新型K-ATP开放剂Iptakalim对原代培养人肺动脉平滑肌细胞SUR2BKir6.1-mRNA表达的影响资料.docx

此文档收集于网络，如有侵权请联系网站删除南京医科大学硕士学位论文1ranscr明enzyme毒逆转录酶英文缩写英文全称中文全称NONrtric oxide一氧化氮NPY民丁NANeurq:明depro脑却咆臼Unud四g世gen神经肤 增殖细月创刻元房、民!2pros臼gIan仙也前歹IJ环素PINPinacidil，以随尔PKAprotein地1aSeA蛋白激峰APKC目。回n挝naseC蛋白激峰CSURSulfonylurea receptor磺月尿类受体TGF-1Trnnsforr由毡growth 如tor-1转化生长因子:. 1VEGFVlPV孤立址aren创lelial growth 鱼阳V础泪ctiveir阳出d防ptide血管内皮生长因子 血管活.，t:生肠肤3此文档仅供学习和交流南京医科大学硕士学位论文论文独创性声明本论文堑型K鲤珏趑刻!坐鱼!迪过厘岱培差厶脏动然垩遗题细胞S避旦堡i遁：!盟墅坚麦达的毖喧是我个人在导师指导下进行的 研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方 外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均在论文中作了明确的声明并表示了谢：也恩。专业：哩哩囱型 作者签名：蕴纽至 日期： 沙诱一矿6卅了论文使用授权声明本人完全了解南京医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以 公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保 存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名： 丝导师签名： 日期： z力口9一善一f南京医科大学硕士学位论文新型Km开放剂Iptakalim对原代培养人肺动脉平滑肌细胞 S切迎B瞄r61 mRNA表达的影响(中文摘要)研究生：李庆玲导师：解卫平副教授肺动脉高压(pulmonary artery hypertension，PAH)是许多肺部 疾病发展为慢性肺源性心脏病的重要病理生理过程。肺动脉高压的病 理生理基础是肺小动脉平滑肌细胞收缩、增殖及肺小动脉重构。研究 表明，肺动脉平滑肌细胞膜钾通道与肺动脉收缩及增殖密切相关。钾 通道功能下降激活L钙通道，使细胞内ca2+(ca2+cyt)浓度升高，肺动脉平滑肌细胞收缩；同时增殖细胞核抗原(PCNA)、转录生长 因子p 1(TGFp 1)等增殖因子增加，凋亡因子减少，促进肺动脉平 滑肌细胞增殖。肺动脉平滑肌细胞膜至少存在四种钾通道：(1)电压依赖性钾 (Kv)通道，(2)Ca2+激活性钾(Ka)通道，(3)ATP敏感性钾 (KAav)通道，即内向整流性钾(Kir)通道，(4)二孔区钾(K2P) 通道。缺氧时，KATp通道代偿性开放是机体重要的代偿机制。持续缺氧 导致肺血管内皮细胞合成、分泌血管活性物质失衡，内皮素1(ET-1)、 血管紧张素II(ANGII)等缩血管物质增加，一氧化氮(NO)、前列 腺素12(PGh)等舒血管物质减少。这些物质与肺动脉平滑肌细胞膜 K册通道正偶联或负偶联，使钾通道功能下降，细胞膜去极化，肺动 脉平滑肌细胞收缩。持续肺血管收缩刺激血管增生、重构、产生肺动五南京医科大学硕士学位论文脉高压及右心室肥厚。因此，KAte通道在肺动脉高压形成中处于关键 环节，成为研发治疗肺动脉高压新型药物的重要靶分子。新型KAn,开放剂Iptakalim对SUR2BKir61靶向性更强。动物研 究显示，Iptakalim可提高肺动脉平滑肌细胞外向性钾电流、抑制低氧 性肺血管收缩及增殖、降低低氧大鼠肺动脉压力，还能逆转肺血管和 气道重构、抑制右心室肥厚、有效预防扣治疗肺动脉高压。考虑到人与动物间的物种差异，Iptakalim对人肺动脉平滑肌细胞的作用可能存 在差异。目前，包括本研究在内的系列研究正在展开。本实验以ET-1 及低氧诱导原代培养人肺动脉平滑肌细胞，运用实时荧光定量PCR(Realtimequantitativereversetranscriptivepolymerasechainreaction，RQRTPCR)技术，研究Iptakalim对人肺动脉平滑肌细 胞SUR2BKir61 mRNA表达的影响，以揭示肺动脉高压发生发展的 分子生物学机制，并为Iptakalim研发成具有自主知识产权的临床治疗新药积累实验基础。第一部分Iptakalim对ET-1诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细 胞SUR2BKir61 mRNA表达的影响目的研究新型K唧开放剂Iptakalim对ET-1诱导的原代培养人肺动 脉平滑肌细胞SUR2BKir61 mRNA表达的影响，以探讨Iptakalim治 疗肺动脉高压的分子生物学机制。 方法分离手术标本正常入肺组 织3-4级肺小动脉，原代培养肺动脉平滑肌细胞。分别加入ET-1、南京医科大学硕士学位论文不同浓度Iptakalim(O1州、1出、10 rtM)及Glyburide(O1州、1 p,M、10州)继续孵育细胞24小时。以Trizol法抽提细胞总RNA， 逆转录为cDNA，以RQRT-PCR法检测各组细胞SUR2BKir61 mRNA表达量。 结果ET1组SUR2B mRNA表达量较正常组明显减少。Iptakalim呈浓度依赖性拮抗ET-1的抑制作用，提高SUR2B mRNA表达量。Glyburide呈浓度依赖性拮抗Iptakalim的作用，减少 SUR2B mRNA表达量。各组Kir61 mRNA表达量无统计学差异。结 论新型KATP开放剂Iptakalim呈浓度依赖性拮抗ET-1的作用，增加 原代培养人肺动脉平滑肌细胞KATP通道中SUR2B亚基mRNA表达 量，提示Iptakalim通过增加人肺动脉平滑肌细胞KAav通道表达、缓 解肺动脉平滑肌痉挛、增殖治疗肺动脉高压。第二部分Iptakalim对低氧诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细 胞SUR2BKir61 mRNA表达的影响目的研究新型KA册开放剂Iptakalim对低氧诱导的原代培养,h3糊s 脉平滑肌细胞SUR2BKir61 mRNA表达的影响，以探讨Iptakalim治 疗肺动脉高压的分子生物学机制。 方法分离手术标本正常人肺组织34级肺小动脉，原代培养肺动脉平滑肌细胞。分别加入不同浓度 Iptakalim(O1 rtM、1州、10 gM)及Glyburide(O1叫、1州、10 山)于低氧环境下(02 5， C02 5，N2 90)继续孵育细胞24小时。以Trizol法抽提细胞，6-RNA，逆转录为eDNA，以RQRT-PCR6南京医科大学硕士学位论文法检测各组细胞SUR2BKir61 mRNA表达量。结果低氧组SUR2B mRNA表达量较正常组明显减少。Iptakalim呈浓度依赖性拮抗低氧 的抑制作用，提高SUR2B mRNA表达量。Glyburide呈浓度依赖性拮抗Iptakalim作用，减少SUR2BmRNA表达量。各组细胞Kir61mRNA 表达量无统计学差异。结论新型KATP开放剂Iptakalim呈浓度依赖 性拮抗低氧的作用，增加原代培养人肺动脉平滑肌细胞KATP通道中 SUR2B亚基mRNA表达量，提示Iptakalim通过增加人肺动脉平滑肌 细胞KATP通道表达、缓解肺动脉平滑肌痉挛、增殖治疗肺动脉高压。关键词：KATP开放剂；Iptakalim；人肺动脉平滑肌细胞；实时荧光定量PCR；肺动脉高压7南京医科大学硕士学位论文The effects of Iptakalim，a novel KATe channel opener,on mRNA level of SUR2BKir61 in primary cultured human pulmonary artery smooth muscle cells(Summary、一，) MASc candidate：Li Qingling Mentors：Assosiate ProfXie WeipingPulmonary artery hypertension(PAI-I)is charactered by contraction and proliferation of small pulmonary artery smooth muscle cells，and remodeling of small pulmonary arteriesHowever,the role of K+channels in the development of PAH by mediating pulmonary vascular constriction and remodeling has been extensively demonstratedThe dysfunction of K+charmels activites LCa2+ch皴mels which induces influx of Ca2+and contraction of smooth muscle cellsCa2+is also the important second messenger for some transform factors leading to cell proliferation in cellsOn the other hand，a loss of K+in cytoplast inhibits apoptosis factors andpromotes cell proliferationThere are at least four types of K+channels in pulmonary artery smooth muscle cells：(1)voltagegated K+(Kv)channels，(2) Ca2+_activated K+(a)channels， (3)ATPsensitive K+(KAy)channels， (4)twoporedomain K+(K2P)channelsKATP channels were activated when hypoxia occurred，but they would be mostly inhibited by persistent hypoxia because of the unbalance8南京医科大学硕士学位论文between endotheliumderived vasoconstrictive substance and vasodilating substanceThe increase of vasoconstrictive substance like angiotensin II (ANG II)，endothelin一1(ET-1)，ectand decrease of vasodilatingsubstance like prostaglandin 12(PGl2)，nitric oxide刚吼etcinhibit theexpressions and fuctions of K虹P channelsTherefore,K卿曲锄础s inpulmonary artery smooth muscle cells删potential m黜印eL血targets for碘蛐anovel K邪恻、枷icb甲妊ay协酎幻双爪2B依i161，啪硫渤sethe value of oHtward心cu球缸density,attenuate r皿nomry res妇ace voBcular remodeling and prevent chronic PAH and咄venlricle h)p喇呐in rats in our precious stHdiesIn order to investigate the effect of职批on human pulmonarysmooth muscle cells，serial exper岫ents include lhis one were performedOur aimvcas to investigate file effects of Iptakalim on mRNA囝驷洳ofSUR2BKir61 byrealtime quantitative reverse transcriptive polymerase chain reaction(R吣r-PCR)in pram秽oataared human pulmonary artery smooth musclecells inducedbyET-1 orhypoxia,madtoprobeintothemolect】larbiologicalmechanisnaof development in chronic PAH,and to accunalate experiment foundation of this newPart IThe effects of Iptakalim Oil mRNA expression of SUR2BI(拍I inprimary cultured human pulmonary artery smooth muscle cells induced by9南京医科大学硕士学位论文objective To study the effects of Iptakalim on mRNA expression of SUR2BKir61 in primary cultured human pulmonary artery smooth muscle cells induced by ET-1Methods The specimens was obtained from patients who undergoing partly pneumonectomyIntrapulmonary arteries(3rd-4th division)were opened longitudinallyAfter removing the adventitia and epithelia by a blade，vessels were cut into pieces of 13 mm2The tissues and smooth muscle cells were cultured with DMEMCells were incubated with test substances for 24h in normoxiaET-1(1 0 nM)，Iptakalim or Glyburide in different concentration(O1 rtM，10州， 1 0沁田were added respectivelyTotal RNA was extracted by Trizol andreverse transcribed into eDNARQ-RTPCR was explored to measure the level of the expression of SUR2BKir61 mRNAResults ETl suppressed the expression of SUR2B mRNA compared with control groupThe expressions of SUR2B mRNA in the groups ofETl+Iptakalim O1州，ETl+Iptakalim 1出，ETl+Iptakalim 10眦were increased in concentrationdependent manner compared with that in ET-1 groupThe expressions of SUR2B mRNA in the groups of ETl+Iptakalim 1 0tM+Glyburide O1 rtM，ETl+Iptakalim 1 0pM+Glyburide 1 0M，ET一1+Iptakalim 1 0 HM+Glyburide 1 0 gM were decreased in concentrationdependent manner compared with that in ETl+Iptakalim 1 0 oM groupThere were no significant differences about the expressions of Kir61 mRNA among all groupsConclusion南京医科大学硕士学位论文Iptakalim can increase the expression of SUR2B mRNA of Kgp channels in primary cultured human pulmonary artery smooth muscle cells induced by ET-1，which shows a prospect for therapy of PAHPart II The effeas of Iptakalim on mRNA expression of瀚1inprimary cultured human pulmonary artery smooth musde cells induced byobjective To study the effects of Iptakalim on mRNA expression of SUR2BKir61 in primary cultured human pulmonary artery smooth muscle cells ina】cI狙by hypoxia Methods The specimens was obtained from patients who undergoing partly pneumonectomyIntrapulmonary arteries(3rd-4th division)were opened longitudinallyAfter removingthe adventitia and epithelia by a blade，vessels were cut into pieces of 13mm2The tissues and smooth muscle cells were cultLlred wim DMEMCells were incubated with test substances for 24h in hypoxia(02 5) Iptakalim or Glyburide in different concentration(O1山，10州，1 0 出)were added respectivelyTotal RNA was extracted by Trizol andreverse transcribed into cDNARQRTPCR was explored to measure the level of the expression of SUR2BKir61 mRNAResults Hypoxia suppressed the expression of SUR2B mRNA compared、ith control groupThe expressions of SUR2B mRNA in the groups of南京医科大学硕士学位论文hypoxia+Iptakalim 01 rtM，hypoxia+Iptakalim 1 rtM，hypoxia+Iptakalim 1 0 rtM were increased in concentrationdependent manner compared with that in hypoxia groupThe expressions of SUR2B mRNA in the groups of hypoxia+Iptakalim 1 0灿付Glyburide O1州，hypoxia+Iptakalim 1 0 lxM+Glyburide 1州，hypoxia+Iptakalim 1 0“M+Glybufide 1 0脚were decreased in concentrationdepended manner compared with that in hypoxia+Iptakalim 1 0出groupThere were no significant differences about the expressions of Kir61 mRNA among all groupsConclusionIptakalim can increase the expression of SUR2B mRNA of KATP channels in primary cultured human pulmonary artery smooth muscle cells induced by hypoxia，which shows a prospect for therapy of PAHKey words：K卿channel openers；Iptakalim；human pulmonary arterialsmooth muscle cells；Realtime RT-PCR；pulmonary artery hypertension12南京医科大学硕士学位论文前言慢性肺源性心脏病是一种严重危害人类健康的疾病，目前临床缺 乏理想的治疗手段。肺动脉高压(PAH)是慢性阻塞性肺疾病(COPD) 及其他肺部疾病发展为慢性肺源性心脏病的重要病理生理过程，其病 理生理基础是肺小动脉平滑肌细胞收缩、增殖及肺小动脉重构。因此， 有效治疗肺动脉高压成为临床防治慢性肺源性心脏病的重要环节。研究表明，肺动脉平滑肌细胞钾通道与血管舒缩状态密切相关。 缺氧时细胞膜钾通道功能下降，细胞膜去极化，电压依赖型钙 (LCaa+)通道开放，Ca2+内流增加：同时肌浆网钙储存库释放Ca2+， 细胞内游离ca2+(ca2+cyt)增多，血管平滑肌收缩1一。ca2+cyt升高是许多增殖因子的第二信使，使细胞周期向合成期及有丝分裂期转 化、细胞增殖；另一方面钾通道活性下降使细胞内钾浓度增加，胱门 蛋白酶(Caspases)、核酸酶等活性降低，肺动脉平滑肌细胞凋亡减 少网，加重了肺血管肌层增厚14】。钾通道、钙通道及平滑肌细胞收缩 及增殖的关系如图1所示。肺动脉平滑肌细胞膜至少存在四种钾通道：(1)电压依赖性钾 (Kv)通道，(2)Ca2+激活性钾(Ka)通道，(3)ATP敏感性钾(K岍) 通道，即内向整流生钾(Kir)通道，(4)二孔区钾(K2P)通道。Km通道是由内向整流性钾通道(Inwardly rectifying potassium channel subunits，Kit6x)家族和磺脲类受体(Sulfonylurea receptor， SUR)家族组成的异源性八聚体(SURJKir6x4)，广泛存在于胰腺13 细胞、血管平滑肌、骨骼肌和神经细胞中。KAa-p通道是在机体缺血、南京医科大学硕士学位论文缺氧、酸中毒时代偿性开放的重要通道5,61。y玉S0trictionCa2CaCa“Cro宝sbdg酋Cycling臻 Cell Cycleii文美妻荔jAdb瓣叫嗡譬n；隆， ic幸俄pASC Contraction PASMC Proliferation丫Pui rnoIlaryPulrnonary VascularVasoconstrictionMedial Hypertrophy图1钾通道、钙通道调节肺血管平滑肌收缩及增殖的机制 钾通道关闭，细胞膜去极化，L-Ca2+通道开放，Ca2+cyt增高，肺血管平滑肌细胞收缩及增殖；钾通道开放，细胞膜超极化，L-Ca2+通道关闭开放，Ca2+】。yt降低，肺血管平滑肌细胞舒张。Ca2+。为核内ca2+浓度，Ca2+】SR为肌浆网内ca2+浓度。14南京医科大学硕士学位论文缺氧时，肺血管内皮细胞合成、分泌血管活性物质失衡，内皮素1(ET-I)、血管紧张素II(ANGII)等缩血管物质增加，一氧化氮 (NO)、前列腺素12(PGl2)等舒血管物质减少。这些血管活性物质 与肺动脉平滑肌细胞膜KATP通道正偶联或负偶联，使钾通道功能下 降，细胞膜去极化，肺动脉平滑肌细胞收缩。持续肺动脉收缩导致肺 血管重构、肺动脉高压及右心室肥厚阴。各种血管活性物质对KAW 通道表达调控的信号传导通路如图2所示忉。由此可见，K娜通道在 肺动脉高压形成过程中处于关键环节【8】成为研发治疗肺动脉高压新 型药物的重要靶分子。Activation of KATPby vasodilator$Inhibition of鳓7-P by(CGRP，adenosine，vasoconstrictorsPGl2Badrenoceptor(Angll。NPY。NA，5-卜lTagonistsVIP)histamineendothelinlK channeIk州鹪A 0mopenersl矗Diameter图2血管平滑肌KATP调控的信号传导通路CGRP，Calcitonin gene-related protein，钙基因相关蛋白；PGl2，prostaglandin h，前列 腺素12；VIP，Vasoactive intestinal peptide，血管活性肠肽；ANGII，angiotensin II，血管紧 张素II；NPY，neuropeptide，神经肽；PKC，PKA，protein kinase C and A，磷酸激酶C 和A：Vm，membrane potential，膜电位15南京医科大学硕士学位论文Iptakalim是我国自45-i殳计、具有自主知识产权的新型Kgn,开放剂 91，其结构不同于目前国际上已经存在的八类K册开放剂(苯并吡喃 类、氰胍类、二氰吡啶类、嘧啶类、苯并噻二嗪类、6吡啶类、烟酰胺类、硫代甲酰胺类)，被认为是第九类KArp开放剂，对SUR2B靶向 性更强【10l。本课题组已在动物模型细胞、电生理、分子水平研究发现： 靶向生-SUR2Kir6x开放剂Iptakalim不仅可以降低低氧大鼠肺动脉压， 逆转肺血管和气道重构，抑制右心室肥厚，有效预防和治疗肺动脉高医11,121，舒张哮喘豚鼠气道平滑肌【13】，抑制低氧大鼠肺动脉平滑肌细 胞增殖细胞核抗原(PCNA)、转化生长因子pl(TGFISl)表达【14，15】， 增hc,SUR2BN基mRNAg达【161，同时还通过激活钾通道，抑制原代培 养兔肺动脉平滑肌细胞内游g Ca2+升高1刀。最近研究发现Iptal(alim可 通过作用于血管内皮细胞SUR2BKir61，抑制血管内皮细胞内皮素转 化酶和内皮素基因的表达，抑制内皮素的释放，对抗血浆内皮素水平 的增高，从而保护内皮细胞【181，考虑到人与动物问的物种差异， Iptakalim对人类肺动脉平滑肌细胞作用可能存在差异，包括本研究在 内的相关系列研究正在展开。近期研究发现，Iptakalim可抑制ET1诱导的入肺动脉平滑肌细胞增殖【191。ET1是肺动脉高压形成过程中重较要的缩血管物质之一。本实 验以ET一1诱导肺动脉平滑肌细胞，模仿肺动脉高压时细胞内环境， 或将细胞直接于缺氧环境下培养，运用实时荧光定量PCR(Realtimequantitativereversetranscriptivepolymerasechainreaction，RQRTPCR)技术，以经典KATP开放剂Pinacidil为对照药物，研究16南京医科大学硕士学位论文具有我国自主知识产权的新型K岍开放剂Iptakalim对原代培养入肺 动脉平滑肌细胞SUR2BKir61 mRNA表达的影响，探讨肺动脉高压 发生发展的分子生物学机制，为Iptakalim应用5-11告床提供实验理论依据。17南京医科大学硕士学位论文第一部分Iptakalim对ET-1诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细 胞SUR2BKir61 mRNA表达的影响肺动脉高压(PAH)是严重危害人类健康的疾病，目前临床治疗 乏术。K铘通道是机体缺氧、缺血时起重要作用的钾通道，与血管舒 缩状态密切相关。缺氧时肺血管内皮细胞等分泌血管活性物质失调， 主要通过作用于肺动脉平滑肌细胞膜KArp通道改变肺动脉平滑肌细 胞的舒缩状态。因此，研发KAaV开放剂成为临床治疗肺动脉高压的 一个契机。ET-1是由肺血管内皮细胞分泌的、目前已知最强的肺血管收缩 因子之一，在缺氧性肺血管收缩(印)V)、重构、肺动脉高压形成中 发挥重要的调节作用20,21,22。研究显示，几乎所有肺动脉高压患者体 内ET-1均增剐231。缺氧时肺血管内皮细胞及平滑肌细胞产生内源性 ET-1增加；并在成纤维细胞生长因子(FGF)等作用下使肺血管细胞 膜ETA受体表达增ht24。ET-1作用于肺血管平滑肌细胞膜Ek受体， 激活磷脂酶C、蛋白激酶C抑制平滑肌细胞膜KAav通道引起肺血管 收缩25,26。Iptakalim为新型选择性Km开放剂，Glyburided为特异性KArp 拮抗剂。动物研究从整体、细胞、分子学水平已证实Iptakalim对肺 动脉高压有治疗作用，但对于人类肺动脉的作用研究尚少。本实验以 ET-1作用于原代培养人肺动脉平滑肌细胞，研究Iptakalim、Glyburided 对ET-1作用的影响，以RQRT-PCR法比较SUR2BKir61 rnRNA表南京医科大学硕士学位论文达的变化，探讨肺动脉高压发生发展的分子生物学机制及Iptakalim 治疗肺动脉高压的可能机制。材料与方法一、主要试剂与仪器 Iptakalim(纯度9936)由军事医学科学院药理和毒理研究所馈赠，于实验当天用O9NaClig至所需浓度；ET1、Pinacidil、Glyburide、二甲基亚砜(Me2SO，DMSO)均购自美国Sigma,娴。ET一1用O9 NaCl配制成15 txgml溶液，实验当天用09NaCI稀释为15 p,gml溶 液。Pinacidil溶于二甲基亚砜和09NaCI中(1：3)。Glyburide)1O9NaClig制后用00 1 mmolL氢氧化钠滴定pH为85，使Glyb嘶de溶解。 Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和胰酶购 自美国GIBCO公司，Trizol购自美IN Invitrogen公司，SYBR Green Realtime PCR Kit购自日本TOYOBO公司。DEPC、Moloney鼠白血 病病毒逆转录酶(MMLV)、5buffer、引物Oligo(dT)15、RNA酶抑 制剂和dNTPs购自美IN Promega公。检测mRNA的定量PCR仪器为Rotor-Gene 3 000，购于澳大ff)_IE Corbett Research公司。 二、细胞培养及分组肺动脉平滑肌细胞来自于江苏省人民医院胸外科因周围型肺癌1 期(2例)、肺错构瘤(1例)行部分肺叶切除患者术后标本中的正常 肺组织，经病理证实切缘无肿瘤细胞等病变侵犯。患者术前诊断无慢 性阻塞性肺气肿、慢性肺源性心脏病等肺部疾病。实验经患者知情同 意，江苏省医学伦理委员会审核批准。无菌条件下，于4C Hanks溶19南京医科大学硕士学位论文液中分离34级肺小动脉，去除血管外膜，以刀片刮去内皮细胞，将 标本制成l3mrnz大小，放入含有DMEM培养基中，加入20胎牛血 清、链霉素(100 ggm1)、青霉素(100 um1)、两性霉素(25tgm1)， 置于37C培养箱中培养(含5C02，95空气)。4“周后，平滑肌 细胞移出并生长于培养瓶中，4周左右细胞融合，025胰酶消化并传 代。继续置于含有10胎牛血