.1 药品试剂 碳酸氢钠、乙二醇、蔗糖、甘油、Hepes、肝素、TCM199、PBS、FBS、BSA、山梨醇、乙酸钙、乙酸镁、细胞松弛素B、胰蛋白酶、透明质酸酶、离子霉素、6-DMAP。5.2 耗材 10 mm玻璃培养皿、35 mm和 60 mm塑料培养皿、0.22 m滤器、细胞冻存管、胚胎吸管、5 mm玻璃细管、透明硅胶软管、脱脂棉、纱布、封口膜、标签纸、记号笔、一次性乳胶或PE手套。5.3 设备 20体视显微镜、CO2培养箱、-20 4 冰箱或冰柜、显微操作仪、细胞融合仪、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温热台、超低温冰箱、电子分析天平、超声波清洗仪、电热鼓风干燥箱、超纯水仪、液氮生物容器。5.4 实验室 应具备准备室、缓冲间、无菌间和细胞保存间。其中缓冲间面积3 m2，配置更衣柜和紫外灯。紫外灯强度1.5 W/m3，距地面2.5 m。核移植操作前打开紫外灯照射20 min30 min。无菌间的无菌等级最低应达万级，无菌间的操作区应达百级。6 卵母细胞和供体细胞准备 6.1 工作液配制 见附录A。6.2 卵母细胞的收集 6.2.1 母水牛屠宰 30 min 内收集卵巢，置于 30 37 的卵巢保存液中，3 h 内送至实验室。6.2.2 在无菌条件下用 35 37 的卵巢保存液清洗卵巢三次，剪除周围结缔组织，用纱布吸干卵巢表面水分，用注射器套 17 号针头抽吸卵巢表面直径 2 mm8 mm 的卵泡，回收卵泡液及其内容物。6.2.3 将卵泡液及内容物转入 60 mm 的一次性塑料培养皿中，用玻璃吸胚管或加样枪套吸头，在体视显微镜下挑选出 COCs。6.3 COCs 分级 6.3.1 A 级 卵母细胞胞质均匀，外周包裹三层以上致密卵丘细胞。6.3.2 B 级 卵母细胞胞质均匀，外周包裹的卵丘细胞少于三层或部分脱落。6.3.3 C 级 卵母细胞胞质不均匀，卵丘细胞成蛛网状扩散或全部脱落。DB45/T 23122021 3 6.3.4 D 级 卵母细胞的形状不规则，过成熟、死亡或退化。6.4 卵母细胞体外成熟培养 选取A和B级的COCs用卵母细胞成熟培养液洗涤三次后，每100150个转入提前预热2 h、含1 mL成熟培养液的 10 mm玻璃培养皿中,并使其聚集；也可每1015个转入50 L覆盖石蜡油的成熟培养液微滴内。在38.5、5 CO2、完全相对湿度条件下静置培养22 h24 h。6.5 卵母细胞成熟的判定 COCs成熟培养后，在0.1透明质酸酶中吹打去除外周卵丘细胞，轻轻翻转卵母细胞，如胞质均匀且可见Pb1则判定为成熟，否则为未成熟。6.6 供体细胞的培养 6.6.1 卵丘细胞的培养 将COCs成熟培养后，吹打并收集卵丘细胞，加入细胞培养液，培养传代至第2 代3 代，用0.25胰蛋白酶消化贴壁细胞，加入细胞培养液，260 g离心洗涤5 min，弃上清液后注入1 mL3 mL细胞冷冻液，混匀，分装入细胞冻存管。冻存管在4 冰箱中放置2 h后，移至-80 存放12 h，最后投入液氮长期保存。6.6.2 成纤维细胞的培养 取经消毒的2 g5 g水牛胎儿组织或耳组织，剪碎至1 mm32 mm3的颗粒，均匀平铺在 60 mm塑料培养皿底部，倒置于培养箱20 min30 min，待组织粘附于培养皿后加入细胞培养液。10 d14 d细胞90汇集后用0.25的胰蛋白酶消化传代，传至第2 代3 代后消化贴壁细胞，加入细胞培养液260 g离心洗涤5 min，弃上清液后注入1 mL3 mL细胞冷冻液，混匀，装入细胞冻存管。冻存管在4 冰箱中放置2 h后，移至-80 存放12 h，最后投入液氮长期保存。6.6.3 供体细胞的准备 从液氮取出体细胞冻存管，37 水浴解冻后，加入 DMEM 离心洗涤去除 DMSO，取适量细胞，转入覆盖石蜡油的 40 L 细胞培养液微滴内，培养至 8090汇集，换为含 0.5 FBS 的 DMEM 培养 3 d5 d，用 0.25胰蛋白酶消化后用 DMEM 洗涤并重悬，作为供体细胞。7 胚胎生产 7.1 卵母细胞去核 7.1.1 纺锤体成像法去核 将成熟的卵母细胞转入覆盖石蜡油的30 L40 L去核操作液中，在配有纺锤体成像系统的倒置显微镜下，用外径110 m120 m的玻璃针回吸固定卵母细胞，用内径约18 m22 m的注射针翻转卵母细胞，可见纺锤体区域较其它部位明亮，且不断闪烁，吸除纺锤体和Pb1。7.1.2 荧光染色法去核 成熟卵母细胞用1 g/mL的Hoechest33342培养处理5 min，转入覆盖石蜡油的30 L40 L去核操作液中，在显微操作仪配备的紫外荧光照射下用注射针吸除蓝色的核和Pb1。DB45/T 23122021 4 7.1.3 盲吸法去核 将成熟卵母细胞转入覆盖石蜡油的30 L40 L去核操作液中，用注射针直接吸除Pb1和其周围1/51/4的胞质。7.2 重组胚构建 注射针吸取供体细胞，沿卵母细胞去核时留下的透明带缺口进针，回吸少量卵胞质后将单个供体细胞注入卵周隙，轻压透明带使体细胞膜与卵胞膜紧贴。7.3 重组胚融合与激活 将重组胚转入TCM199中，培 养30 min后用融合液洗涤一次，在其中平衡5 min，移至宽度1 mm的细胞融合槽，转动重组胚，使供体细胞与卵母细胞的接触面与电场方向垂直，施加两次脉冲时长10 s、强度为1.20 kV/cm的直流电进行融合。电融合后将重组胚培养30 min,体视显微镜下转动重组胚，卵周隙无体细胞即融合成功。将融合的重组胚用离子霉素培养处理5 min，而后转入6-DMAP中培养3 h4 h即完成激活。7.4 胚胎体外培养 用胚胎培养液清洗重组胚两次后，转入覆盖石蜡油的40 L胚胎培养液微滴中，在38.5、5 CO2、完全相对湿度条件下静置培养，每48 h半量更换胚胎培养液。培养48 h后记录卵裂数，5 d8 d记录囊胚数。胚胎发育至囊胚即可用于移植或冷冻保存。8 胚胎分级 8.1 A 级 胚胎发育阶段与胚龄一致。胚胎结构形态完整，轮廓清晰呈球形，胚胎细胞大小均匀，结构紧凑，透明度好，无细胞和液泡附着。8.2 B 级 胚胎发育阶段与胚龄基本一致。胚胎轮廓清晰，色调和细胞密度良好，可见少量细胞和液泡附着，变形细胞约占 1030。8.3 C 级 胚胎发育阶段与胚龄不一致。胚胎轮廓不清晰，色调较暗，结构较松散，游离细胞和液泡较多，变形细胞占 3050。8.4 D 级 A、B、C级以外的胚胎。注：A、B、C级胚胎均为可用胚胎。其中A级和B级胚胎可进行冷冻，C级胚胎只用于鲜胚移植，D级胚胎为不可用胚胎。A.1 卵生理A.2 卵TCM25 ng/mL备用。A.3 细DME加入青链A.4 细DMEA.5 去取1的TCM19A.6 融250PH值调至A.7 离取1取贮液加A.8 6-取1TCM199即A.9 胚TCM滤分装后 巢保存液 理盐水或PBS母细胞成熟培M199（含25 mL EGF；TCM19胞培养液 M10 FBS链霉素混匀，胞冷冻液 M10 DMS核操作液 mg的细胞松9内即为去核合液 mM 山梨醇+至7.27.4，子霉素 mg的离子霉加入999 L的DMAP 6.318 mg的6即为终浓度为胎体外培养液M199（含25 m后放置在4 中加入100 I培养液 mM Hepes 和099基础液中加S100 IU/mL0.22 m滤SO+10 FBS弛素B，加入核操作液。0.1 mM 醋酸钙过滤分装，霉素，加入0.的TCM199即为6-DMAP，加入为2 mM的工作液 mM HEPES和0.备用。U/mL青霉素和.26 mM NaHCO加入10体积L青霉素50器过滤分装S；DMEM基础入1 mL的DMSO溶钙+0.5 mM 醋4 储存待用267 7 mL的DM为终浓度为5 入1 mL DMSO，液。.26 mM NaHCOA A 附录A（规范性）工作液的配和100 IU/mLO3）+10 FB积比的FBS，再0 IU/mL链霉，放置在4 础液中分别加溶解后制备成醋酸镁+0.5 m用。MSO，混匀后M的工作液。而后每10 O3）+10 FB A ）配制 L链霉素，混匀BS+10 g/mL再按比例加入素；DMEM基础备用。入10体积成贮液。而后mM Hepes+0.1每1 L分装为。L分装为贮液BS；TCM199基 匀，常温保存L FSH+12 U/m入上述成分，础液中加入1比的FBS和DM后取75 L贮液1 BSA，一般为贮液，置于液，置于-20基础液中加入DB45/T 存。mL LH+50 M过滤分装，10体积比的MSO,放置在液加入10 mL的般每次配液量于-20 保存0 保存，加入10体积比231220215 M 半胱氨酸放置在4 的FBS，而后在4 备用。的含10 FBS量为500 mL，存。每次激活加入990 L的比的FBS，过 后S 活的过 中华人民共和国广西地方标准 水牛体细胞核移植技术操作规程 DB 45/T 23122021 广西壮族自治区市场监督管理局统一印刷 版权专有 侵权必究