细胞染色方法总结.doc

Hoechst染色：hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合 （主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色。 Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果。hoechst有hoechest33342和hoechst33258两种 hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！
染色步骤
PI （Propidium Iodide碘化丙啶)染色： 是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测. 碘化丙啶（Propidium Iodide， PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加,PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞,只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡(当然晚期凋亡PI亦可着色)。但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI单一染色也可以。但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！

annexin—v染色细胞凋亡早期，细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS）外翻 ,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin—v 染色阳性，表示细胞处于早期凋亡状态。Annexin—V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。
JC—1染色 JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集,低浓度时主要以单体(monomer）存在，发射光以绿光（～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体（aggregation），发射光以红光(—590nm)为主。线粒体本身存在一定的极性（polarization),其外膜为负极,内膜为正极。电位差由Ca2+、Na+和H+流调控.当线粒体状态良好时对JC—l摄取量少,因而在线粒体内主要以单体的形式存在绿光强度/红光强度的比值较高。在线粒体发生去极化（depolarization）时，线粒内JC—l的浓度较高，多以多聚体的形式存在，绿光强度/红光强度的比值降低。JC-1染色的绿光强度/红光强度仅取决于线粒体的膜电势(membrane potential),而与线粒体的形态、体积和密度都无关，因而能更好地反映线粒体的功能状态。由于凋亡发生的早期存在线粒体的去极性，因此，JC-1染色被用于检测凋亡的早期发生。其实验方法如下。
JC-l染色非常简单。首先可将成品JC-1以DMSO配成储存液（1~5mg/ml),储存于—20℃，用时以培养液稀释至10ug/ml终浓度。对贴壁细胞可以直接弃去培养液，漂洗细胞后直接加入染色液,10-30min后在荧光显微镜下或者激光共聚焦下观察。线粒体状态好时细胞以绿色为主，当红光信号增强时,红绿相叠,以橙色为主。该染色运用于悬浮细胞时还可以通过流式细胞仪进行检测，收集红/绿信号强度,计算其强度比.
钙黄绿素—AM（Calcein-AM)：Calcein —AM本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein —AM能脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光（激发：490 nm，发射：515 nm）。因此Calcein -AM仅对活细胞染色
细胞活力鉴定—-台盼蓝染色法
原理：
细胞损伤或死亡时,台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合,使其着色.而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。

用品：
1. 4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨,加双蒸水至100ml，用滤纸过滤,4度保存.使用时。用PBS稀释至0。4％。
2。 吸管、血细胞计数板、显微镜

步骤：
1、制备单细胞悬液。并作适当稀释（106 细胞/ml）
2、染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9：1混合混匀。
3、计数:在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞

结果统计：
镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。
根据下式求细胞活力：
活细胞率(％)= 活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100

注意事项：台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。
台盼蓝染色原理
通常认为细胞膜丧失完整性，细胞即可被认为已经死亡。台盼蓝（Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞,膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。依据此原理，细胞经台盼蓝染色后，可通过显微镜，直接镜下计数或拍照后计数，实现对细胞存活率比较精确的定量分析。
试述台盼蓝染发鉴别死活细胞的原理，试分析染色时间过长本来是活细胞也被染色的原因
死细胞的细胞膜无屏障作用,台盼蓝马上进入细胞而显蓝色。活细胞细胞膜有选择透性，对台盼蓝的透性小，进入细胞慢。若染色时间过长，台盼蓝可能通过胞吞或胞饮作用进入细胞.
方法 特点
染细胞类型
染色部位
激发光
颜色
意义
Hoechst染色
活细胞（主要是早期凋亡细胞）
细胞核
紫外激发
核染蓝色
检测早期凋亡
PI染色
坏死细胞或凋亡晚期细胞
细胞核
绿光激发！

核染红色
检测死细胞或凋亡晚期细胞
annexin—v染色
早期凋亡细胞
细胞膜
不定
不定
早期凋亡灵敏指标
JC—1染色
早期凋亡细胞
线粒体膜
绿光为主
功能好的细胞绿色为主反之红为主
早期凋亡
台盼蓝染色
死细胞
降解DNA
?
蓝色
细胞存活率
Calcein—AM染色
活细胞
?
绿荧光光
黄绿色
活细胞数