山羊ZFP36L1基因克隆及表达特性分析_马箫彤.pdf

马箫彤 等/山羊 ZFP36L1 基因克隆及表达特性分析 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1696-1709 DOI:10.13345/j.cjb.220719 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资助项目：国家自然科学基金(82002817)；四川省科技厅项目(2022NSFSC0067)This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(82002817)and the Foundation from Science and Technology Department of Sichuan Province(2022NSFSC0067).#These authors contributed equally to this work.*Corresponding author.E-mail: Received:2022-09-07;Accepted:2022-10-17;Published online:2022-10-19 1696 生物工程学报 山羊 ZFP36L1 基因克隆及表达特性分析 马箫彤1#，王瑞龙1,2#，王菲1，陈定双1,3，李艳艳1,3，林亚秋1,3，王友利1,3，刘伟1,3*1 西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041 2 赤峰应用技术职业学院，内蒙古 赤峰 024031 3 西南民族大学 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部/四川省重点实验室，四川 成都 610041 马箫彤,王瑞龙,王菲,陈定双,李艳艳,林亚秋,王友利,刘伟.山羊ZFP36L1基因克隆及表达特性分析J.生物工程学报,2023,39(4):1696-1709.MA Xiaotong,WANG Ruilong,WANG Fei,CHEN Dingshuang,LI Yanyan,LIN Yaqiu,WANG Youli,LIU Wei.Cloning and expression profile of ZFP36L1 gene in goatJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1696-1709.摘 要：本研究旨在克隆获取锌指蛋白家族 36(zinc finger protein 36-like 1,ZFP36L1)基因，并明确其表达特性，阐明其在山羊不同组织中的表达模式。采集简州大耳羊的心、肝、脾、肺、肾等15 种组织样品，应用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增获得山羊 ZFP36L1 基因，通过在线工具对基因及蛋白质序列进行生物学分析；再应用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测 ZFP36L1 基因在山羊各个组织及不同分化阶段的肌内前体脂肪细胞中的表达水平，并分析其组织表达谱以及细胞时序表达谱。结果表明，克隆获得山羊 ZFR36L1 基因序列长度为 1 224 bp，编码序列(coding sequence,CDS)区为 1 017 bp，编码 338 个氨基酸，是主要定位于细胞核、细胞质的非分泌不稳定蛋白；组织表达谱显示，ZFP36L1 基因在各组织中均有表达，在内脏组织、小肠表达量最高(P0.01)。在肌肉组织以背最长肌表达量最高(P0.01)。在脂肪组织中，皮下脂肪组织的表达量显著高于其他组织(P0.01)。诱导分化结果显示，该基因在肌内前体脂肪细胞成脂分化过程中表达呈上调趋势(P0.01)。以上研究为阐明山羊 ZFP36L1 基因的生物学功能提供数据支持。关键词：山羊；ZFP36L1；基因克隆；肌内前体脂肪细胞；诱导分化 动物及兽医生物技术 马箫彤 等/山羊 ZFP36L1 基因克隆及表达特性分析 ：010-64807509： 1697 Cloning and expression profile of ZFP36L1 gene in goat MA Xiaotong1#,WANG Ruilong1,2#,WANG Fei1,CHEN Dingshuang1,3,LI Yanyan1,3,LIN Yaqiu1,3,WANG Youli1,3,LIU Wei1,3*1 College of Animal Science and Veterinary Medicine,Southwest Minzu University,Chengdu 610041,Sichuan,China 2 Chifeng Vocational Institute of Applied Technology,Chifeng 024031,Inner Mongolia,China 3 Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization,Ministry of Education,Sichuan Province,Southwest Minzu University,Chengdu 610041,Sichuan,China Abstract:The purpose of this study was to clone and characterize the ZFP36L1(zinc finger protein 36-like 1)gene,clarify its expression characteristics,and elucidate its expression patterns in different tissues of goats.Samples of 15 tissues from Jianzhou big-eared goats,including heart,liver,spleen,lung and kidney were collected.Goat ZFP36L1 gene was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR),then the gene and protein sequence were analyzed by online tools.Quantitative real-time polymerase chain reaction(qPCR)was used to detect the expression level of ZFP36L1 in intramuscular preadipocytes in different tissues and adipocytes of goat at different differentiation stages.The results showed that the length of ZFR36L1 gene was 1 224 bp,and the coding sequence(CDS)region was 1 017 bp,encoding 338 amino acids,which was a non-secretory unstable protein mainly located in nucleus and cytoplasm.Tissue expression profile showed that ZFP36L1 gene was expressed in all selected tissues.In visceral tissues,the small intestine showed the highest expression level(P0.01).In muscle tissue,the highest expression level was presented in longissimus dorsi muscle(P0.01),whereas the expression level in subcutaneous adipose tissue was significantly higher than that in other tissues(P0.01).The results of induced differentiation showed that the expression of this gene was up-regulated during adipogenic differentiation of intramuscular precursor adipocytes(P0.01).These data may help to clarify the biological function of the ZFP36L1 gene in goat.Keywords:goat;ZFP36L1;gene cloning;intramuscular preadipocyte;induced differentiation 随着生活水平的不断提高，人们对肉品质的要求也不断提高；羊肉因其味美、低胆固醇以及营养丰富而越来越受喜爱1。肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量指沉积在肌肉内的脂肪含量，可影响肉质的风味、嫩度、色泽和多汁性等感官特征2。因此，从分子水平寻找影响肉羊脂肪沉积的关键调控分子具有重要意义，可为肉羊分子育种提供基础生物学证据。RNA 结合蛋白(RNA-binding protein,RBP)是一类通过与 RNA 特异性结合、调节转录后基因表达的蛋白质3。由于全过程参与 RNA 的成熟、修饰、转运、定位及翻译，RNA 结合蛋白决定了 RNA 的命运及功能，对细胞的生理代谢至关重要4。C3H1 型锌指蛋白 36(zinc finger protein 36-like 1,ZFP36L1)是一种高度保守、具有CCCH型RNA结合结构域的RNA结合蛋白5。作为人类最大的转录因子锌指蛋白家族(zinc finger protein,ZFP)的一员，ZFP36L1 在转录水平调节脂肪细胞的分化。如 Liu 等6在使用左旋咪唑治疗再生障碍性贫血(aplastic anemia,ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1698 AA)的研究中发现在左旋咪唑作用下，ZFP36L1 的表达增加，进而介导 PPARGC1B mRNA 的降解，最终抑制 AA 患者骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化。Tseng 等7则在小鼠中证实 ZFP36L1 通过抑制过氧化物酶增殖物激活受体(PPAR2)的表达，促进了成骨细胞的分化，抑制多能干细胞向脂肪分化。这些证据均暗示，ZFP36L1 在真核生物脂肪代谢中扮演了重要角色。简州大耳羊，是由美国于 1940 年赠予我国的努比亚羱羊(Capra nubiana)与四川省龙泉山脉一带的麻羊经过 63 年的杂交选育形成的山羊新品种8-10。作为我国人工培育的第二个肉用山羊品种，简州大耳羊体格健硕、生长速度快、产羔率稳定、肉质鲜美，已自我国西南地区逐渐推广至两湖、两广及河南等省区，并在 2011 年被国家质检总局登记为中国国家地理标志产品11-12。作为我国优良的肉用山羊品种，本研究以人类脂肪细胞分化中已证实的关键因子 ZFP36L1 为生物标志，探究其在简州大耳羊不同组织及时序下的表达规律，为阐明简州大耳羊脂肪沉积的调控机制，改善其肉质性状，推进其分子育种提供科学依据和技术支撑。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验样品采集 随机选取成年(1 周岁)、健康简州大耳羊(购自四川省简阳大哥大牧业有限公司)3 头，清晨空腹屠宰后，立即采集心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、背最长肌、股二头肌、臂三头肌、皮下脂肪、肠系膜脂肪、肌间脂肪、心包膜脂肪、内脏脂肪共 15 种组织的样品，用 PBS(pH 7.4)洗涤后剪成小块，经锡箔纸、冻存管、纱布袋逐级快速包装后于液氮保存。本研究经动物伦理委员会批准，编号 SMU20210725。1.1.2 试验试剂 反转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，购于 Thermo Scientific 公司)；DNA 回收试剂盒、质粒提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)；TRIzol 试剂(购自TaKaRa 公司)；实时荧光定量试剂盒(2SYBR Green qPCR Master Mix，购自 Bimake 公司)；TreliefTM 5 感受态细胞、T 载体(pClone007 Versatile Simple Vector Kit，购自北京擎科生物科技有限公司)。1.2 试验方法 1.2.1 山羊组织 RNA 提取及 cDNA 反转录 取冻存的心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、背最长肌、股二头肌、臂三头肌、皮下脂肪、肠系膜脂肪、肌间脂肪、心包膜脂肪、内脏脂肪共 15 种组织，按照 TRIzol 法13提取山羊各组织 RNA，电泳验证 RNA 完整性，检测RNA 的浓度和质量合格后按照反转录试剂盒说明书进行 RNA 反转录合成 cDNA，合成的cDNA 置于20 保存备用。1.2.2 引物的设计及合成 根据 GenBank 中的山羊预测序列(登录号：XM_013967250.2)，利用 Primer Premier 5 软件设计克隆引物(表 1)，扩增其完整的编码序列(coding sequence,CDS)区序列。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.2.3 山羊 ZFP36L1 基因克隆与测序 以背最长肌cDNA为模板进行逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)反应，克隆 ZFP36L1 基因。RT-PCR 反应总体系(25 L)为：Primer STAR Max DNA Polymerase 酶 12.5 L；上、下游引物(10 mol/L)各 1 L；模板 cDNA 1 L；ddH2O 9.5 L。RT-PCR 扩增程序：98 预变性 3 min；98 变性 1 min，58 退火 15 s，72 延伸 马箫彤 等/山羊 ZFP36L1 基因克隆及表达特性分析 ：010-64807509： 1699 20 s，35 个循环；72 延伸 5 min，4 保存。用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 结果正确后回收纯化 PCR 扩增产物，将纯化产物连接至 T载体，连接产物转化到 TreliefTM 5 感受态细胞并加入 500 L LB 培养基，摇床复苏 45 min，取 100 L 转化产物接种于含 Amp 抗性的 LB 固体培养基中，37 培养过夜，挑选出固体培养基中单一且呈圆形的阳性菌落于含1 mL LB培养基的 EP 管中，经 37、200 r/min摇床培养 36 h后进行菌落鉴定，将鉴定结果呈阳性的菌落送至北京擎科生物科技有限公司成都分公司进行菌液测序。1.2.4 山羊 ZFP36L1 基因生物信息学分析 运用生物信息学软件及在线工具对山羊ZFP36L1 基因进行生物信息学分析，分析方法及工具如表 2 所示。1.2.5 山羊 ZFP36L1 基因在组织及分化细胞中的表达检测 以提取的简州大耳羊心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、背最长肌、股二头肌、臂三头肌、表 1 文中所用引物信息 Table 1 Primer information used in this study Gene Primer sequence(53)Tm()Size(bp)Purpose ZFP36L1 F:TGTATGGAGAGGCAGGCAAC R:CTCCAGCAGGGCTTTACGTC 58 1 224 RT-PCR ZFP36L1 F:TGTATGCCAAGAGAGCCAGT R:CCCTTGGTTGAACTTCCTTC 60 101 qPCR ZFP36L1 F:CCCAAGCTTATGACCACCGCCCTCGT R:CGGGATCCTAGTCATCTGAGATGGAAAGTCTGC 58 1 017 PCR TBP F:AACAGCCTCCCACCTTATGC R:TGCTGCTCCTCCAAAATAGAC 60 155 qPCR UXT F:GCAAGTGGATTTGGGCTGTAAC R:ATGGAGTCCTTGGTGAGGTTGT 60 173 qPCR F:Sense primer;R:Antisense primer;BamH restriction site and Hind restriction site are underlined;TBP,UXT:Ubiquitously-expressed transcript gene.表 2 序列分析及所使用程序 Table 2 Sequence analysis and procedures used Analysis content Analytic software and online tools Amino acid sequence translation ORF Finder(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)Multiple sequence alignment NCBI Blast(https:/)Phylogenetic tree MEGA 7 Computation of physical and chemical parameters ExPASy-ProtParam(http:/web.expasy.org/protparam/)Prediction of protein secondary structure SOPMA(https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/)Prediction of protein tertiary structure SWISSMODEL(https:/swissmodel.expasy.org/)Prediction of the amino-acid glycosylation sites NetNGLye 1.0(http:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)Predictions of the amino-acid phosphorylation sites NetPhos 3.1 Server(http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)Prediction of the signal peptide sites SignaIP 4.1(http:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-4.1)Subcellular localization analysis PSORT (https:/psort.hgc.jp/form2.html)Protein-protein interaction analysis STRING(https:/string-db.org/)Prediction of transmembrane domain TMHMM(http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1700 皮下脂肪、肠系膜脂肪、肌间脂肪、心包膜脂肪、内脏脂肪共 15 种组织 cDNA 为模板，以TBP 为内参基因，用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测 ZFP36L1 基因在各种组织中的表达水平。复苏前期保存的简州大耳羊肌内前体脂肪细胞并传代培养14，待 F3 代细胞长至 80%时加入 50 mol/L 油酸诱导其分化，分别于 0、24、48、72、96、120 h 收集细胞，提取细胞样品总 RNA 并反转录为 cDNA，进而用 qPCR 扩增 ZFP36L1 基因，检测其表达水平。qPCR 反应体系为 2 SYBR Green qPCR Master Mix 10 L，上、下游引物(10 mol/L)各 1 L，模板 cDNA 1 L，ddH2O 7 L。qPCR 反应条件：95 预变性 3 min；95 变性 10 s，60 退火 10 s，72 延伸 15 s，35 个循环。1.2.6 山羊 ZFP36L1 过表达载体构建及表达效率检测 利用克隆得到的山羊 ZFP36L1 基因 CDS 区序列设计亚克隆引物，选用 BamH 和 Hind (下划线)为酶切位点，设计包含酶切位点且克隆产物包含完整 CDS 区域的引物，引物信息如表 1 所示。以前述质粒为模板进行 PCR 扩增，将目的片段与 pClone007 VS 载体连接后进行测序；选取测序正确的质粒与 pEGFP-Tag 2B 载体分别应用 BamH 和 Hind 进行双酶切，纯化后利用T4 DNA 连接酶连接，连接产物转化到 Trelief TM 5 感受态细胞进行过夜培养，筛选阳性克隆并提质粒，送至成都擎科生物技术有限公司测序。表达效率检测，将测序成功的质粒转染至 F3 代肌内前体脂肪细胞，空白组、试验组分别转染pEGFP-Tag 2B 与 pEGFP-ZFP36L1(质粒：500 ng,opti:100 L,TurboFect:2 L)，48 h 时收集细胞并提取总 RNA，反转录为 cDNA。通过 qPCR扩增山羊 ZFP36L1 基因(体系与程序同 1.2.5)，以 UXT 为内参基因，检测其表达水平。1.2.7 数据统计分析 定量结果采用 2Ct法15处理，数据以平均值标准误表示，用 SPSS 26.0 中 Duncan 检验对数据进行方差分析，P0.05 表示差异显著，P0.01 表示差异极显著；利用 Graphpad prism 9.0 绘图。2 结果与分析 2.1 克隆的山羊 ZFP36L1 基因 以背最长肌 cDNA 为模板，扩增 ZFP36L1 基因，扩增片段与预期目的产物大小相符(图 1A)，测序获得山羊ZFP36L1基因片段长度为1 224 bp，经过 ORF Finder 分析发现，ZFP36L1 基因的CDS 区为 1 017 bp，编码 338 个氨基酸，与 NCBI数据库山羊基因序列(XM_013967250.2)相比存在 2 个碱基的突变(图 1B)。将测序序列上传到NCBI，获得基因登录号 OL828166。图 1 山羊 ZFP36L1 基因结构 Figure 1 Gene structure of goat ZFP36L1 gene.A:Electropherogram.M:DL2000 DNA marker;1:ZFP36L1 targetstrip.B:Comparison of the partial nucleotide sequence of ZFP36L1.马箫彤 等/山羊 ZFP36L1 基因克隆及表达特性分析 ：010-64807509： 1701 2.2 山羊 ZFP36L1 基因序列 2.2.1 山羊 ZFP36L1 一级结构及理化性质 分析山羊 ZFP36L1 氨基酸序列，其分子式为C1585H2469N459O498S13，分子质量为 36.339 6 kDa，理论等电点为 5.22，不稳定指数为 68.17，脂肪指数为 61.30，亲水性总平均值为0.485，说明该蛋白为酸性的不稳定亲水性蛋白。ZFP36L1蛋白的氨基酸组成如图 2 所示，其中丝氨酸含量最高(14.8%)，甲硫氨酸和缬氨酸的含量最低(1.5%)；该基因编码的蛋白质中，带负电荷的残基数(Asp+Glu)为 32，带正电荷的氨基酸残基数(Arg+Lys)为 34，表明山羊 ZFP36L1 蛋白质可能带正电荷。2.2.2 山羊 ZFP36L1 蛋白质理化性质 应用在线工具预测 ZFP36L1 蛋白的磷酸化位点，发现 52 个磷酸化位点，包括 43 个丝氨酸磷酸化位点(Ser)、7 个苏氨酸磷酸化位点(The)、2 个酪氨酸磷酸化位点(Tyr)。预测糖基化位点，表明该蛋白可能含有 2 个 N-糖基化位点，分别位于第 25 位点和第 111 位点。运用在线软件 SMART 对该蛋白结构域进行分析，发现 2 个 CCCH 型 RNA 结合结构域和 4 个低复杂性结构域(图 3A)。利用在线软件 TMHMM 分析 ZFP36L1 蛋白质的跨膜结构，未见明显跨膜区域，为非跨膜蛋白(图 3B)。信号肽预测结果显示，无信号肽(S 均值=0.244)，为非分泌蛋白(图 3C)。2.2.3 山羊 ZFP36L1 蛋白高级结构、相互作用蛋白以及亚细胞定位 预测山羊 ZFP36L1 蛋白质二级结构，发现形成-螺旋的氨基酸有 71 个，占 21.01%；有219 个氨基酸形成无规则卷曲，占 68.05%；27 个氨基酸形成延伸链，占 7.99%；21 个氨基酸形成-转角，占 6.21%(图 4A)。山羊 ZFP36L1蛋白三级结构与二级结构预测结果一致，如图 4B所示。预测其相互作用蛋白，发现 ZFP36L1 蛋白主要与 ZFP36L2、YWHAB、DCP2、ZNF24、EXOSC6、DCP1A、EXOSC2、XRN1、SNX18 等蛋白相互作用，进而发挥其生物学功能(图 4C)。预测其亚细胞结构定位，发现 ZFP36L1 主要分布于细胞核中，占 43.5%，其余依次为细胞质(39.1%)、线粒体(8.7%)与细胞骨架(8.7%)(图 4D)。图 2 山羊 ZFP36L1 蛋白的氨基酸组成 Figure 2 Amino-acid composition in ZFP36L1 protein of goat.ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1702 图 3 山羊 ZFP36L1 蛋白质修饰位点、结构域、跨膜结构和信号肽 Figure 3 Analysis of protein modification sites,domain(A),transmembrane structure(B)and signal peptide(C)in ZFP36L1 protein of goat.(A)Shadow:Phosphorylation site.Heart-shape:Glycosylation site.Red box:Low-complexity domain.Black box:C-end domain.Blue frame:ATG is the start codon and TAA is the stop codon.2.2.4 山羊 ZFP36L1 氨基酸序列系统进化 运用 NCBI 在线 比对 程序对不 同物种ZFP36L1 基因所编码的氨基酸序列进行 BLAST，发现山羊 ZFP36L1 的氨基酸序列与绵羊、牛、野 牦牛、欧亚野猪、羊驼、大熊猫和马来亚穿山甲的 ZFP36L1 氨基酸序列的相似性分别为99.70%、99.70%、99.70%、99.41%、99.11%、99.11%、99.11%(图 5A)，表明 ZFP36L1 在不 马箫彤 等/山羊 ZFP36L1 基因克隆及表达特性分析 ：010-64807509： 1703 图 4 山羊 ZFP36L1 蛋白二级结构和三级结构预测、互作蛋白分析以及亚细胞定位 Figure 4 Prediction of the secondary(A)and tertiary structure(B),interaction(C)and sub-cellular localization(D)of the goat ZFP36L1 protein.图 5 山羊 ZFP36L1 蛋白的系统发育 Figure 5 Phylogeny of ZFP36L1 protein in goats.A:Amino acid homology comparison.B:Phylogenetic tree based on ZFP36L1 protein.ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1704 同物种间具有较高的保守性。基于 ZFP36L1 构建的系统发育树显示，山羊与野牦牛处于同一分支，亲缘关系最近，其次是与绵羊和牛亲缘关系较近(图 5B)。2.3 山羊ZFP36L1基因在不同组织中的表达差异 为明确山羊 ZFP36L1 基因在不同组织中的表达差异，利用 qPCR 方法检测其在山羊心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、背最长肌、股二头肌、臂三头肌、皮下脂肪、肠系膜脂肪、肌间脂肪、心包膜脂肪、内脏脂肪共 15 种组织中的 mRNA 表达水平。结果显示，ZFP36L1 基因在山羊各组织中均有表达。其中在内脏组织中小肠的表达量极显著高于其他组织(P0.01)，肝、肾和大肠也存在较高的表达水平(图 6A)。在肌肉组织中背最长肌的表达量最高(P0.01)，臂三头肌的表达量最低(图 6B)。在脂肪组织中，皮下脂肪组织的表达量最高且极显著高于其他组织(P0.01)，内脏脂肪组织和肌间脂肪组织的表达水平无显著差异(图 6C)。图 6 山羊 ZFP36L1 基因在内脏、肌肉和脂肪组织中的相对表达水平 Figure 6 Relative expression levels of goat ZFP36L1 in visceral tissues(A),muscle tissues(B)and adipose tissues(C).Different capital letters in the superscript indicate that the difference is extremely significant between the data(P0.01),different lowercase letters indicate significant difference(P0.05).马箫彤 等/山羊 ZFP36L1 基因克隆及表达特性分析 ：010-64807509： 1705 2.4 山羊ZFP36L1基因在肌内前体脂肪细胞分化前后的表达差异 为探究 ZFP36L1 基因是否在山羊的脂肪沉积过程中充当关键分子，通过 qPCR 检测其在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达水平。结果表明，经 50 mol/L 油酸诱导分化成熟过程中，与诱导分化前相比，分化 24、48、72、96、120 h 的 ZFP36L1 的表达水平均呈现上调趋势(图 7)。以上结果表明，ZFP36L1 基因可能作为山羊脂肪细胞分化的正调控因子发挥作用。2.5 山羊ZFP36L1基因过表达载体的表达效率 为进一步验证 ZFP36L1 基因的生物学功能，以 BamH 和 Hind 作为酶切位点设计亚克隆引物(表 1)，进而构建 pEGFP-ZFP36L1 过表达载体。pEGFP-ZFP36L1 质粒经 BamH 和Hind 酶切，电泳得到长度约4.7 kb的pEGFP-N1载体片段与 1.0 kb 的目的片段(图 8A)。测序后结果显示，插入的序列与目的基因完全匹配。该载体转染肌内前体脂肪细胞后，运用 qPCR技术检测，结果显示，与空白组相比，ZFP36L1基因表达量上调了 84.7 倍(图 8B)，表明pEGFP-ZFP36L1 过表达载体构建成功。3 讨论 ZFP36L1是一种广泛存在于真核生物的RNA结合蛋白，通过对基因转录后的调控，在多种细胞的生长分化中扮演着重要角色16。ZFP36L1 自 图 7 山羊 ZFP36L1 基因在肌内前体脂肪细胞分化过程中的相对表达水平 Figure 7 Relative expression levels of ZFP36L1 gene in goat intramuscular preadipocyte during differentiation process.Relative expression level of ZFP36L1 gene at 24 h(A),48 h(B),72 h(C),96 h(D)and 120 h(E).*:P0.05;*:P0.01.ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1706 图 8 山羊肌内前体脂肪细胞中 ZFP36L1 基因的过表达 Figure 8 Overexpression of ZFP36L1 gene in goat intramuscular preadipocytes.A:Electropherogram.M:DL2000 DNA marker;1:Digestion identification of pEGFP-ZFP36L1.B:Relative mRNA expression levels of ZFP36L1 gene.*:P0.01.C:Overexpression vector sequence alignment.Square frame:Restriction site.Round circle:Inserted base(to prevent a frameshift mutation).Triangle:Protective bases.1989 年首次报道以来17，主要关注在于其与人类疾病的关系16,18-19，在其他哺乳动物中鲜有报道，且对于反刍动物脂肪细胞的作用尚未见报道。本研究成功克隆山羊 ZFP36L1 基因，全长为 1 224 bp，编码 338 个氨基酸。Trguer 等17对爪蟾发育过程中的调控基因研究时发现，ZFP36 家族(包括 ZFP36、ZFP36L1、ZFP36L2)在脊椎动物进化过程中较为保守，这与本研究 马箫彤 等/山羊 ZFP36L1 基因克隆及表达特性分析 ：010-64807509： 1707 的结论一致氨基酸序列比对得到简州大耳羊与绵羊、牛、野牦牛相似性较高，说明该蛋白在不同物种间具有较高的保守性。Hitti 等20在对肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)转录调控的研究中发现，ZFP36L1 的磷酸化对其亚细胞定位、蛋白稳定性及 mRNA 去稳定化至关重要。这一结论在 Lin 等21对 3T3-L1 前脂肪细胞分化过程中 ZFP36 家族的表达调控研究中得到证实ZFP36L1 的磷酸化显著影响了细胞分化。本研究在对山羊 ZFP36L1 蛋白理化性质的分析中发现，丝氨酸与苏氨酸占其总氨基酸组成的 20.7%，存在 52 个磷酸化位点，具有广泛的磷酸化潜力，而磷酸化作为蛋白翻译后修饰的方式之一，参与调节细胞的生长、分化、凋亡等功能22，这或许是 ZFP36L1 发挥其生物学功能的重要机制。ZFP36 家族具有高度保守的 CCCH 型锌指结构域，对于控制 mRNA 稳定性至关重要，被认为是调控基因精确表达的重要靶点23-24，而ZFP36L1蛋白的结构域显示，其含有 2个 CCCH型 RNA 结合结构域和 4 个低复杂性结构域，且其锌指结构中