塞内卡病毒实时荧光定量RT...PCR检测方法的建立及应用_周霞.pdf

书书书动物医学进展，（）：研究论文塞内卡病毒实时荧光定量 检测方法的建立及应用收稿日期：基 金 项 目：广 东 省 农 业 科 学 院 协 同 创 新 中 心 项 目（和 ）；广 东 省 科 技 计 划 项 目（）；广东省现代农业岗位体系专家项目（和 ）作者简介：周霞（），女，重庆大足人，博士研究生，主要从事预防兽医学研究；温肖会（），女，河南安阳人，副研究员，硕士研究生，主要从事动物疫病诊断与防控研究。同等贡献作者。通讯作者周霞，温肖会，赵亮，翟颀，吕殿红，罗胜军，贾春玲，周秀蓉，牛佳伟，陈天宝，贺东生，翟少伦，（广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广东广州 ；华南农业大学兽医学院广东省人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州 ；西藏农牧学院动物科学学院，西藏林芝 ；岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，广东茂名 ）摘要：为加强塞内卡病毒（）在不同宿主的诊断及流行病学监测与防控，根据 中发表的 基因区域设计一对特异性引物和带有 发光基团标记的探针，构建重组阳性质粒并用作建立实时荧光定量 方法的模板，对反应体系和条件进行优化，构建标准曲线并验证该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示，该方法的最适退火温度为 ，最佳引物和探针浓度分别为 和 ，最佳反应循环数为，值与标准品浓度的对数线性关系好。对猪源、鼠源及牛源 和其他动物病毒（型口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、边界病毒、猪库布病毒、牛库布病毒、山羊鼻内肿瘤病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛结节性皮肤病病毒、牛冠状病毒、型流感病毒、蓝舌病毒）的核酸检测结果显示，除猪源、鼠源及牛源 为阳性外，其他病毒核酸为阴性。该方法最低检测限为 拷贝，重复试验中组内和组间变异系数均小于。建立的检测多宿主 方法具有良好的特异性和稳定性，为 在不同宿主间的疾病诊断与流行病学调查或监控提供了快捷的方法。关键词：塞内卡病毒；探针；实时荧光定量 ；检测中图分类号：；文献标识码：文章编号：（）型塞内卡病毒（，）因其发现地为塞内卡谷，故也称为塞内卡谷病毒（，），该病毒属于小 病毒科塞内卡病毒属，病毒粒子无囊膜，基因组为单股正链。年，在细胞培养物中首次分离到该病毒，并命名为 。虽然能感染猪，但不能使猪致病。直到 年月，一批从加拿大进口到美国的猪群中有 的猪出现了跛行，部分猪鼻唇镜上出现溃疡，蹄甲出现大小不一的水疱，水疱破损，蹄甲脱落等临床症状，经检测 为阳性。此后，引起了全世界广泛的关注，美国、巴西、泰国、越南等国家均报道猪群感染 疫情。我国首例 感染疫情于 年在广东省报道，后续我国多地也相继有 感染发生。国内外研究报告，在猪场的鼠、苍蝇、料槽、运猪工具等采集的样品中都能检测到 核酸，且在牛血清里也检测到 抗体，提示 具有宿主多样性。本 实 验 室 首 次 分 离 到 了 株 牛 源 ，并基于科赫法则证实了牛也是 的宿主。而 属于 病毒，具有易突变性，在不同的宿主体内其核苷酸均可以发生突变，因此建立一种可应用于临床检测多宿主 的检测方法，对不同物种间 的流行病学调查、监测及防控具DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.06.006有重要意义。材料与方法材料病毒和检测样品 型口蹄疫病毒（，）灭活疫苗核酸、水疱性口炎病毒（，）核酸、牛病毒性腹泻病毒（，）核 酸、猪 伪 狂 犬 病 病 毒（，）核酸、边界病毒（，）核 酸、猪 库 布 病 毒（，）核酸、牛库布病毒（，）核酸、山羊鼻内肿瘤病毒（，）核酸、牛传染性鼻气管 炎 病 毒（，）核酸、牛结节性皮肤病病毒（，）核 酸、牛 冠 状 病 毒（，）核酸、型流感病毒（，）核 酸、蓝 舌 病 毒（，）核酸以及猪源、牛源、鼠源 样品，保存于广东省农业科学院动物卫生研究所畜禽疫病防治研究重点实验室。主要试剂 体液病毒 小量试剂盒，爱思进生物技术（杭州）有限公司产品；，.感 受 态，标 准 、质粒小量制备试剂盒和 纯化回收试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司产品；高纯度质粒小提中量试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司产品；一步法荧光 反应试剂，南京诺唯赞生物科技有限公司产品。主要仪器设备梯度 扩增仪，杭州博日科技有限公司产品；电泳仪装置，凝胶成像系统，上海天能科技有限公司产品；实时荧光定量 仪，德国耶拿公司产品。方法引物设计及合成引物序列根据毒株 （：）序列的 基因部分经过 分析，设计一对引物和探针序列并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物及探针序列见表。标准品质粒制备将 目的片段连接 载体，转化至.感受态细胞扩大培养阳性质粒，提取质粒进行测序鉴定，将鉴定正确的质粒用作制作标准曲线的模板。实时荧光定量 将制备的标准品质粒模板使用分光光度计测定浓度，将标准品 倍倍比稀释，依次稀释至 倍。使用一步法荧光 反应试剂盒优化退火温度、引物浓度、反应循环数，以获得合适的反应体系和程序。表基于 基因的 引物及探针序列 引物 序列（）长度 ：标准曲线建立选取重组阳性质粒 （拷贝）为模板，进行 倍倍比稀释（拷贝，个梯度），每个浓度设置个重复，并设置阴性对照。特异性试验以 、核酸为检测对象，猪源、牛源、鼠源 样品提取核酸为阳性对照，以去离子水作为阴性对照，用所建立的一步法荧光 方法进行检测，同时设置空白对照，以检测其特异性。敏感性试验选取重组阳性质粒 （拷贝）为模板，进行 倍倍比稀释（拷贝，个梯度），按照本研究所建立的一步法荧光 方法进行检测，同时设阴性对照，来检测该方法的敏感性。重复性试验选择个不同浓度的阳性重组质粒 （、拷贝）按照建立的一步法荧光 方法分别进行批内和批间重复性试验，对该方法的重复性进行评价。批内试验每个样本设置个重复，批间试验分次进行；对检测所得的 值的平均值（?）、标准差（）和变异系数（）进行分析。结果标准品质粒制备将扩增有 目的片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图，可以成功扩增具有单一条带的目的片段，然后进行切胶回收，连接 载体后转化至.感受态细胞扩大培养阳性质粒，转化克隆后经测序鉴定序列正确，可将此质粒作为标准品。动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）实时荧光定量 反应条件的优化经过对该方法的优化，结果 为退火 温 度 选 择，最佳引物和探针浓度分别为 和 。对循环和反应体系的选择的结果显示为，当循环数越大，反应越完全（图、），所以为了使反应充分完全，选择循环数为。当使用 的试剂盒和 的试剂盒时，均可以取得很好的扩增效果（图、）。标准曲线建立本研究建立的一步法荧光 法进行标准曲线建立，扩增动力学曲线如图所示；通过对检测数据处理与分析，以标准品浓度对数值为横坐标（，），值为纵坐标（），由系统计算得到相对应的标准曲线，所对应的方程为：.，为 。结果显示一步法荧光 检测 的 值与标准品浓度的对数线性关系好，该方法的扩增效率符合要求。特异性试验结果使用该引物和方法分别检测猪源、鼠源及牛源 病毒 核酸和 其 他 动物病毒（、），结果显示除 为阳性外，其他病毒核酸均为阴性（图），表明该方法特异性较好。标准 ；阴性对照 ；图 目的基因扩增结果 循环数为；循环数为；循环数为；反应试剂为 试剂盒；反应试剂为 试剂盒 ；图循环数选择及试剂盒验证结果 敏感性试验结果以 个梯度稀释（分别为、倍），按照本研究所建立的一步法荧光 方法进行检测，结果显示，该方法最低检测限为 拷贝（图），表现出良好的敏感性。重复性试验结果采用上述所建立的一步法荧光 方周霞等：塞内卡病毒实时荧光定量 检测方法的建立及应用法，分别做组内重复试验和组间重复试验，通过统计学方法计算变异系数，结果见表和图。结果显示批内和批间重复性较好，均小于，表明所建立的一步法荧光 方法具有良好的重复性。图一步法荧光 扩增动力学曲线与标准曲线图谱 特异性试验，猪源，鼠源，牛源；敏感性试验，表示 模板浓度分别稀释 倍；批内试验；批间试验 ，；，；图一步法荧光 特异性、敏感性与重复性试验结果 ，讨论 属于 病毒，病毒间的重组，使 遗传多样性更加复杂，具有较高的变异可能性，因此该病毒未来的流行态势、致病力、跨物种传播风险难以预测。中国半数以上的省、直辖市和自治区受到 感染的影响，猪、牛和鼠等多种动物均可携带或感染，因此需要加强 的流行病学调查和病毒分子进化监测。多种血清学检测方法和病原学检测方法的建立，为 感染的诊断、疾病监控和流行病学调查等提供了强有力的工具。血清学方法中包括间接 、竞争 、间接免疫荧光和病毒中和试验等方法，范慧等 以纯化的重组 蛋白作为包被抗原，建立了 间接 抗体检测方法。等 表明，抗体竞争 与病毒中和试验、间接免疫荧光等方法的一致性高；等 采用 的 和间接免疫荧光的联合使用的方法，提高了猪场阳性猪的动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）表批内、批间试验结果 拷贝数（）批内?批间?注：“?”表示平均值，“”表示标准偏差，“”表示变异系数。：“?”，“”，“”检出；等 利用表达绿色荧光蛋白的重组 开发了一种快速病毒中和试验方法，用于检测血清样本。病原学诊断方法包括 方法、分子杂交技术等。目前 病原学诊断的多种方法开始建立，例如，范慧等 建立了 的 检测方法，谢守玉等 建立了 与型、亚洲型、型口蹄疫病毒的多重 检测方法，王晨等 建立了 的 荧光定量 方法，李秀博等 建立了基于探针的荧光定量 检测方法，等 建立了 套式 检测方法。通过应用本试验建立的一种可检测鼠源、猪源和牛源 一步法荧光 方法，用标准阳性质粒绘制的标准曲线关系显著，所对应的回归方程为：.，相关系数 ，扩增系数 ，组内和组间重复性试验的变异系数在 范围内，均小于，而国内建立 的 探针法，组内和组间重复性试验的变异系数均大于，这表明本试验建立的检测方法重复性和稳定性更好。特异性试验结果显示该方法能检测出鼠源、猪源、牛源，而 、均不能检出，表明其特异性良好。本方法最低检测量可达到 拷贝，具有良好的敏感性。本研究采用一步法荧光 方法，通过将 反转录和 扩增合成一步操作，在缩短操作时间的同时，也大大降低了污染发生的概率。现国内外可以检测多宿主 一步法荧光 的方法很少，本研究可检测 多 宿主来 源的，具有一定创新性，但后续还需要采集分离更多不同物种的，扩大宿主应用范围。综上所述，本试验建立了一种可检测多宿主来源 的一步法荧光 方法，具有较好的特异性、敏感性和重复性，对 防控具有重大意义，作为诊断技术储备也为我国对 的深入研究奠定了基础。参考文献：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：张永宁，张舟，诸明欣，等 型塞内卡病毒 蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备中国畜牧兽医，（）：张永宁，吴绍强，林祥梅塞内卡病毒病研究进展畜牧兽医学报，（）：，：，周霞水牛源塞内卡病毒的生物学特性及致病性研究广东广州：华南农业大学，朱亭帆，钱金涵，王强，等 型塞内卡病毒检测方法研究进展畜牧与兽医，（）：肖佳旭，郭笑然，赵款，等 型塞内卡病毒研究进展动物医学进展，（）：范慧，曾洁，李亮，等 塞内卡病毒（）间接 抗体检测方法的建立及应用中国兽医学报，（）：，周霞等：塞内卡病毒实时荧光定量 检测方法的建立及应用 ，（）：，：，（）：范慧，李亮，姜平，等 塞内卡病毒 的 检测方法的 建 立 和应用 畜牧兽医学报，（）：谢守玉，刘惠心，施开创，等 型塞尼卡病毒与 型、亚洲型、型口蹄疫病毒多重 检测方法的建立中国预防兽医学报，（）：王晨，罗愿，陈彦希，等塞内卡病毒 荧光定量 检测方法的建立 中国兽医科学，（）：李秀博，刘存，鄢明华，等 型猪塞内卡病毒 荧光定量 方法的建立中国动物传染病学报，（）：，（）：樊晓旭，赵永刚，迟田英，等塞尼卡谷病毒 荧光定量 检测方法的建立 中国预防兽医学报，（）：张志，张丽丽，吴发兴，等猪塞尼卡病毒 探针荧光 方法的建立和应用 中国兽医学报，（）：，（.，；.，；.，；.，）：（），（），（，）（），：；动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）