机能实验-肾缺血再灌注培训讲学.doc

机能实验 肾缺血再灌注

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影响尿生成的因素和肾缺血再灌注损伤
（南方医科大学 广州 510515）
【摘要】 目的 探究影响肾泌尿功能的因素，探究肾缺血后再灌注对肾的损伤现象。 方法 静脉分别补充37℃的生理盐水和20%的高渗葡萄糖，观测平均动脉压，尿量；结扎左肾动脉，一段时间后松开动脉夹再灌注，观测平均动脉压，尿量，血肌酐和尿肌酐含量，计算内生肌酐清除率(Ccr)。 结果 补充37℃的生理盐水和20%的高渗葡萄糖尿生成量增加，缺血再灌注后血肌酐浓度增高，尿肌酐浓度降低,内生肌酐清除率(Ccr)明显降低。 结论 增加血容量，肾滤过血液增多，尿生成增加；注射高渗溶液增加肾小管内原尿浓度，尿生成量增加；缺血再灌注后肾排泄能力降低，肾的功能受损。
【关键词】尿生成；肾缺血再灌注损伤；尿肌酐；内生肌酐清除率
肾是机体主要的排泄器官之一，探究影响肾泌尿功能的因素有助于利尿药等干预肾脏功能药物的研发；肾缺血再灌注(Ischemic reperfusion，I／R)损伤是临床上常见的病理过程，在肾脏手术、肾移植和体外震波碎石等过程中，均可发生不同程度的再灌注损伤，它是急性肾衰最常见的原因，因此探究肾的缺血再灌注这一病理现象具有重要意义。肾缺血再灌注时，内生肌酐清除率（Ccr）明显降低，肾功能受损.本实验通过复制肾脏缺血再灌注损伤的模型，对肾脏缺血再灌注损伤后血肌酐和尿肌酐的含量，以及内生肌酐清除率（Ccr）进行测定，来探究肾脏的缺血再灌注损伤。
1 材料与方法
1.1 实验材料
动物 ：家兔
器材 ：医用计算机记录系统，家兔手术台，哺乳动物手术器械，压力换能器，动脉静脉插管，三通管，注射器，兔绳，分光光度计，恒温水浴箱。
药品与试剂 ：20%乌拉坦，0.2%肝素，生理盐水，20%葡萄糖溶液，速尿，肌酐测定试剂。
1.2 探究影响尿生成的因素的方法[1]
家兔称重后用20%乌拉坦耳缘静脉麻醉，麻醉后将家兔仰卧位固定在兔台上。家兔颈部剪毛，沿甲状软骨下正中剪开皮肤5cm，分离右侧颈总静脉和左侧颈总动脉。从右侧颈总静脉插入静脉导管，左侧颈总动脉插管，连接压力换能器用于记录血压。将家兔换成右侧卧位，在左肋弓下缘两指处做一斜形切口，辨认输尿管并进行输尿管插管，用有刻度的试管收集尿液并计算每分钟尿量，取此时的尿液测量尿肌酐。静脉输入30ml生理盐水，用有刻度的试管收集尿液并计算注射后每分钟尿量。一段时间后静脉输入10ml 20%葡萄糖溶液，用有刻度的试管收集尿液并计算注射后每分钟尿量。
1.3 肾缺血再灌注损伤模型复制的方法
游离左肾动脉，用动脉夹夹闭，夹闭即刻观测动脉血压和尿量变化，夹闭30min后观测动脉血压和尿量变化。松开动脉夹，再灌注，同时静脉输入19ml 生理盐水加1ml速尿，再灌注30min后取尿测定尿肌酐浓度。
1.4 尿肌酐测定方法
取样 取尿液10μl与2ml蒸馏水按1：200比例稀释。
加样
加样（ml）
标准管
测定管
空白管
测试样品上清

1.6

试剂一(Cr标准品)
1.6

蒸馏水

1.6
试剂三
0.5
0.5
0.5
试剂四
0.5
0.5
0.5

测定 37℃ 10min水浴，以蒸馏水调零， 测510 nm处光密度。
计算 肌酐(μmol/L) =（测定管OD -空白管OD）/（标准管OD –空白管OD）x 标准品浓度 x 201倍
内生肌酐清除率Ccr (ml/min) = 尿肌酐浓度 / 血肌酐浓度 x 尿量
2 结果
2.1 血压记录
输入生理盐水后，血压上升，输入20%葡萄糖后，血压上升不明显，缺血再灌注后血压下降。

输尿管插管后
输入生理30ml盐水后
输入20%葡萄糖后
再灌注30min后
平均动脉压
83.2mmHg
92.1mmHg
97.6mmHg
50.2mmHg

2.2 尿量记录
输入生理30ml盐水后，尿量增加，输入20%葡萄糖后，尿量增加更明显；再灌注后尿量又明显减少。

输尿管插管后
输入生理30ml盐水后
输入20%葡萄糖后
再灌注30min后
尿量
0.1ml/min
0.6ml/min
1.6ml/min
0.02ml/min
2.3尿肌酐含量测定数据
缺血再灌注后尿肌酐浓度下降。缺血再灌注后的Ccr较缺血再灌注前降低。

标准管
空白管
输尿管插管瞬时尿液
再灌注30min后尿液
尿肌酐OD值
0.068
0
0.075
0.043

输尿管插管瞬时
再灌注30min后
尿肌酐浓度
2205.9μmol/L
1264.7μmol/L

缺血再灌注前
缺血再灌注后
Ccr
7.24ml/min
6.48ml/min

3 讨论
3.1 影响尿液生成的因素[2]
实验中我们观察到，静脉输入30ml生理盐水和10ml20%葡萄糖后，家兔尿量增加。由于补充了上述两种液体，血液被稀释，血浆蛋白质浓度降低，血浆胶体渗透压降低，导致肾小球滤过率增加，尿量增加；再者，补液后血流量增大，由于肾血流量的神经-体液调节机制，促使肾动脉扩张，尿液生成增加。
3.2 肾缺血再灌注损伤[3]
实验中我们观察到，肾缺血30min后再灌注，尿肌酐浓度和内生肌酐清除率Ccr都较缺血前的降低了，说明肾小球受到了损伤，导致其滤过作用降低。缺血再灌注的发生机制如下：
1 活性氧损伤作用：线粒体产生活性氧增加；血管内皮细胞黄嘌呤氧化酶形成增加，通过通过黄嘌呤氧化酶途径产生大量活性氧；白细胞呼吸爆发产生大量活性氧，儿茶酚胺的自身氧化，诱导型NOS表达增加，都导致活性氧的大量产生，再加上再灌注后机体清除活性氧的能力下降，更是增加了肾内活性氧含量。这些活性氧攻击细胞膜，造成膜脂质过氧化，使蛋白质分子发生氧化反应，引起DNA损伤，破坏了细胞间基质，造成细胞功能障碍。活性氧是各种损伤机制学说中重要的启动因素。
2 钙超载机制：缺血再灌注后大量产生的活性氧破坏细胞质膜和细胞器膜，造成膜的通透性增加和结构损伤，从而使胞外的钙离子内流增加，胞内肌浆网和内质网钙离子的转运障碍；缺血再灌注后，氧自由基引起了线粒体膜的损伤，抑制了氧化磷酸化作用，使ATP合成减少，ATP依赖性离子泵功能障碍；缺血缺氧时，胞内PH降低（胞内酸中毒），恢复灌注使胞内和胞外形成PH差，钠离子和氢离子交换增加，使胞内钠离子过荷，从而促进钠钙交换反转，使胞外钙离子大量内流；缺血再灌注时儿茶酚胺大量产生，通过α和β受体使钙离子内流增加。细胞内钙超载是细胞不可逆性损伤的共同通路。
3 白细胞的作用：缺血再灌注使肾内趋化因子生成增多，细胞粘附分子表达增多，致使白细胞聚集，大量的白细胞聚集在再灌注区，阻塞微循环，释放活性氧，释放各种颗粒成分，产生各种致炎性细胞因子，总之，白细胞活化后产生的各种趋化物质可以促使更多的白细胞聚集，引起微循环障碍，聚集的白细胞释放活性氧和各种生物活性物质，使炎症反应失控，造成再灌注后肾组织的损伤。白细胞聚集是缺血再灌注损伤引起各脏器功能障碍的关键步骤。
4 补体级联的损伤作用：缺血再灌注时期补体系统被激活，过敏毒素的释放和膜攻击复合物的装配直接或间接地导致缺血组织损伤，包括了补体介导的溶胞作用和补体级联反应释放大量促炎因子两个步骤。补体级联的激活是各种炎症反应发生和放大的主要动力。

【参考文献】
[1] 金春华主编.<< 机能实验学>> 北京：科技出版社 2006:102-105
[2] 2006刘先国主编 <<生理学>>（第二版） 科学出版社 2010：178-185
[3] 姜勇主编 .<<病理生理学>>. 北京:高等教育出版社 2011.06：173-181

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