酶工程重点专业资料.doc

第二部分 考核内容与考核目的第一章 酶工程基础一、学习目的与规定规定学生识记酶工程的定义、研究内容及学科的发展历程。了解酶工程的发展方向和趋势。二、考核知识点与考核目的1、 重点酶工程的定义（识记）酶工程:酶的生产.改性与应用技术过程酶工程（ Enzyme Engineering）即运用酶的催化作用，在一定的生物反映器中，将相应的原料转化成所需的产品酶工程的应用范围1对生物宝库中存在天然酶的开发和生产2酶的分离纯化及鉴定技术3酶的固定化技术(酶和细胞固定化)4酶反映器的研制和应用5与其他生物技术领域的交叉和渗透.其中固定化酶技术是酶工程的核心.事实上有了酶的固定化技术,酶在工业生产中的运用价值才真正得以体现酶工程的研究内容（识记）。酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术，它的应用重要集中于食品工业、轻工业和医药工业等领域。 对生物宝库中存在天然酶的开发和生产； 自然酶的分离纯化及鉴定技术； 酶的固定化技术（酶和细胞固定化）； 酶反映器的研制和应用； 与其他生物技术领域的交叉和渗透；2、 次重点酶工程的发展方向和趋势（理解）酶在生物技术领域的用途:用酶除去细胞壁,如用溶菌酶除去细菌细胞壁;酶在大分子切割方面应用,如限制性内切核酸酶.DNA外切核酸酶;酶在分子拼接方面的应用，如DNA连接酶、DNA聚合酶第二章 酶的发酵工程一、学习的目的与规定规定学生掌握酶生物合成的诱导作用、酶生物合成的反馈阻遏作用。掌握酶发酵工艺条件及其控制，理解酶发酵动力学。酶的发酵生产:通过预先设计,通过人工操作,运用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程,称为酶的发酵生产液体深层发酵:采用液体培养基,置于生物反映器中,通过灭菌,冷却后,接种产酶细胞,在一定的条件下,进行发酵,生产得到所需的酶,液体深层发酵不仅适合于微生物细胞的发酵生产,也可用于植物细胞和动物细胞的培养,液体深层发酵的机械化限度高,技术管理较严格,酶的产率较高,质量较稳定,产品回收率高,是目前酶发酵生产的重要方式酶的发酵生产根据微生物的培养方式可分为:固体培养发酵.液体深层发酵.固定化微生物细胞发酵和固定化微生物原生质体发酵提高酶产量的措施有哪些一方面要选育或选择使用优良的产酶细胞,打破酶合成调节限制的方法:1通过条件控制提高酶产量:添加诱导物.减少阻遏物浓度2通过基因突变提高酶产量:使诱导型变为组成型,使阻遏型变为去阻遏型3其它提高酶产量的方法:添加表面活性剂.添加产酶促进剂二、考核知识点与考核目的共阻遏物:酶催化作用的产物或代谢物途径的末端产物使该酶的生物合成受阻.引起反馈阻遏的物质,称为共阻遏物1、重点（1）分解代谢物的阻遏作用（应用）是由分解代谢物（葡萄糖和其他容易运用的碳源等物质通过度解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。或当微生物细胞所处的环境中，同时存在可供运用的两种底物时，一种先被运用或运用较快的底物会阻遏与另一种底物有关酶的合成称为分解代谢产物阻（2）酶生物合成的诱导作用（应用）诱导是酶促分解底物或产物诱使微生物细胞合成分解代谢途径中有关酶的过程。诱导的结果通常会使细胞产生相应的诱导酶影响酶生物合成模式的因素重要是什么mRNA的稳定性和培养基中存在的阻遏物:mRNA稳定性高的,可以在细胞停止生长后继续合成相应的酶;mRNA稳定性差的,随着细胞生长停止而终止酶的合成;不受阻遏物阻遏的,可随着细胞生长而开始酶的合成;受阻遏物阻遏的,要在细胞生长一段时间或进入稳定期后解除阻遏,才干开始酶的合成（3）酶生物合成的反馈阻遏作用（应用）又称反馈阻遏作用，是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。或由于某代谢途径中的末端产物过量累积而引起酶合成的阻遏（反馈），2、次重点（1）发酵工艺条件及控制方法（应用）一.菌种的获取 （1.产酶的菌种收集2.富集培养3.菌种纯化4.高产菌株的选育 1）诱变育种 ，2）基因重组育种 细胞杂交技术 原生质体融合 重组DNA技术）二.细胞活化与扩大培养 （活化：使用以前，必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定条件下进行培养，以恢复细胞的生命活动能力 扩大培养：增长发酵时的数量，通过一级至数级扩大培养。培养基称为种子培养基）三、培养基的配制（培养基：人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。培养基设计考虑：菌种特性不同培养阶段产物 原料来源难易培养基的基本组分：碳源 氮源 无机盐 生长因子）四、 pH值调节（pH控制 ：初级调节控制（起始培养基）调整C/N，调整生理酸性物质与生理碱性物质之比。补料调节：流加酸/碱，补加碳、氮源溶解氧调节：控制代谢中间产物的氧化限度。维持一定的pH值，添加缓冲液）五、温度的调节（最适生长温度：枯草杆菌3437， 黑曲霉2832，植物细胞25。控制温度方式：加冷、热水，换热装置如夹套，盘管、喷淋管等。）六、溶解氧的调节(调节溶氧速率的方法： 调节通气量。 调节氧的分压：富氧 增长空气压力。 调节气液接触时间：增长液位高度，增设档板。 调节气液接触面积：提高搅拌速率，空气分布管及其及直径 培养液的特性：粘度、表面张力)七、提高酶产量的方法(打破酶合成调节限制的方法：1、通过条件控制提高酶产量：1）添加诱导物 , 同一种酶往往能被多种诱导物 ,同一种诱导物酶也能诱导多种酶 ,诱导物一般可分为3类：酶的作用底物、酶的反映产物、酶的作用底物的类似物（最有效）;2）减少阻遏物浓度。2、添加表面活性剂3、添加产酶促进剂)简述固定化细胞发酵产酶的特点以及工艺条件的控制优点:提高产酶率;基因工程菌的质粒稳定,不易丢失;不溶于水,易于与产物分离纯化;可反复使用或连续使用较长时间;可连续化生产;发酵稳定性好;合用于胞外酶等胞外产物的生产;缩短发酵周期,提高设备运用率.缺陷:固定化过程中往往会引起酶的失活工艺条件控制:固定化细胞的预培养(为了使固定化细胞生长良好,预培养应当采用适合细胞生长的生长培养基和工艺条件然后改换成适合产酶的发酵培养基和发酵工艺条件)溶解氧的供应(必须增长溶解氧的量才干满足细胞生长和产酶需要)温度的控制(一般培养液在进入反映器之前，必须预先调节至适应的温度)培养基组分的控制(固定化细胞好氧发酵过程中,溶解氧的供应时关键限制性因素,为了有助于氧的溶解和传递,培氧基的浓度不宜过高,特别是培养基的年度应尽量低一些好)3、一般产酶动力学（理解）酶生物合成模式有哪些同步合成型:又称生长偶联型,是指酶合成与细胞生长同步进行,当细胞生长进入对数期时,酶也大量合成;当细胞进入稳定期时,酶的合成也停止.该类型酶的生物合成可以有其诱导生成,不受分解代谢物的阻遏和产物的反馈阻遏作用,mRNA很不稳定延续合成型:酶的合成随着着细胞生长而开始，但在细胞生长进入稳定期后,酶的合成仍将延续较长一段时间.酶的生物合成可以受诱导物的诱导,不受分解代谢物阻遏,mRNA相称稳定中期合成型:酶的合成在细胞生长一段时间后才开始,而在细胞生长进入稳定期后,酶的合成也终止.酶的生物合成受到产物反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用,mRNA稳定性较差滞后合成型:只有当细胞生长进入稳定期后才开始酶的合成并大量积累,重要受培养基中存在的阻遏物的阻遏作用,mRNA稳定性较好第三章 酶的分离工程实际应用中,对酶的分离纯化技术具有哪些规定1条件温和,特别是对具有生物活性的物质,在后期解决过程中必须保持其生物活性2分离纯化技术的选择性好.专一性强,能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来3目的产物的量和活性具有较高的收率4在提高单个分离技术的效率的同时,注意各操作间的有效组合和整体协调,以减少工艺过程的环节5快速,以提高生产能等密度梯度离心:当欲分离的不同颗粒的密度范围处在离心介质的密度范围内时,在离心力作用下,不同浮力密度的颗粒或向下沉降,或向上漂浮,只要时间足够长,就可以一直移动到与它们各自的浮力密度恰好相等的位置,形成区带,这种方法称为等密度梯度离心分离:需要通过凝胶层析等方法进行分离,将具有不同修饰度的酶分子分开,从中获得具有较好修饰效果的修饰酶离心分离:离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力,使不同大小.不同密度的物质分离的技术过程密度梯度离心:是样品在密度梯度介质中进行离心,使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法.常用的梯度介质有蔗糖.甘油等酶的分离纯化:是采用各种生化分离技术,诸如:离心分离.过滤与膜分离.萃取分离.沉淀分离.层析分离.电泳分离.以及浓缩.结晶.干燥等,使酶与各种杂质分离,达成所需的纯度,以满足使用的规定学习目的与规定规定学生掌握酶的分离纯化的整个流程以及各个操作单元的特点。一、 考核知识点与考核目的1、 重点（1） 酶的分离纯化的流程（理解）酶的精制（应用）（酶的精制）制剂（preparation）：是要将纯化的酶作成一定形式的制剂。酶制剂是指从生物中提取的具有酶特性的一类物质，重要作用是催化食品加工过程中各种化学反映，改善食品加工方法。（2）2、 次重点（1） 酶的膜分离技术（应用）膜分离技术:借助于一定孔径的高分子薄膜,将不同大小.不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程,近似于筛分过程,依据滤膜孔径大小而达成物质分离的目的,故而可以按分离粒子大小进行分类:微滤,超滤,反渗透虑,纳滤,电渗析反渗透:是一种以压力差为推动力,从溶液中分离出溶剂的膜分离操作,孔径范围在 20;(由于分离的溶剂分子往往很小,不能忽略渗透压的作用,故而成为反渗透)电渗析技术:电渗析技术是在直流电场的作用下,由于离子互换膜的阻隔作用,实现溶液的淡化和浓缩,分离推动力是静电引力电渗析:以电位差为推动力，运用离子互换膜的选择透过性，从溶液中脱除或富集电解质的膜分离操作；电渗现象:一个U形管的底部装上一块素烧瓷板（密封）管中装入液体，并在两端加入电极通电，就会看到负极的液面上升。由于瓷板带有负电荷，液体相对地带有正电荷，因而向负极移动。这种液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象（2） 酶的沉淀分离技术（应用）沉淀分离:是通过改变某些条件或添加某些物质,使酶的溶解度减少,从溶液中沉淀析出与其他溶质分离的技术过程沉淀分离的一般操作环节是什么在通过滤或离心后的样品中加入沉淀分离剂;沉淀物的陈化,促进晶体生长;离心或过滤,收集沉淀物常用蛋白质沉淀方法有哪些特点:操作简朴.经济.浓缩倍数高.种类:盐析沉淀法.等电点沉淀法.有机溶剂沉淀法.复合沉淀法.选择性变性沉淀法等.缺陷:针对复杂体系而言,分离度不高,选择性不强盐析沉淀法:在高浓度的中性盐存在下,蛋白质类酶在水溶液中的溶解度减少，产生沉淀的过程盐析操作时常用的盐是什么通常采用中性盐,有硫酸铵,硫酸钠,硫酸钾,硫酸镁,氧化钠和磷酸钠等,其中硫酸铵最为常用,只是由于硫酸铵在水中的溶解度大并且温度系数小,不影响酶的活性,分力效果好,并且便宜易得然而用硫酸铵进行盐析是,缓冲能力较差，并且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定,所以有时也用其他中性盐进行盐析影响盐析的重要因素有哪些质种类的影响:Ks和值;溶质浓度的影响:蛋白质浓度大,盐的用量小,但共沉作用明显,分辨率低;蛋白质浓度小,盐的用量大,分辨率高;pH值:影响蛋白质表面净电荷的数量,通常调整体系pH值,使其在pI附近;盐析温度:大多数情况下,高盐浓度下,温度升高,其溶解度反而下降有机溶剂沉淀法:在具有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂,减少溶质的溶解度，使其沉淀析出有机溶剂沉淀法的原理是什么？影响有机溶剂沉淀的重要因素有哪些原理:1减少了溶质的介电常数,使溶质之间的静电引力增长,从而出现聚集现象,导致沉淀2由于有机溶剂的水合作用,减少了自由水的浓度,减少了亲水溶质表面水化层的厚度,减少了亲水性,导致脱水凝聚 特点:分辨率高;溶剂容易分离,并可回收使用;产品洁净;容易使蛋白质等生物大分子失活;应注旨在低温下操作;成本高影响因素:1温度:低温有助于防止溶质变性;有助于提高收率(溶解度下降)2搅拌速度:散热3溶液pH值:原则是避免目的蛋白与杂质带有相反的电荷,防止共沉现象4（pI）；离子强度:离子强度低有助于沉淀,0.010.05mol/L;5样品浓度:0.52%稀:溶剂用量大,回收率低,但共沉淀作用小,浓:节省溶剂用量,共沉淀作用强,分辨率低6金属离子的助沉淀作用:Zn2+、Ca2+等电点沉淀的工作原理是什么蛋白质是两性电解质,当溶液pH值处在等电点时,分子表面净电荷为0,双电层和水化膜结构被破坏,由于分子间引力,形成蛋白质聚集体,进而产生沉淀等电点沉淀法:调节体系pH值,使两性电解质的溶解度下降,析出的操作称为等电点沉淀3、 一般（1）细胞分离（识记）细胞分离就是通过物理、生物、化学的方法，将生物组织分离为单细胞分散系的过程。（2）细胞破碎和酶提取（识记）细胞破碎法:机械法(捣碎.研磨.匀浆).物理法(温度差.压力差.超声波).化学法(添加有机溶剂.表面活性剂).酶促法(自溶法.外加酶制剂法)等酶的提取:是指在一定的条件下,用适当的溶剂或溶液解决含酶原料,使酶充足溶解到溶剂或溶液中的过程.也称为酶的抽提提取分离法:是采用各种提取.分离.纯化技术从动物.植物的组织.器官.细胞或微生物细胞中将酶提取出来,再进行分离纯化的技术过程酶的重要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.020.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或具有较多非极性基团的酶影响提取的因素:温度.PH.提取液体积第四章 固定化酶与固定化细胞一、学习目的与规定规定学生掌握酶和菌体固定化的方法，了解固定化酶和菌体的应用情况。二、考核知识点与考核目的1、重点酶和菌体固定化的方法（应用通常采用的固定化方法可大体概括为：吸附法、结合法、交联法、包埋法热解决法如何选择酶的固定化方法1必须注意维持酶的催化活性及专一生,保持酶原有的专一性.高效催化能力和在常温常压下能起催化反映的特点2固定化应当有助于生产自动化.连续化3固定化酶应有最小的空间位阻,尽也许不妨碍酶与底物的接近,应不会引起酶的失活,以提高产品的产量4酶与载体必须结合牢固,从而使固定化酶能回收贮藏,利于反复使用5固定化酶应有最大稳定性,在制备固定化酶时,所选载体不与废物.产物或反映液发生化学反映6固定化酶应易与产物分离,即能通过简朴的过滤或离心就可回收和反复使用7固定化酶成本要低,须综合考虑固定化酶在总成本中的比例,应为便宜的.有助于推广的产品,以便于工业使用8充足考虑到固定化酶制备过程和应用中的安全因素）菌体固定化的方法吸附法、包埋法菌体细胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法，重要有包埋法、吸附法和不用载体法（加热固定化）等2、次重点固定化酶的性质（识记）固定化酶的性质:固定化对酶活性的影响.固定化对酶稳定性的影响.最适pH的变化.最适温度变化.底物特异性与游离酶不同.米氏常数Km的变化影响固定化酶性质的因素:酶自身的变化.载体的影响.固定化方法的影响固定化酶活性损失的因素:酶自身的失活.酶从载体上脱落.载体的破碎或溶解什么是酶的活性中心？其构成有什么特点通常将氨基酸集中的.与酶活性相关的区域称为酶的活性中心.构成酶的活性中心的氨基酸残基重要是接触残基和辅助残基,构成酶的活性中心的各基团在空间构象上的相对位置对酶活性是至关重要的,维持酶的活性中心构象重要依赖于酶分子空间结构的完整性细胞活化:保藏的菌种在发酵生产之前,必须接种于新鲜的固体培养基上,在一定的条件下进行培养,使细胞的生命活性得以恢复,此过程称为细胞活化固定化酶:与水不溶性载体结合,在一定的空间范围内起催化作用的酶.优点:纯化简朴,提高产物质量,应用范围广,多次使用,可以装塔连续反映.缺陷:初次投入成本高大分子底物较困难.方法:吸附法.包埋法(凝胶/半透膜包埋法).结合法(离子键/共价键结合法)交联法.热解决法固定化细胞:固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞.固定化细胞能进行正常的生长.繁殖和新陈代谢,又称固定化活细胞或固定化增殖细胞.方法:吸附法.包埋法固定化酶有哪些优点1极易将固定化酶与底物,产物分开2可以在较长时间内进行反复分批反映和装柱连续反映3在大多数情况下,可以提高酶的稳定性4酶反映过程可以加以严格控制5产物溶液中没有酶的残留.简化了提纯工艺6较游离酶更适合于多酶反映7可以增长产物收率,提高产物质8酶的使用效率提高,成本减少辅酶的固定化选择载体时要注意些什么没有特异性吸附;具有多孔性;有适合引入配基的官能团;化学稳定性;具有适当的机械强度等为什么固定化后酶的稳定性得以提高1固定化后酶分子与载体多点连接，增长了酶活性构象的牢固限度.可防止酶分子伸展变形;2阻挡了不利因素对酶的侵袭3将酶与固态载体结合后.限制了酶分子间的互相作用.使酶失去了互相作用的机会.从而克制了降解固定化微生物细胞发酵的特点1细胞密度大,可提高产酶能力2发酵稳定性好,可以反复使用或连续使用较长的时间3细胞固定在载体上,流失较少,可以在高稀释率的条件下连续发酵,利于连续化,自动化生产4发酵液中含菌体较少,利于产品分离纯化,提高产品质量等固定化微生物原生质体发酵具有特点1固定化原生质体由于除去了细胞壁这一扩散屏障,有助于胞内物质透过细胞膜分泌到细胞外.可以使本来属于胞内产物的胞内酶等分泌德奥细胞外,这样就可以不通过细胞破碎和提取工艺直接从发酵液中分离得到所需的发酵产物,为胞内酶等胞内物质的工业化生产开辟崭新途径2采用固定化原生质体发酵，是本来存在于细胞间质中的物质,游离到细胞外,变为胞外产物3固定化原生质体由于有载体的保护作用，稳定性较好，可以连续或反复使用较长的一段时间,然而固定化原生质体的制备较复杂,培养基中需要维持较高的渗透压，还要防止细胞壁的再生等都是有待研究解决的课题3、一般固定化酶和菌体的应用（应用）固定化酶在工业生产中的应用：氨基酰化酶 世界上第一种工业化生产的固定化酶；离子键结合固定 葡萄糖异构酶 世界上生产规模最大的一种固定化酶。（热解决法固定）天门冬氨酸酶 青霉素酰化酶 延胡索酸酶b-半乳糖苷酶 天门冬氨酸-b-脱羧酶第五章 酶分子化学修饰一、学习目的与规定规定学生掌握酶化学修饰的原理和方法，掌握抗体酶的理论及其制备过程。了解模拟酶的理论基础。修饰:将带有活化基团的大分子修饰剂与通过度离纯化的酶液,以一定的比例混合,在一定的温度.pH值等条件下反映一段时间,使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合,对酶分子进行修饰酶分子修饰:通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰.即:在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团(物质),特别是具有生物相容性的物质,进行共价连接,从而改变酶的结构和性质.其生物学意义提高酶的活力;增强酶的稳定性;减少或消除酶的抗原性;研究和了解酶分子中主链.侧链.组成单位.金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响二、考核知识点与考核目的1、重点（1）酶分子侧链基团修饰和酶分子表面修饰的原理（理解）大分子结合修饰:使用一些能与酶非共价地互相作用而又能有效地保护酶的一些添加物,如聚乙二醇.右旋糖苷等,它们既能通过氢键固定在酶分子表面,也能通过氢键有效地与外部水相连,从而保护酶的活力金属离子置换修饰:把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子,使酶的催化特性发生改变的修饰方法金属离子置换修饰过程和作用:过程:1酶的分离纯化2除去原有的金属离子3加入置换离子作用:1阐明金属离子对酶催化作用的影响2提高酶催化效率3增强酶稳定性4改变酶的动力学特性（2）抗体酶的理论基础（理解）抗体酶:又称催化性抗体,是一类具有生物催化功能的抗体分子,抗体酶同时具有抗体的高度特异性以及酶的高效催化能力,它是通过人工设计,采用现代生物技术而获得的一类新的生物催化,抗体酶的制备方法,重要有诱导法,修饰法2、次重点模拟酶的理论基础（理解）根据属性.模拟酶可分为哪几种类型1主客体酶模型2胶束酶模型3肽酶4抗体酶5分子印迹酶模型6半合成酶等模拟酶:是在分子水平上模拟酶活性中心的结构特性和催化作用基质,设计并合成的防酶体系半合成酶:是以天然蛋白或酶为母体,用化学或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团,或改变其结构从而形成一种新的“人工酶”分子印迹酶:通过度子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔,对底物产生有效的结合作用,同时在结合部位的空腔内诱导产生催化基团,并与底物定向排列,制备出人工模拟酶分子印迹酶有什么优点:目前所选择的印迹分子有哪些优点:通过度子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔,对底物产生有效的结合作用,同时在结合部位的空腔内诱导产生催化基团,并与底物定向排列印迹分子:底物.底物类似物.酶克制剂.过渡态类似物以及产物等酶化学修饰、模拟酶以及抗体酶的应用（应用）3、一般酶化学修饰的方法（识记）酶分子修饰涉及金属离子置换修饰.大分子结合修饰.侧链基团修饰.肽链有限水解修饰.核苷酸链有限水解修饰.氨基酸置换修饰.核苷酸置换修饰和酶分子的物理修饰修饰剂的选择:大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子.例如,聚乙二醇(PEG).右旋糖酐.蔗糖聚合物(Ficoll).葡聚糖.环状糊精.肝素.羧甲基纤维素.聚氨基酸等.要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子酶分子有哪些侧链基团，可以发生哪几种修饰反映基团:氨基,羧基,巯基,咪唑基,酚基,吲哚基,胍基,甲硫基等;修饰反映:酰化反映.烷基化反映.氧化和还原反映.芳香环取代反映等采用大分子物质进行酶修饰有哪些常见方法？常用的大分子物质有哪些常见方法:溴化氰法.高碘酸氧化法.戊二醛法.叠氮法.琥珀酸法和三氯均嗪法等;常用大分子:聚乙二醇/右旋糖酐.糖肽.肝素.血清白蛋白等修饰剂的活化:作为修饰剂中具有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反映而结合在一起.在使用之前一般需要通过活化,然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反映 在进行酶的化学修饰时,如何对修饰反映的专一性进行控制 1修饰剂的选择:修饰剂的选择在很大限度上要依据修饰目的而定.不同的修饰目的对修饰剂也有不同的规定/用于修饰酶活性部位的氨基酸残基的试剂应具有以下一些特性:选择性地与一个氨基酸残基反映;反映在酶蛋白不变性的条件下进行;标记的残基在肽中稳定.很易通过降解分离出来.进行鉴定;反映的限度能用简朴的技术测定.2反映条件的选择:酶与修饰剂作用所规定的反映条件，除允许修饰能顺利进行外,还必须满足如下规定:一是不导致蛋白质的不可逆变性;二是有助于专一性修饰酶蛋白.3反映的专一性:在酶的化学修饰研究中,反映的专一性非常重要.若修饰剂专一性较差,除控制反映条件外,还可运用酶分子中某些基团的特殊性.选择不同的反映pH.某些产物的不稳定性.亲和标记.差别标记.蛋白质状态的差异等途径来实现修饰的专一性抗体酶的制备过程（理解）抗体酶的制备过程1)、过渡态类似物（半抗原）的构建 由于激发态的过渡态分子不也许作为抗本来产生抗体。但根据酶的作用机制，针对酶催化的化学反映，人们可以合成一种稳定态的分子，它在带电性能，几何形状与反映过渡态分予结构类似，这种稳定态分子称为过渡态类似物。2)、抗原的制备 由于抗原在分子量上有一定规定，所以一般将人工设计并构建的过渡态类似物类似物作为半抗原，用化学方法经间隔基与载体蛋白相连，形成一个抗原。3)、抗体酶的获得用人工合成的抗原免疫动物，通过筛选得到能与过渡状态结合，使过渡状态稳定的抗体，制备抗体酶的方法有哪些1拷贝法2引入法3诱导法4抗体与半抗体互补法5熵阱法6多底物类似物法7抗体库法第七章 核酶一、学习目的与规定规定学生掌握核酶的基本概念和分类，了解核酶的应用前景。在医学领域中的应用：1. 通过辨认特定位点而克制目的基因的表达，克制效率高，专一性强。2. 免疫源性低，很少引起免疫反映。3. 针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运二、考核知识点与考核目的核酶的概念和分类（识记）核酶：由于这类酶具有类似核糖核酸酶功能，而化学本质为核酸，因此被切赫称之为核酶。 核酶（ribozyme）泛指一类具有催化功能的RNA分子。一般是指无需蛋白质参与或不与蛋白质结合，就具有催化功能的RNA分子。核酶（ribozyme）的分类剪切型核酶剪接型核酶根据催化反映锤头核酶I内含子II内含子发夹核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP剪切型核酶：这类核酶的作用是只剪不接，催化自身RNA或不同的RNA分子，切下特异的核苷酸序列。剪接型核酶指RNA分子被磷酸二酯酶水解切割后，随着着形成新的磷酸二酯键，即磷酸二酯键的转移反映或称转酯反映。脱氧核酶:脱氧核酶都是单链DNA分子通过自身卷曲.折叠形成的三维结构,在某些特殊的辅助因子的作用下与底物结合并发挥催化功能第七章 非水相酶催化一、学习目的与规定规定学生掌握非水介质中的酶催化理论，了解有机介质对酶催化的影响。必需水:在有机介质中,酶分子需要一层水化层以维持其完整的空间构象,一般将维持酶分子完整空间构象所必须的最低水含量称为必需水水对非水相中酶的特性有何影响1水对酶的空间构象的影响:酶分子只有在空间构想完整的状态下才具有催化功能,在无水的条件下,酶的空间构象被破坏,酶将变性,所以酶分子需要一层水化层来维持空间构象2水对酶催化反映的速度的影响:有机介质中水的含量对此有显著影响,在催化反映速度达成最大是的含水量称为最适含水量,有些酶在水含量较低的条件下,没的催化速度水水含量升高而升高3在有机介质体系中,酶的催化活性随着结合水量的增长而提高,在结合水不变时,体系中含水量的变化对酶的催化活性影响大.用于酶催化的非水介质重要有哪几种1含微量水的有机溶剂2与水混溶的有机溶剂和水形成的均一体系;3.水与有机溶剂形成的两相或多相体系4胶束和反胶束体系;5.超临界流体;6.气相二、考核知识点与考核目的1、重点（1）非水介质中的酶催化理论（理解）有机介质中的酶催化 有机介质中的酶催化是指酶在具有一定量水的有机溶剂中进行的催化反映。合用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于可以基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以可以发挥其催化功能。 气相介质中的酶催化 酶在气相介质中进行的催化反映。合用于底物是气体或者可以转化为气体的物质的酶催化反映。 由于气体介质的密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。 超临界介质中的酶催化酶在超临界流体中进行的催化反映。超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。离子液介质中的酶催化 酶在离子液中进行的催化作用。离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用品有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。 简述酶非水相催化的概念与特点酶在非水介质中的催化作用称为酶的非水相催化.它是通过改变反映介质,影响酶的表面结构和活性中心,从而改善酶的催化特性。重要内容涉及有机介质中的酶催化,气象介质中的酶催化,超临界流体介质中的酶催化和离子液介质中的酶催化等.由于在非水相介质中酶分子受到非水介质的影响,起催化特性与在水相中的有较大的不同.酶在有机溶液中的热稳定性比在水溶液中有显著地提高,并且催化时,酶的底物特异性.立体选择性.区域选择性.健的选择性和热稳定性都有所改变,同时酶在离子液中的催化作用品有良好的稳定性和区域选择性.立体选择性健的选择性等特点,非水介质中的酶催化反映有哪些特点1可进行水不溶或水溶性差化合物的催化转化,大大拓展了酶催化作用的底物和生成产物的范围2改变了催化反映的平衡点,使在水溶液中催化水解反映的酶在非水介质中可有效催化合成反映的进行3使酶对涉及区域专一性和对映体专一性在内的底物专一性大为提高，使对酶催化作用的选择性的调控有也许实现4大大提高了一些酶的执稳定性5由于酶不溶于大多数的有机溶剂,使催化后酶易于回收和反复运用6可有效减少或防止由水引起的副反映的产生7可避免杂水溶液中的进行长期反映时微生物引起的污染8可方便地运用对水分敏感的底物进行相关的反映9当使用挥发性溶剂作为介质时,可使反映后的分离过程能耗减少。2、次重点（1）酶在有机介质中的催化特点（理解）酶在有机介质中与在水溶液中的特点有何改变1底物专一性:酶在水溶液中进行催化反映时,具有高度的专一性或底物特异性.在有机介质中,由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生了变化,使酶的底物特异性发生改变.2对映体选择性：酶在有机介质中催化,由于介质的特异性改变引起酶的对映体选择性发生改变,酶在水溶液中催化的立体选择性强,而在疏水性强的有机介质中，酶的立体选择性差3区域选择性:酶可以选择底物分子中某一区域的基因优先进行反映4健的选择性:在有机介质中,当同一底物分子中有两种以上的化学键都可以与酶反映时,酶对其中一种化学键优先进行反映5热稳定性:在有机介质中热稳定性比在水溶液中好,由于含水量低的有机介质缺少引起酶分子6 PH特性:在水溶液中,缓冲液的PH决定了酶分子活性中心基因和底物的解离状态,从而影响反映.在有机介质中,酶所处的PH环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液PH相同（2）有机介质对酶催化的影响（理解）有机溶剂对酶催化有何影响1对酶结构和功能的影响:酶分子表面结构发生变化,对酶活性中心结合位点也有影响.重要是通过有机溶剂与底物竞争活性中心的结合位点或减少活性中心的的极性来影响与底物结合能力2对酶活性的影响:极性较强的有机溶剂会影响酶分子微环境的水化层从而减少催化活性,甚至引起变性失活3对底物和产物分派有影响:有机溶剂极性过大或多小都会影响底物的浓度从而影响酶的催化速度.如何控制有机介质中酶催化反映的条件1对酶的选择不仅要看催化反映速度大小,还要注意没的稳定性,底物专一性,对映体选择性,区域选择性,键选择性等.2对底物的选择和浓度控制:必须考虑底物在有机溶剂和必须水层中的分派情况3选择适宜的有机溶剂:它的极性不能过强或过弱4控制好水的含量:使反映体系保持在最适水含量5温度的选择最佳在最适温度6 PH:保持在最适PH,通过调节缓冲液的PH和离子强度来实现对有机介质中的酶催化的PH和离子强度的调节第十章 酶克制剂一、学习目的与规定规定学生掌握酶克制剂的概念、作用机制及其应用。二、考核知识点与考核目的1、重点（1）酶克制剂的概念、种类（识记）酶的克制剂:可以使酶的催化活性减少或者丧失的物质,在克制剂作用下,酶的催化活性减少甚至丧失,从而影响没的催化功能,有可逆和不可逆克制剂,酶的可逆克制剂分为竞争性克制,非竞争克制,反竞争克制竞争性克制:指克制剂和底物竞争与酶分子结合而引起带的克制作用,它与酶作用底物的结构相似,与酶分子结合以后,底物分子就不能与酶分子结合,从而对酶的催化到克制作用非竞争性克制:克制剂与底物分别于酶分子上的不同点结合而引起酶活性减少的克制作用反竞争性克制:在底物与酶分子结合生成中间复合物后,克制剂在于中间复合物结合而引起的克制作用靶酶:在生物体内新陈代谢过程中进行的多种化学反映几乎都是在酶的催化下,以一定的速度.按拟定的方向进行的.其中的每一种酶都有一些特定的克制剂,通常将这种酶称为该克制剂的靶酶（2）酶克制剂的应用（应用）研究克制剂对酶的作用有重大的意义： （1） 药物作用机理和克制剂型药物的设计与开发：抗癌药 （2）对生物体的代谢途径进行认为调控，代谢控制发酵 （3）研究酶的活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计农药，并且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础2、次重点（1）酶克制剂的作用机制（应用）第三部分 题型示例与相关知识点一、题型示例（样题）一、填空题（20分）1、酶的分离纯化方法中，根据目的酶与杂质分子大小差别有凝胶过滤法，超滤法和超离心法三种。二、单项选择题（10分）1926年索姆纳初次证明酶的化学本质是蛋白质所用的酶是 A.刀豆蛋白酶 B.脂肪酶 C.脲酶 D.脱氢酶三、 名词解释题（20分）1、 分解代谢物阻遏指两种碳源（或氮源）分解底物同时存在时，细胞运用快的那种分解底物会阻遏运用慢的底物的有关分解酶合成的现象。1、简要回答酶的分离纯化方法。固定化细胞发酵有哪些优点？简答题（30