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5 凯氏定氮法

精品文档
五 & 六、总氮量的测定--凯氏定氮法
一、目的
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
二、实验原理
蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系，其中含碳50～55%、氢6～8%、氧20～23%、氮15～17%和硫0.3～2.5%。此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。
由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15～17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于6.25克蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以6.25，就可以计算出样品中的蛋白质含量。
蛋白质总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下：
CH2NH2COOH + 3H2SO4 → 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3

2NH3 + H2SO4 → （NH4）2SO4
有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min至1h或更长时间，视样品的性质而定。
消化反应方程式：

消化完毕后，加入过量浓碱（（如NaOH），硫酸铵与浓碱作用可游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的H+浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来H+浓度为止。
（NH4）2SO4 + NaOH → Na2SO4 + 2 NH4OH
NH4OH →NH3 + H2O +
3 NH3 + H3BO3 → 3NH4 + + BO33-
BO33-+ 3H+ → H3BO3

最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中总氮量。
三、试剂
1. 面粉 0.1g（对照3、4滴蒸馏水)
2. 消化液：过氧化氢：浓硫酸：水的比例为3∶2∶1，临用时配制（防止腐蚀，小心）。
3. 催化剂：硫酸铜(CuSO4•5H2O)与硫酸钾(K2SO4)以1：3配比研磨混合。
4. 30%氢氧化钠溶液
5. 2%硼酸溶液
6. 标准盐酸溶液(约0.01mol/L)
7. 混合指示剂(田氏指示剂)混合指示剂由50mL 0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200mL0.1%甲基红乙醇溶液混合配成贮于棕色瓶中配用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范围很窄且很灵敏。
四、操作方法
（一）消化
1、编号：取1支清洁干燥的消化管编号，编号后在每瓶内各加1粒玻璃珠。
2、加样：在1号管中各加样品0.1g（面粉），加催化剂0.2g，混和消化液5mL。注意加样品时应直接送入瓶底，而不要黏在瓶口和瓶颈上。在2号瓶中加蒸馏水3-4滴代替样品，其他试剂同样品瓶，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。
3、加热消化：摇匀后，每个瓶口放一漏斗（防止气体冲出），在通风厨内于远红外消煮炉上消化。开始消化时应以微火加热，不能让液体冲到瓶颈或冲出瓶外，否则将严重地影响样品测定结果。待瓶内水汽蒸完，H2SO4开始分解放出SO2白烟后，适当加强火力，使瓶内液体微微沸腾而不致跳荡。继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止（消化颜色变化：碳化黑色→红色（Cu2SO4，亚铜呈现褐色）→白色烟雾→透明淡绿色）。

实验六 凯氏定氮--测定
一、原理：
（NH4）2SO4 + NaOH → Na2SO4 + 2 NH4OH
NH4OH → NH3 + H2O +
NH3+ H3BO3 → （NH4）H2BO3

2、蒸馏：

3、滴定： NH4H2BO3 + HCl → NH4Cl + H3BO3
二、操作：
2）定容：消化完毕，待烧瓶中液体完全冷却后，缓慢沿瓶壁加蒸馏水10mL，随加随摇，分批加入蒸馏水至消化管上刻度（50mL），混匀备用；
3）蒸馏：干净的锥形瓶 + 1、2滴田氏指示剂，
取10ml消化液 → 蒸馏瓶
田氏指示剂的变色范围窄：pH 5.2 5.4 5.6
紫红 暗蓝 绿色
凯氏定氮仪的设定：
a) 将NaOH、硼酸、蒸馏水塑料桶拧紧（不漏气）；
b) 打开冷凝循环水；
c) 开机，显示“P”，按“转换”钮，设定加酸（1S），加碱（1S）（12ml/S）；
d) 放好大试管（含10ml消化液），上端密闭；将加入指示剂的三角瓶放在托盘上；
e) 按启动，仪器开始工作，等三角瓶颜色变绿时，计时1~2min后，按下托盘，6S后听到“滴滴”声，机器停止工作；
f) 先取出大试管（湿毛巾取，烫），待收集管无残留液时取出锥形瓶，贴壁，用蒸馏水冲洗排出口 → 滴定。
4）滴定
全部蒸馏完毕后，用0.01mol/L 标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸—指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点，记录所耗HCl 溶液量。
五、计算
C（V1－V2）×14
×
%
×
测定时消化液用量（mL）
样品中的总氮量（%）=
消化液总量（ mL）

W × 1000

C为标准盐酸溶液摩尔浓度
V1为滴定样品用去的盐酸溶液平均mL
V2为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均mL
W为样品重量（g）
14为氮的相对原子质量
若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则，
样品中的蛋白质含量(%)=总氮量×6.25
若样品中除有蛋白质外，尚有其它含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要复杂一些。首先，需向样品中加入三氯乙酸，使其最终浓度为5%，然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品的上清液中的含氮量，得出非蛋白氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步折算出蛋白质含量。
蛋白氮=总氮－非蛋白氮
蛋白质含量(%)=蛋白氮×6.25
注意事项：必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，保证不漏气。
思考题
1．测定标准硫酸铵和空白的目的是什么？
2. 如何证明蒸馏器洗涤干净？
3. 在实验中加入硫酸钾－硫酸铜混合物的作用是什么?  
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