DB37_T 4182-2020 单环刺螠（种质）.pdf

ICS 65.150 B 51 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 41822020 单环刺螠（种质）Sea sausage 2020-09-30 发布 2020-10-30 实施 山东省市场监督管理局 发 布 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会渔业标准化分技术委员会(鲁TC17/SC03)归口。本标准起草单位：山东省海洋资源与环境研究院、烟台市海洋经济研究院、中国农业大学烟台研究院。本标准主要起草人：刘丽娟、任利华、王力勇、姜向阳、王玮云、刘峰、刘晓波、姜会超、刘爱英、王凤青、何金霞、姜芳、崔艳梅。单环刺螠（种质）1 范围 本标准规定了单环刺螠Urechis unicinctus(von Drasche,1881)的术语和定义、学名与分类、主要形态与构造特征、繁殖、分子遗传学特性、检测方法和判定规则。本标准适用于山东省单环刺螠的种质鉴定和检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18654.2 养殖鱼类种质检验 第2部分：抽样方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 刚毛 bristle 由单环刺螠刚毛囊分泌的几丁质物质形成，包括腹刚毛和尾刚毛，腹刚毛位于口部略后方，尾刚毛分布于肛门周围，有辅助运动功能。4 学名与分类 4.1 学名 单环刺螠Urechis unicinctus(von Drasche,1881)。4.2 分类地位 螠虫动物门（Echiurioidea）、螠纲（Echiurida）、无管螠目（Xenopneusta）、刺螠科（Urchidae）、刺螠属（Urechis）。5 主要形态与构造特征 5.1 外部形态 体呈长圆筒状，前部略细，后部钝圆。口、肛门端位。体表遍布等大的皮肤乳突，其中位于腹刚毛附近的乳突呈环状排列，911环。身体淡红、紫红或棕红色。吻短，呈匙状。腹刚毛1对，黄褐色，弯向后方。尾刚毛913根，呈单环排列，弯向环外。见图1。图1 单环刺螠外部形态 5.2 内部构造 5.2.1 体壁 体壁为皮肤肌肉囊。5.2.2 体腔 体腔发达，腔内充满红色体腔液。5.2.3 消化道 消化道长而迂回，为体长的510倍，通过许多悬肠肌附着于体壁。5.2.4 排泄系统 肾管2对，位于体腔前端腹面，兼有生殖输出管和排泄的功能，肾管基部近肾孔处各有1个螺旋体。体后端的排泄腔生有肛门囊1对，呈长囊状。6 繁殖 6.1 性成熟年龄 雌性和雄性个体均在1龄性成熟。生物学最小型70 mm，体重约20 g。6.2 生殖细胞 生殖腺无特定形态，在繁殖季节由体腔膜产生原始生殖细胞，进而分化产生生殖原细胞，增殖形成精（卵）母细胞团，游离于体腔液中，再经增殖、生长、减数分裂，形成成熟的精、卵细胞，进入肾管。繁殖期肾管内充满成熟的精、卵，透过体壁可见雄性肾管为乳白色、雌性为橘黄色。6.3 怀卵量 成熟雌性可多次排卵。体重50 g60 g个体，怀卵量一般为1.5106粒3.0106粒。7 分子遗传学特性 线粒体细胞色素氧化酶亚单位I（COI）基因序列423 bp，1号单倍型序列如下：CGACCAGAAC GAATGCCTTT ATTTGTATGG GCCGTAGTCA TTACAGCAGT ACTATTACTT 60 TTATCCCTCC CAGTTCTAGC AGGGGCAATT ACTATACTTC TGACAGACCG AAACCTAAAT 120 ACCGCATTTT TCGACCCCCA AGGGGGTGGT GACCCTGTGT TATACCAACA TCTCTTTTGA 180 TTTTTTGGTC ATCCAGAGGT CTACATTTTA ATTCTCCCGG GCTTTGGGGC TATCTCCCAT 240 ATCGTCACAC AACACGCATC CAAAATAGAA AGATTTGGAA CACTAGGTAT GATCTATGCA 300 ATACTTGGAA TTGGGGTGTT AGGGTTCATT GTATGAGCTC ATCACATATT TACCGTAGGG 360 ATAGATGTAG ACACACGGGC ATACTTTACT GCAGCTACCA TAATTATTGC CGTTCCAACG 420 GGA 423 8 检测方法 8.1 抽样 按照GB/T 18654.2规定执行。8.2 外部形态 在充足自然光线下肉眼观察。8.3 内部构造 解剖后用肉眼观察。8.4 繁殖 8.4.1 性成熟年龄 养殖单环刺螠可通过查阅养殖记录确定年龄。8.4.2 怀卵量 取繁殖期且发育成熟的雌螠，用手术剪剪除雌螠两端，将肾管完整收集，用过滤海水洗净后，剪断肾管，使用洁净的烧杯收集流出的卵子。将获得的卵细胞全部收集于烧杯中，加入过滤海水稀释成1 000 mL的混合液，搅拌均匀，用移液管吸取0.1 mL，光学显微镜下计数，共取3次并计算平均值。8.5 分子遗传学特性分析 8.5.1 DNA 的提取 取体壁100 mg剪碎后，DNA提取试剂盒或常规酚-氯仿方法提取总DNA，灭菌双蒸水溶解备用。8.5.2 引物序列 DHCY-F：5-CGACCAGAACGAATGCCTTT-3；DHCY-R：5-TCCCGTTGGAACGGCAATAA-3。8.5.3 反应条件 反应程序：94 变性3 min；94 变性30 s，55 退火30 s，72 延伸45 s，35个循环；72 延伸5 min，4 保温。PCR反应液配方参见附录A。8.5.4 片段回收、纯化与序列测定 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，测序。9 判定规则 符合第5章要求，且COI基因片段测序结果与第7章序列CLUSTAL比对，K2P遗传距离小于4%，判定为合格。A A 附 录 A（资料性附录）PCR 扩增反应液 表A.1 PCR 扩增反应液 反应物 加入量 DNA 模板 50 ng100 ng 10 倍扩增缓冲液 2.5 L MgCl2(25 mmol/L)2.0 L dNTP(10 mmol/L)0.5 L 引物 DHCY-F(50 pmol/L)0.5 L 引物 DHCY-R(50 pmol/L)0.5 L Taq 酶(5 U/L)0.2 L 加超纯水配制成 25 L 的反应体系。_