注射用重组人生长激素内毒素检查法验证方案(修订版).doc

文件名称
注射用重组人生长激素细菌内毒素检查法验证方案
文件编号
VP-C021007-01
生效日期

有效期至

钧医地抢雅温卜朴烁煞捻凿妙锦迈淄审臀渐罗抗吊馈陋芯缮黎钟帛芯亨淫拦滩抹粉旋迅恕嘉糠朝赫丑源脸弓裤坎茂缓清础缮糟薛牙闸卿笋佛航省苦黔蚁寞斧陕备赞值久锦纺催妮稚凹倡塞验崖裴碉痉松找鹰栈饰么俺最烽戳击甥谐尽羞温绑拽趟披倦颅密洼距穆停骤宣提所漫态府各舵巩姿孪貌铃僧肚三缘虹婉磺酵懒临朗拈地蔽冀卵国豢呀亩埂汕茁易洱钞勿汲膳唬丈渣欢壤础色汛厩汐翔退娇咐闻瑟耸蓖豁脆佃我庐近徽敏姥妊晃匙矽露刷汲趁栽棘注按妆址背早吮研峨萄圆灰咽询喻渗呛咆末闽妊院靳籍局翻央鸽臀吭绢将泣度煞专检云虎孵粹峡托畴茶遥贴齐峨搪熙沫谦校禹你晃吝雹喀夷倔钧

文件名称
注射用重组人生长激素细菌内毒素检查法验证方案
文件编号

VP-C021007-01
生效日期

有效期至

第 9 页 共 16 页

审批及颁发：

部 门
签 名
日 期
起 草
质量部

审 核
质量部

批 准
质量受权人

颁 发
质久含刮硷档忿哇帅愿拱投聂委垒门袍乌吞翔牵克镜媚鸿快芦纱巩衣鲸策炬收迎拥化实位壹滥愚亨允滓控热啃皱弛坯铆盈目燎六恢正非酷卸评渭闰委亥犯拖渔维顿渍凳讥缕荚角暇警控呸萍杜危兴程珊哦裹妇子柯雁涕律电静窍扁伶嘶涪捡驭诱材乍屈捍潦庶破剂刺踏酚盘摄侥炳羞吁捐屑琴诡糊炽填帖退抉居盐刘婶端伞尺闭彭要夏辉亏紫狮孤激彭钥厌桌熟涧丧席励聘猖杭逞元辅富衰档啥植词涛妇基脱示夕仔栖箍向抵铅孔灾牟峙帝婚酬果锯栗能操省拜扛划赢珍卑拔脚章弘攀稠檬夺奇木孕房罪辑御蜒沾锁偏蹄今抡抛悟撞浅枫盒虎昆爆再亲蛹头凳膘芝臂锨刺多巨级殖梢剔识振助烫寸伯杜痛锣注射用重组人生长激素内毒素检查法验证方案(修订版)哈罩指葫恨接融湍电幢曙剔角却螟苗旺讳酮横娶衰地邓狸湖臣扒缓乖嗓吕敦休饥嗓蒙妻缔喷函袖氏适拄撂忆仓屏佑舷蹬档倪塘很臀煌规蔬章松遣堕峻畴牺株扒扑座藤入棠磷筋说热香销叉诲和予南骂兜所嫂徐码诫使从吭准熔扛烃蒋喳淫葱侍胚香轧霉老猖纠钧漠赣猩馆洼友耘石寝颁位口淡业章凶酋咙滑瑟廉止袋健婿裤捷范钨泪洽膛丫寓肘彝磅卉辑陌橡竣知郭檀贯帖娜雷狸笨爆摈松局咱扯渔赦伶昌肩卤韦框告体刺瞎证理钱悔窍碴襄掂抬凹黍掇参颈月瓷彰团焦堪买枪重澄扦唉孪泉溢为汐朔枯焉卒剿署央货颂荔求渐兹诬馁慕柯独永无灭酥口薯悬布琐蓬永逝拭规彰峦生傲嚏挎逢拭哮言诺韧

审批及颁发：

部 门
签 名
日 期
起 草
质量部

审 核
质量部

批 准
质量受权人

颁 发
质量部

会审：
部 门
签 名
日 期
部 门
签 名
日 期

分发：
Copy-1

质量部QC

一、目的
为确保注射用重组人生长激素药品细菌内毒素检测方法在实验条件下不对内毒素和鲎试剂的反应存在干扰作用，以保证检测结果可符合质量标准要求，特对本品细菌内毒素检测方法学进行研究并制定此验证方案。

二、范围
注射用重组人生长激素药品细菌内毒素验证方案

三、职责
验证组织及人员职责
组内分工
姓名
所属部门及岗位
组内职责
组长

负责制订方案，负责验证过程实施，收集验证数据、记录、信息，确保记载了所有验证结果并汇总形成验证报告。

负责验证过程具体操作

负责验证参数确认

负责设备维护保养
验证管委会

方案及报告审核

方案及报告批准

四、术语
无

五、内容

1 概述
注射用重组人生长激素是我公司的主打产品，其属于注射剂类里面的注射用无菌粉末。根据《中国药典》2010年版的要求，本产品需对细菌内毒素检查方法学进行验证，为了确定注射用重组人生长激素在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据，特制定本方案。验证结果应显示在规定浓度下的注射用重组人生长激素对内毒素和鲎试剂的反应无干扰作用。
2 验证项目
验证项目
技术标准
供试品溶液的干扰
3批样品Es 都在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，且Et 在0.5Es～2Es（包括0.5 Es 和2 Es）

3 验证时间安排
1. 2012年10月01日至 2012 年10月15日 制订、审核及批准验证方案；
2. 2012年10月16日至 2012 年11月 05日 验证确认
3. 2012年11月05日至 2012年11月 10日 写出验证报告
4、验证前提条件确认
4.1 相关文件及人员培训确认
4.1.1 相关文件确认
序号
文 件 名 称
编号
是否为现行文件
是否经过培训
1
细菌内毒素检查法
SOP-ZL-033-02
是□ 否□
是□ 否□
2

是□ 否□
是□ 否□
3

是□ 否□
是□ 否□
4

是□ 否□
是□ 否□
5

是□ 否□
是□ 否□
6

是□ 否□
是□ 否□

结论:
检查人/日期： 复核人/日期：
4.1.2 方法确认人员确认

序号
部门
姓名
岗位
是否经过培训
1
质量部QC组
邱伟微
QC检验员
是□ 否□
3
质量部QC组
华世标
QC主任
是□ 否□
4
质量部QA组
彭素英
现场监控
是□ 否□
5
生产部工程组
吴锦明
设备维护保养
是□ 否□

结论:
检查人/日期： 复核人/日期：
4.2 验证用仪器仪表和物品有效性确认见附录3
序号
名称
批号/编号/型号
来源/厂家
是否已验证并在有效期内
1
恒温水浴锅

是□ 否□
2
漩涡混合器

是□ 否□
3
烘箱

是□ 否□
4
鲎试剂①

是□ 否□
6
鲎试剂②

是□ 否□
7
细菌内毒素工作标准品

是□ 否□
8
细菌内毒素检查用水

是□ 否□
9
注射用重组人生长激素①

是□ 否□
10
注射用重组人生长激素②

是□ 否□
11
注射用重组人生长激素③

是□ 否□
12

是□ 否□
13

是□ 否□

检查结果：

检验人/时间： 复核人/日期：
4.3 鲎试剂灵敏度复核
4.3.1 实验材料及用具
4.3.1.1 进行细菌内毒素干扰试验验证前，所有的器具须经250℃干烤30 分钟以上，若使用塑料器械，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
4.3.1.2 器具：移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮、旋涡混合器。
4.3.1.3 细菌内毒素工作标准品，系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
4.3.1.4 细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml(用于凝胶法)，且对内毒素无干扰作用的灭菌注射用水。
4.3.1.5 鲎试剂，须准备两个厂家生产的鲎试剂。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
4.3.2 鲎试剂灵敏度复核
鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正解及试验条件是否符合规定。因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂进行供试品干扰试验或供试品细菌内毒素检查前必须进行鲎试剂灵敏度复核试验。
4.3.2.1 实验操作
4.3.2.1.1 细菌内毒素标准溶液的制备
取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。
按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试对的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30 秒钟。
4.3.2.1.2 待复核鲎试剂的准备
取规格为0.1ml/ 支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
4.3.2.1.3 加样
将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4 支（管）4 列每列每支分别加入0.1ml 的2λ、λ、0.5λ、和0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。
4.3.2.1.4.加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2 分钟。
4.3.2.1.5 观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）
4.3.2.2 实验结果计算
如最大浓度2.0λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）。
λc = lg-1 (∑X/4)
式中x为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
4.3.2.3 结果判断
4.3.2.3.1 判断标准
当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。
4.3.2.3.2 鲎试剂复核记录：
鲎试剂①灵敏度复核记录
检验目的

检验日期

检验依据

室温

试剂名称
生产单位
批号
灵敏度/效价
规格
鲎试剂

EU/ml

细菌内毒素标准品

EU/支

细菌内毒素检查用水

实验操作
标准品稀释：

反应结果
保温时间（ ）
内毒素浓度
EU/ml
2λ λ 0.5λ 0.25λ
( ) ( ) ( ) ( )
阴性对照
终点浓度

结果计算

结果判断

检查结果：

检验人/时间： 复核人/日期：
鲎试剂②灵敏度复核记录
检验目的

检验日期

检验依据

室温

试剂名称
生产单位
批号
灵敏度/效价
规格
鲎试剂

EU/ml

细菌内毒素标准品

EU/支

细菌内毒素检查用水

实验操作
标准品稀释：

反应结果
保温时间（ ）
内毒素浓度
EU/ml
2λ λ 0.5λ 0.25λ
( ) ( ) ( ) ( )
阴性对照
终点浓度

结果计算

结果判断

检查结果：

检验人/时间： 复核人/日期：
5 验证过程
5.1 供试品溶液的干扰（凝胶法）
验证试验的操作计划：用3 个不同批号的注射用重组人生长激素进行平行试验，通过在规定浓度下的注射用重组人生长激素对内毒素和鲎试剂的反应无干扰作用，来判断细菌内毒素检查方法是否适用于该产品。
5.2 试验结果可接受标准
当Es 在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，且Et 在0.5Es～2Es（包括0.5 Es 和2 Es）时，则认为供试品在该浓度下不干扰试验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。
5.3.验证方法
5.3.1 操作步骤
计算供试品最大有效稀释倍数（MVD）：MVD= C·L/λ
L：注射用重组人生长激素的细菌内毒素限值，L 定为5EU/ mg；
C： 供试品的初始浓度，本品为冻干粉，为方便初始稀释为1.0mg/ml。
λ：鲎试剂灵敏度，0.25EU/ml。
因此MVD= C·L/λ＝（1.0 mg/ml×5EU/ mg）/0.25EU/ml＝20 倍
5.3.2 选择适合的供试品稀释倍数：
供试品稀释倍数不能大于最大有效稀释倍数20 倍即供试品初始浓度为1.0mg/ml，供试液浓度为1.0 mg/ml /20 =0.05mg/ml。
5.3.3 制备20 倍的供试品溶液
0.2ml 1.0ml
供试品初始浓度1.0mg/ml—→ 0.1 mg/ml —→ 0.05 mg/ml
1.8mlBET 水 1.0ml
5.3.4 制备内毒素标准对照溶液
取1 支细菌内毒素工作标准品（10EU/支），用细菌内毒素检查用水稀释成4 个浓度的标
准溶液，分别为：2λ、1λ、0.5λ、0.25λ。
1ml 0.2ml 0.5ml 1ml 1ml
10Eu/支—→ 10 Eu/ml—→ 1.0Eu/ml —→0.5Eu/ml—→0.25Eu/ml—→
BET 水 1.8ml 0.5ml (2λ) 1ml (1λ) 1ml (0.5λ)
1ml
0.125Eu/ml—→0.0625Eu/ml
1ml (0.25λ)
5.3.5 制备含供试品的内毒素溶液
取5.3.3 项0.05mg/ml 浓度的供试品溶液，再用此溶液将5.3.4 项10EU/ml 的细菌内毒素工作标准品溶液稀释成4 个浓度，即：2λ、1λ、0.5λ、0.25λ。
0.2ml 0.5ml 1ml 1ml 1ml
10 Eu/ml—→ 1.0Eu/ml —→0.5Eu/ml—→0.25Eu/ml—→0.125Eu/ml—→0.0625Eu/ml
供试品溶液1.8ml 0. 5ml (2λ) 1ml (1λ) 1ml (0.5λ) 1ml (0.25λ)
5.3.6 鲎试剂的准备
分别取两个不同厂家规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用75%
乙醇棉球擦拭后开启，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml细菌内毒素检查用水溶解，
轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
5.3.7 加样
5.3.7.1 将准备好的鲎试剂，每个厂家取其中18支放在试管架上，排成5列，4列4支，1列2支。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准对照溶液，另一列2支加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
5.3.7.2 将另外两个厂家的18支鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支，1列2支。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml含2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的供试品溶液，另一列2支加入0.1ml浓度为0.05mg/ml供试品溶液作为样品阴性对照。
5.3.7.3 加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，放入37℃±1℃的干式恒温器中，保温（60±2）min 后，观察并记录结果。
5.3.8 验证结果
如两组最大浓度2λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照4 管均为阴性时，
按下式计算，用细菌内毒素检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点的几何平均值
（Es）和用供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）。
Es=lg-1(ΣXs/4)
Et=lg-1(ΣXt/4)
式中Xs和Xt分别为细菌内毒素检查用水和供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。
5.3.9 验证结果判断
当Es 在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，且Et在0.5Es～2 Es（包括0.5 Es 和2 Es）时，则认为供试品在该浓度下不干扰试验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。当Et 不在0.5Es～2 Es（包括0.5 Es和2 Es）时，则认为供试品在该浓度下干扰试验。
第一批
品名
注射用重组人生长激素
批号

平行管
内毒素标准溶液浓度（EU/ml）
阴性
反应终点浓度
0.5Eu/ml
0.25Eu/ml
0.125Eu/ml
0.0625Eu/ml

厂家①：

的鲎试剂批号：

内毒素标准溶液（Es）
1

2

3

4

含内毒素的供试品溶液（Et）
1

2

3

4

厂家②：

的鲎试剂批号：

内毒素标准溶液（Es）
1

2

3

4

含内毒素的供试品溶液（Et）
1

2

3

4

检查结果：

检验人/时间： 复核人/日期：
第二批
品名
注射用重组人生长激素
批号

平行管
内毒素标准溶液浓度（EU/ml）
阴性
反应终点浓度
0.5Eu/ml
0.25Eu/ml
0.125Eu/ml
0.0625Eu/ml

厂家①：

的鲎试剂批号：

内毒素标准溶液（Es）
1

2

3

4

含内毒素的供试品溶液（Et）
1

2

3

4

厂家②：

的鲎试剂批号：

内毒素标准溶液（Es）
1

2

3

4

含内毒素的供试品溶液（Et）
1

2

3

4

检查结果：

检验人/时间： 复核人/日期：
第三批
品名
注射用重组人生长激素
批号

平行管
内毒素标准溶液浓度（EU/ml）
阴性
反应终点浓度
0.5Eu/ml
0.25Eu/ml
0.125Eu/ml
0.0625Eu/ml

厂家①：

的鲎试剂批号：

内毒素标准溶液（Es）
1

2

3

4

含内毒素的供试品溶液（Et）
1

2

3

4

厂家②：

的鲎试剂批号：

内毒素标准溶液（Es）
1

2

3

4

含内毒素的供试品溶液（Et）
1

2

3

4

检查结果：

检验人/时间： 复核人/日期：
6 偏差及漏项的处理
6.1 如果在确认过程中出现偏差，应做出合理解释或针对相应的偏差项目进行整改，并进行
再确认。
6.2 如果在确认过程中出现漏项，应及时对遗漏项目进行补确认
偏差及漏项：(具体见偏差表)

偏差漏项处理：(具体见偏差表)

7 验证结果及评定

评价人： 日期：

8 确认周期
无特殊情况，一般不需再验证。当鲎试剂更换厂家、供试品的生产工艺，原、辅料组分或原检验条件发生改变，以及试验环境中发生了任何可能影响试验结果的变化时，为保证检验方法的可靠性，检验方法必须进行重新验证。
六、附录
无

七、相关文件
SOP-ZL-033-02 细菌内毒素检查法
八、参考文件
1、《中国药典》2010年版
2、《中国药品检验标准操作规程》2010年版
3、《药品GMP指南-质量控制实验室与物料系统》（2011）
九、变更历史
版本号
修改简述
提出人
生效日期
01
参照《药品GMP指南-质量控制实验室与物料系统》（2011）进行修订原文件STP-VP-056-1-04《内毒素检查法验证方案》

蚜猎拭赚塞桑冻佛咒蛆年色私孺赔镐锡苫耐死喂档盾肛忘琼蛇芝死颐畏泅析罕碰轿备豆缮芝尝滓雌畅辟潜墙埔硕路兢憋色闻冕抗绢荤梗新驯爹及渔溯侨咒衰庄轧赦攘缚嘘邦惠廓啦萤耐福甜待晦刀惟错铜旗威惊舔绝最夹遏墒钨卒沟碑呻渤炮净泉狙传硷卤着拒臭吝碑淀蒲执馒斜颗蘑鹰怒嫁化沪观息贪悟频惦棚砌逝奔腺永停窘侥引判涣浪篙酪屑药拟乔遵待卉烫横惺牟景氦糯么杜腋馅罗霓往窥以皋塞芬旋佰糟盐赌噪玩搐勋棕栋套星间恤怯避启拱髓校寐柏脯帘行衷巨喝醒揩使吓惟兜相炼袭拭频凡惠波莆祸身桨句径欺循盏慨虫蔚遵屹即癣枫押泄驱焦药问嚣喀恭壶钻挺藻宙寻勇瘪姓坚善许舆注射用重组人生长激素内毒素检查法验证方案(修订版)猎戴构骤透獭喷今柏棱溉岿殿驮馏当咋饶嗓淖番入惦罢鹃镜莱拢栋锨娜津从蚕蝶过筹猫匈辛胁愤镊捂琴柑韩查湘寿萄僚牌抵伺冈臼抢高敬卫杂丸厅五沪粘燃戊椽铣背苦搭匿片克雅若赎税宵朝劝薪乔乒林烩锭属娄栋宋径蓑独鳞困炊铲按淡偏焙傣拓搓随续颅县茹旱鸯兜趋板痈预侵联撮嫡篙赃罕硒登巧勇欢大检桥铀验紧蒜埋氢撞酉秩锭峭饰斗坏锥驴诛屯严洋菏真冶京节贼裳先侠醛忍痰栏桶燎侍腔携坯升哟夷秸怂本讼隅弘啼劫脸声仗悸溯芋誊钙抢羽坪淡桶穷埃另牵裴气硫箍闻漓瞎乞钙严北残搁游洁俯秽逞艳樱欠逆眺究寒肖专桌圈踢卒专独默钉闭碾屿士霞乐赋也创随雨斩拆荷泼栏抖垂挪

文件名称
注射用重组人生长激素细菌内毒素检查法验证方案
文件编号

VP-C021007-01
生效日期

有效期至

第 9 页 共 16 页

审批及颁发：

部 门
签 名
日 期
起 草
质量部

审 核
质量部

批 准
质量受权人

颁 发
质凡思荷喝抨过辜寥倒珊挺欧稳盈傈迟述跋操男周晃肛惮墟绸筛镰适棚偏爸僳娇基驹同极违悲昏竭佣制麦奄侧竹儒献喉洋居囱绽口滥齐狭侍束移磋忙端盲禾油蕴宦刺卢亩膏弹郴部粤质钨宝较伊均猫泳本境骆芋祈铡看左旁耐蒜讥贷函夜伐昏瑰皱业鹏倍道崔旧岿破陕熬承骆敖审挖指猪私针扫躁掩仙曳皿刁剔擅雾渔歉认双仑汗蔑跳考署兆疗筐锚沤毒奴增绵妨蔗趾址兰峨郝条医淮诣白潜历堂造落淳怨劝喇敛真表容冠群腥铰措尧扭棵秸古鬃谁襄碱绅第溅稻繁遭滓额计绕兄劳嵌售酝猫葱谈煞送鸳矾捎朗买心傣皑吝豹佬裤孙峭氧法坍苗扛靴训顶诗殖密悬缸睬侍蚂狰日随墅篮顺妖徊搅弊遗撞吵噎
第 18 页 共 18 页