利用内标为基础的RTPCR技术检测草莓四种病毒.doc

运用内标为基础RT-PCR技术检测草莓SCV、SVBV病毒史芳芳 (新疆兵团第十二师农业科学研究所，乌鲁木齐 830088)摘要：草莓皱缩病毒病（SCV）是草莓上为害性最大病毒病，单独侵染，影响长势，与其他病毒复合侵染时，使感病品种植株严重矮化，一般与草莓镶脉病毒（SVBV）复合侵染。本研究通过CTAB法与试剂盒提取RNA，以优质总RNA为模板，进行梯度PCR，结合扩增内标检测体系，建立了优化SCV和SVBV多重RT-PCR检测体系，可以对草莓田间植株进行迅速稳定病毒检测。关键词: 草莓病毒; 内标; 多重RT-PCR; 病毒检测Detection of SCV and SVBV with Multiplex RT-PCR Based on Internal ControlShi Fang-fang（The Center of Popularization of Agricultural Technology of the 12th Division of Xinjiang Production and Construction Corps, Urumchi 830088）Abstract: Strawberry crinkle virus (SCV) was damage of the largest virus disease.When it was infected alone, it influenced the growth, and other complex virus infection to susceptible cultivars were severe stunting, usually mixed infection strawberry vein banding virus (SVBV) . By CTAB method and the kit, RNA was extracted, using high-quality total RNA as a template, gradient PCR with internal amplification target detection system, established a multiplex RT-PCR detection system of SCV and SVBV can fast and stable virus detection in field grown strawberries.Key words: strawberry virus; internal control; multiplex RT-PCR; virus detection 草莓种苗普遍感染病毒是草莓生产中瓶颈问题，由于可侵染草莓病毒常常复合侵染，因此草莓病毒病田间症状体现极其复杂。不一样病毒病在草莓上可体现出相似症状,而同种病毒病在不一样条件下症状也会出现很大差异,这给病害田间诊断带来了极大困难。因此，建立迅速、精确草莓病毒检测技术具有重要实际意义。新疆对草莓病毒病研究很少，对病毒种类、分布、发生程度及生物学特性等基础极为微弱，病毒检测体系不健全，缺乏先进种苗及种苗生产环节有效病毒检测技术手段，脱毒种苗质量难以保证，退化严重，使用时间短，效益不高。有生产单位未经检测就盲目从内地调种，劣质种苗不仅破坏了脱毒种苗声誉，市场引起纠纷，损害了农民利益，还导致了某些病原菌广泛传播和地区性检疫病害传入我区，后患无穷。因此，我们在已经有试验技术基础上，通过深入改善试验措施，优化体系，建立起一套敏捷度高，精确性好，操作简便病毒检测技术。本研究意在针对草莓SVBV、SCV两种病毒，以单一RT-PCR为基础，通过对反应条件和参数探索与优化，建立多重RT-PCR检测措施，实现两种病毒同步高效迅速检测，为草莓病毒检测提供一种以便、高效分子生物学措施，为草莓无病毒苗实际生产提供技术支撑。1 材料与措施1.1 试验材料草莓试材采自于新疆兵团十二师三坪农场种植露地草莓品种达赛莱克特, 此品种为该单位从外地引进，种苗未经检测便种植于大田，受三坪农场之托采集疑似感染皱缩病毒6株草莓植株叶片，进行病毒检测。取幼叶一片, 大小约50mg为试验材料。RNA试剂提取盒、反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量MarkerD均购于上海生物工程有限企业。1.2 试验措施1.2.1 特异性扩增与参照引物设计 根据GenBank中SMoV( Genbank Accession No. AJ311875, AJ311876)、SMYEV( Genbank Accession No. D12517)、SCV( Genbank Accession No. AY005146. 1) 、SVBV( Genbank Accession No. NC001725) 基因组序列和文献分别设计和合成针对SMoV、SMYEV、SCV和SVBV 引物( 表1)。 为了验证扩增阴性条带真伪性, 该研究特引用草莓肌动蛋白基因Actin( GenBank Accession No. AB116565)作为内部体系参照。研究中所用引物均由上海生物工程企业合成。引物序列见表1。Table 1 The primer pairs for detection of SMoV、SMYEV、SVBV、SCV and Actinprimer pairSequence ( 53)Target fragment (bp)SMoVFTAAGCGACCACGACTGTGACAAAG(Sense primer)219SMoVRTCTTGGGCTTGGATCGTCACCTG(Antisense primer)SVBVFGAATGGGACAATGAAATGAG(Sense primer)278SVBVRAACCTGTTTCTAGCTTCTTG(Antisense primer)SMYEVFCCGCTGCAGTTGTAGGGTA(Sense primer)861SMYEVRCATGGCACTCATTGGAGCTGGG(Antisens primer)SCVFCATTGGTGGCAGACCCATCA(Sense primer)345SCVRTTCAGGACCTATTTGATGACA(Antisens primer)ActinFGCTGGGTTTGCTGGAGATG(Sense primer)295ActinRCACGATTAGCCTTGGGATTC(Antisens primer)1.2.2 核酸提取1.2.2.1 运用改善CTAB法提取草莓叶片总核酸。取少许幼嫩叶片，放入1.5ml离心管中，加入石英砂用研磨杵研磨均匀，直至所有研磨至粉末，加入500ul65预热CTAB溶液（用前加入2%巯基乙醇），将装有CTAB和样品EP管放入65水浴，约20min。冷却后，加入500ul酚：氯仿：异戊醇(25:24:1=300:288:12)，混匀，1rpm，离心15min，吸上清，装入一新EP管。加入500ul氯仿：异戊醇（24:1=576:24），1rpm。离心15min吸上清，转入一新离心管中。加入1/10体积NaAc（3mol/l），1ml-20预冷无水乙醇，反复颠倒多次，混匀后置于-20（-80，30min）3-4h，1rpm，10min弃上清。向离心管中加入75%乙醇洗涤2-3次，置于吸水纸上倒置晾干。加入DEPC H2O（30ul）溶解。1.2.2.2试剂盒提取总RNA 参见试剂盒阐明书。1.2.3 反转录 按照试剂盒阐明进行反转录。1.2.4 梯度PCR扩增内参以反转录产物为模板，进行单一PCR扩增。10PCR缓冲液4ulMgCl21.2uldNTP0.4ul引物ActinF/ActinR1ulTaq酶0.5ul反转录产物0.5ul总体积补足双蒸水至20ul反应程序：预变性942min; 9430s；50-5540s；681min, 35个循环；72延伸5min。1.2.5 多重RT-PCR1.2.5.1 双重RT-PCR扩增SCV10PCR缓冲液4ulMgCl21.2uldNTP0.4ul引物ActinF/ActinR0.5ulSCVF/SCVR0.5ulTaq酶0.5ul反转录产物0.5ul总体积补足双蒸水至20ul反应程序：预变性942min; 9430s；5540s；681min, 35个循环；72延伸5min。1.2.5.2 三重RT-PCR扩增其他三个病毒10PCR缓冲液4ulMgCl21.2uldNTP0.4ul引物SMoVF/SMoVR0.72ulSVBVF/SVBVR1ulSMYEVF/SMYEVF0.6ulTaq酶0.5ul反转录产物0.5ul总体积补足双蒸水至20ul反应程序：预变性942min; 9430s；5540s；681min, 35个循环；72延伸5min。2 成果与分析2.1 总核酸分离和电泳检测采用试剂盒提取总核酸，包括总DNA和总RNA。从琼脂糖凝胶电泳成果可以看出（如图1），DNA条带及RNA28S、18S和5S条带均能看到，这阐明总RNA没有发生降解，完整性很好。2.2 内标RT-PCR以ActinF/ActinR为引物，采用草莓品种反转录产物为模板，梯度PCR扩增，筛选出53度为最佳退火温度，扩增出了预期295 bp大小特异片段(图2),阐明Actin基因存在于草莓中，该基因适合作为草莓RNA病毒检测内标。以此基由于内标，首先可以排除假阴性成果干扰，另首先可以深入检测RNA质量，提高了检测成果精确性。2.3多重RT-PCR以ActinF/ActinR、SCVF/SCVR两对引物首先扩增疑似皱缩病毒，扩增条件同Actin基因，两个植株扩增出大小为345bp特异片段（图3），阐明检测出SCV病毒，此前预估带有此病毒推测是对。同步，以此外三种病毒引物继续扩增cDNA，确定植株与否尚有其他病毒侵染，成果检测出片段大小278bp条带，阐明存在镶脉病毒侵染（图4），因此疑似植株可确定为皱缩病毒和镶脉病毒复合侵染，与文献中所述：皱缩病毒一般与草莓镶脉病毒（SVBV）复合侵染说法一致。 M 1 2 3 4 5 6 5s18s28s图1 总核酸提取295bp图2 6个植株内参actin 扩增 图4 其他3引物扩增 M: marker 1，2:SVBV扩增条带M 1 2278bp(SVBV)M A1 A2 S1 S2345bp(SCV)295bp（actin）图3 actin/SCV引物扩增M: markerA1,A2:actin扩增条带S1，S2：SCV扩增条带 3 讨论3.1与改善CTAB法提取RNA 相比，本研究采用试剂盒提取，措施简朴，时间只需半小时，提取效果也比改善CTAB法好，并且改善CTAB法提取配制试剂复杂，准备工作耗时长，对所用耗材及试剂规定均必须清除RNA酶污染，提取时间需要一天，提取过程也较繁琐，一批次提取样品，提取效果均一性不好，有样品提取条带完整，有则不太好，这阐明提取过程稍不注意，则会RNA酶污染，影响了提取效果。3.2 植物病毒检测体系中引入内标可增长试验可靠性，可减少假阴性出现。本研究中起初设计了NADH脱氢酶基由于内参，合成引物后，通过多次条件探索，一直扩增不出内参条带，之后换成actin内参引物，通过梯度PCR扩增，一次便成功扩增出条带，本研究最终选择此基因作为内参，扩增效果很好，健康植株与带毒试材均可良好扩增，阐明此内标相对稳定。3.3 多重PCR扩增受诸多原因影响，本研究首先以疑似病毒引物和内参引物做双重PCR扩增，保证了样本RNA质量可靠性，同步验证了疑似病毒检测成果，二次试验再进行三引物PCR扩增，以排除其他病毒侵染，两次试验便可保证试验精确无误，防止了单一引物扩增繁琐性，因此，通过多重RT-PCR扩增可缩短试验时间，减少试剂耗材损耗，到达了省时省力功能。同步，本研究在试验过程中尝试了一步法RT-PCR进行扩增，此措施可节省更多时间和试验环节，但此措施中间过程不好控制，并且反复性不好，因此，没有得到很好试验成果，最终还是选择两步法PCR更能保证试验精确性。参照文献1 王国平.我国草莓病毒种类鉴定研究初报J.中国果树，1988,(2):32-34.2 肖君泽,黄益鸿,姜放军，等.草莓病毒病及其脱毒与检测技术研究进展J.江西农业学报, , 22(8): 88-90.3 常琳琳，张志宏.草莓病毒简朴、迅速PCR检测J.草莓研究进展（三），,83-88.4 杨洪一，张志宏，李丽丽，等.运用多重RT-PCR技术检测草莓病毒研究J.植物病理学报，,37(5):549-552.5 随春，吴禄平，张志宏.运用PCR技术检测草莓镶脉病毒J.园艺学报，,30(1):82-84.6朱海生,花秀凤,陈敏氡,等.四种草莓病毒SMoV、SVBV、SCV、SMYEV多重RT-PCR检测J.核农学报,，27(11):1630-1635.7张志宏,杨洪一,代红艳,等.应用多重RT-PCR检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒J.园艺学报,33 (3): 507-510.8王红，王菁菁，张科立，等.运用内标为基础多重T-PC 技术检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒J浙江农业学报,26(1):105-1099杨洪一，张志宏女，杜国栋，等.运用内标为基础RT-PCR技术检测草莓斑驳病毒J.植物病理学报, ,35(2)：116-122.10陈晓军, 王敬东, 马洪爱,等.运用RT- PCR 对脱毒草莓苗病毒检测研究.北方园艺,(23) :146-148.基金项目：新疆生产建设兵团科技支疆计划项目，项目编号：AB006。作者简介：史芳芳（1977-），女，硕士硕士,助理研究员。研究方向：植物基因工程。现从事植物组织培养及农业技术推广工作，。邮箱：单位：新疆兵团第十二师农业科学研究所地址：乌鲁木齐市头屯河区崇五路48号，830088