娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛辅助繁殖技术的优化与应用_王立斌.pdf

1022023年 第53卷 第2期饲养管理收稿日期：2022-11-07基金项目：甘肃省教育厅产业支撑引导项目（2019C-03）；甘肃省重点人才项目（2022-0623-RCC-0307）；中央财政农业生产发展资金项目（NF-GSAU-202201）。作者简介：王立斌，博士，副教授，主要从事动物繁殖技术与生殖疾病教研工作。E-mail：通信作者：潘阳阳，博士，副教授，主要从事动物繁殖技术与生殖疾病教研工作。E-mail：panyangyang_娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛辅助繁殖技术的优化与应用王立斌1，余四九1，徐庚全1，樊江峰1，包永清2，郭淑珍2，马登录2，訾云南3，拉毛杰布3，潘阳阳1*（1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070；2.甘南州畜牧工作站，甘肃合作747000；3.夏河县畜牧工作站，甘肃夏河747100）摘要：人工授精技术已成为改良甘南牦牛的关键辅助性繁殖技术手段，研究发现娟姗牛是甘南母牦牛杂交改良的最佳父本，因此建立了一套标准化、易于操作的娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛的辅助生殖技术，对当地牦牛种质资源创新利用具有重要意义。本研究从待配母牦牛个体的筛选、群体的组建、饲养与管理、冻精质量与受精潜能的评估、牦牛发情临床鉴定、人工授精标准程序、妊娠诊断与管理等环节，对娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛的标准进行完善，在夏河县多家牦牛养殖合作社进行推广应用，并通过比较授精技术优化前后母牦牛的产道疾病、受胎率与产犊率，分析牦牛生产效果。结果显示，娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛辅助繁殖技术优化后，牦牛发情鉴定准确率高达85.98%，群体受配后整体妊娠率为85.86%，产犊率为92.09%，与传统授精技术相比显著提高；且授精后牦牛产道疾病发生率及胎衣不下、子宫脱出等围产期疾病发生率显著降低，说明优化后娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛技术可显著提升牦牛杂交改良的生产效果。关键词：牦牛；娟姗牛冻精；人工授精；优化；生产效果中图分类号：S814.3文献标识码：A文章编号：1006-799X（2023）02-0102-07牦牛主要分布在我国青藏高原及其相邻的高原地区，但由于其长期生活在高寒低氧的环境，且长期处于粗放管理模式，导致生长速度缓慢，性成熟、体成熟、成年牦牛体重、产奶量等性能均显著低于其他牛种，但作为高寒农牧区牧民赖以生存的重要生活资源，其经济价DOI:10.15979/62-1064/s.2023.02.0172023年 第53卷 第2期103值和生态价值潜力巨大1。甘南州位于青藏高原东北边缘，目前存栏牦牛数量约130万头，围绕牦牛开发的乳、肉产业已成为甘南州多个县（区）的经济支柱产业2。随着国家“黄河上游生态保护发展战略”和甘肃省“现代丝路寒旱农业产业发展战略”的实施，牦牛种质资源保护和创新利用对提升牦牛经济与生态价值至关重要3。通过杂交技术提高牦牛的乳、肉生产性能，不仅可以满足当地牧民的日常生活需求，而且利于促进牦牛相关高质量乳肉产品的开发与推广，提高农牧民经济收入，助推少数民族地区乡村振兴。同时，杂交技术还可以提高单个群体牦牛生产性能，减少优良种公畜的使用，有效减少牦牛群体饲养数量和单位草场载畜量，有利于青藏高原草场的保护与修复，对于黄河上游生态保护具有重要意义。在甘南牦牛种质资源保护的基础上，不同研究团队通过引进安格斯、荷斯坦、西门塔尔、娟姗牛等种公牛或优质冻精以改良甘南牦牛的生产性能4-5，并通过比较不同杂交方式下母牦牛的受胎率、产犊率、新生犊牛的发育速度、生产过程对母牦牛的伤害等因素，发现娟姗牛是牦牛改良的最佳杂交父本，且人工授精改良速度显著高于传统的自由交配模式，杂交后代在出生体重、生长速度、繁殖性能、产乳性能等方面均具有显著优势6-7。但人工授精辅助改良甘南牦牛的过程中仍存在繁殖效率不佳的问题，且很多基层技术人员或合作社技术人员操作不标准，使得牦牛组群母本利用率低下，产后胎衣不下、子宫脱出、难产、产后子宫内膜炎等围产期疾病常发。本研究结合团队近几年在甘南州开展的牦牛人工授精技术出现的问题，完善母牦牛个体筛选、群体组建、饲养与管理、冻精质量与受精潜能评估、常规化牦牛发情鉴定、人工授精标准程序、妊娠诊断与管理等各阶段的技术标准，优化技术操作规程，并在不同的牦牛养殖合作社中进行推广应用，比较牦牛繁殖效果和母牦牛围产期健康状况，旨在建立高效且易操作的娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛辅助繁殖技术，推动甘南牦牛产业高质量发展。牦牛个体筛选与群体组建1.1牦牛个体筛选牦牛为季节性发情家畜，发情期主要集中在79月份，因此需在56月份进行牛群组建。牛群组建过程中母牦牛选择时应做好体格测量，其个体选择标准如下：年龄为36岁，体重为100200kg，胸围为95150cm，体高为100120cm，体长为110180cm，管围为1218cm（图1）。组群前还要对牦牛生殖状态与生殖疾病进行检查，检测牦牛子宫状态（确定是否为初产母牛）、卵巢状态、是否存在产道炎症等，排除患有卵巢囊肿和卵巢萎缩等疾病的母牦牛，经严格筛选后，对每个个体进行耳标和颈标标记，做好检查记录。1.2牦牛群体组建将个体形态相似的母牛进行组群，为了便于管理和识别，每个群体数量不超过100头，在技术人员和管理人员数量满足的情况下可以多组建几个群体，每个组群投放23头阉割公牛，作为试情公牛，用于母牦牛的发情观察。组群牦牛饲养与管理新组建的牛群饲养方式以放牧为主，适当舍饲补充精饲料，促使牛群短期抓膘复壮，同图1牦牛个体筛选标准饲养管理1042023年 第53卷 第2期饲养管理时在草场放入舔砖以满足牛群对Ca、P、Fe、Zn等微量元素的需求，促进母牛性腺激素分泌，调控发情，提高牦牛发情率8-9。测定发现，加入微量元素后整个发情季牦牛的发情率为85.14%，显著高于未补充微量元素的牛群（表1）。放牧过程中应配备具有养殖经验的管理人员跟随，远离其他牛群，尤其是具有配种能力的公牛。若因放牧条件限制，应将组建的牛群尽量单独隔离，防止与其他牛群混群，可用围栏设备进行隔离。图2娟姗牛冻精密度检验冻精质量与受精潜能评估娟姗牛冻精采购于大连某家畜冻精制备公司，冻精运输和使用前储存在含有液氮的气罐中，使用时先对同一批冻精进行活力检测，具体操作如下：现场随机取出35支冻精，于3538的水浴锅中快速解冻，可通过摇晃加快解冻速度，解冻后解开细管的封闭端，在预热的35 载玻片上滴入精液，盖上盖玻片后立刻在显微镜下观察精子活力和密度，还可以借助计算机辅助计算精子活率和直线运动的精子数量，整个过程中尽可能使精子处于35恒温条件。图2为本试验中的娟姗牛冻精密度对比，表明娟珊牛细管冻精的精子密度应达到51081109个/支，活性精子的比例一般要到国际标准0.3以上，其中直线运动的精子数量不少于40%。牦牛发情临床鉴定4.1肉眼观察临床上牦牛的发情鉴定常采用肉眼观察和直肠检查结合判断，其中肉眼观察主要为：发牛群类别头数（头）发情头数（头）发情率（%）补充微量元素29625285.143.21a未补充微量元素28420873.244.05b表1不同牛群发情率比较注：同一列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），下同。注：A.正常密度娟姗牛冻精；B.低密度娟姗牛冻精情前期待配牦牛活动活跃，呈现出主动靠近试情公牛、精神不安、频繁摇动尾巴、爬跨同群其他母牛的行为；观察外阴部发现肿胀不明显，但黏膜较为干燥，呈现淡红色。处在发情期的母牛精神极度不安，采食和反刍活动减弱，会主动接近试情公牛，接受公牛或其他母牛爬跨，被爬跨时站立不动，呈现静立反射状态，尾巴偏于一侧，呈现愿意接受交配状态；观察外阴部发现外阴肿胀、褶皱减弱或消失、阴道湿润呈现潮红色、有分泌物排出，有时呈现透明的掉线现象。发情后期牦牛较为安静，又称安静期，主动远离公牛，性行为活动消失，不愿接受其他牛的爬跨；观察外阴部发现外阴肿胀消失，外部褶皱明显，内部黏膜呈现浅白色，留出的黏液呈现淡黄色且较为黏稠，个别牛体外阴周围或尾根可见清亮的干燥结痂。4.2直肠检查直肠检查是临床上鉴定牦牛是否发情较为实用且准确的方法，不需要高端的检测仪器，对牦牛伤害较小。主要是将手臂伸入母牦牛直肠内，通过触摸底部直肠壁，并根据子宫和卵2023年 第53卷 第2期105巢的变化确定牦牛的发情状态。具体发情状态鉴定标准如下：发情初期子宫颈较细，且较硬，无弹性，两侧卵巢大小不一，一般至少一个卵巢直径达到2.4cm左右，卵泡上有黄豆大小的凸起，触摸有波动感，卵泡直径在0.8cm左右视为发情牛10；发情期子宫变粗，较为松软，有弹性，卵巢上卵泡进一步增大，卵泡壁变薄，容易破裂，排卵完成后，卵巢中存在一个凹陷，诊断卵巢时，要注意进行卵巢上的黄体和卵巢囊肿等异常情况的鉴别诊断。人工授精标准程序5.1授精前冻精的准备授精前用75%酒精棉球对受精枪进行消毒，从液氮罐内快速取出所需冻精（每头牛准备1支冻精），立刻放入到3538 的水浴锅中快速解冻后，取出用酒精棉球擦洗，装入输精枪内，待酒精挥发干净，利用专业剪刀裁剪封口边缘，确保裁边平面整齐。将一次性授精塑料套管套入输精枪，保留包装塑料外膜，将输精枪含有精液细管的部分放入输精员背部或夹入腋窝，利用人体温度进行保温。5.2授精前直肠检查将受配牦牛固定于保定栏中，确保其自由站立。协助人员向左侧抬起牦牛尾巴，配种人员用0.1%0.2%的高锰酸钾冲洗牦牛肛门与外阴周围，右手戴长臂手套并涂上润滑剂，手掌朝上轻微旋转，润滑推开，深入母牦牛肛门，若难以进入，可先将23个手指伸入肛门，刺激牦牛排粪，再将整只手伸入肛门，清理直肠内所有粪便后，进一步进入直肠。当母牛出现努责时停止进入，并借助努责将直肠壁套入手掌，然后依次从外至内检查子宫颈、子宫角、子宫体和卵巢的状态，此时外阴部常有清亮黏液流出。5.3人工授精直肠检查发情期牦牛生殖器官状态后，用手指固定子宫颈，对外阴部及周围进行彻底清洗后，另一只手握住输精枪，对准阴门向上倾斜约45，将输精枪插入阴道（防止插入尿道口），再轻微平行进入阴道内部（授精前输精枪头部可不同角度轻微摆动，使其准确进入子宫颈口）。感觉输精枪穿过34个环状褶皱后，表明输精枪进入子宫体，此时可注射精液。在人工授精过程中，输精枪进入时动作要轻，防止伤害生殖道；注射精液要快，可借助注射力量使精液射入子宫深处；输精枪抽出时动作要慢，同时为防止精液倒流，直肠内的手掌可将子宫颈轻微向上抬。为保证配种效果，发情牦牛一般进行2次授精，结合牦牛放牧饲养的特点，在发情期当天晚上授精1次，第2天早晨间隔约12h再授精1次，以提高受精率。5.4完善人工授精记录在人工授精过程中，为了方便后续受配与妊娠情况的跟踪，在保定栏进行人工授精时要观察牦牛耳标、颈标是否齐全，并通过直肠检查记录牦牛生殖器官的生理状态，严格做好每日记录，记录的主要内容包括牦牛典型体貌特征、年龄、子宫的肿胀程度、卵巢大小、有无优势卵泡、胎次、两次的输精时间、冻精编号、输精技术人员等相关信息。牦牛妊娠诊断与管理6.1妊娠诊断目前临床上牦牛最常用的妊娠诊断技术为妊娠2个月的B超检查和34个月的直肠检查，两者相比各有优势。B超以实际图像的形式直接、精确地判断牦牛是否妊娠，结果具有直接性，且对妊娠牦牛刺激较小11。在经济条件和基层技术人员知识储备有限的条件下，直肠检查可作为牦牛妊娠诊断的有效方法，尤其是针对即将淘汰的母牛。直肠检查方法应参照人工授精时的检测方法，同时尽量减少对怀孕牦牛的应激，手掌触摸胎儿时动作尽量要轻，仔细感觉胎动等现象。若条件允许可将B超检查与直肠检查结果进行对比，两者相似度达到95%以饲养管理1062023年 第53卷 第2期饲养管理表2娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛优化技术发情准确率、妊娠率、产犊率比较表3娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛优化技术授精后子宫内膜炎、流产发生率比较上，可确定为妊娠。6.2妊娠管理妊娠初期应确保牦牛放牧在资源丰富的草场，若妊娠期发生在9月草场枯萎季节，应适当补充营养物质，满足怀孕牦牛的营养需求。由于牦牛的繁殖特性，妊娠中后期一般为11月至次年5月左右，该时间段青藏高原草场枯萎、环境温度极低，为减少母牛应激和流产的发生，可采用青贮饲料补充营养。同时冬季舍饲过程中要注重日粮的营养水平，可通过添加蛋白质、矿物质和维生素等营养物质调整日粮营养平衡12-13。冬季和早春寒冷季节若妊娠母牛饮用冰水，则易造成胃肠应激，引起子宫收缩，诱发流产，因此在冬春季节饮水方面应尽量供给温水14。通过娟姗牛冻精改良后，胎儿具有娟姗牛的生长特性，生长速度快，营养需求较大，体格相比于牦牛也较大。因此除满足妊娠母牛必需的营养需求外，还要做好营养平衡，防止营养过剩造成母体肥胖，诱发流产、难产等围产期疾病的发生15。在日常管理方面应遵循牦牛天然放牧的本性，使妊娠牦牛每日能够保持适当的运动量，增强体质，减少因过度肥胖而诱发难产的可能，同时草场内牛群密度不可过高，避免牛群在运动时出现打斗、顶架等行为，可有效防止机械性流产。娟珊牛冻精的应用成效项目团队于20142022年在夏河县牙利吉乡阿纳扎西、雪域更盼、彭次合牦牛养殖合作社推广应用了优化后的娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛辅助繁殖技术，通过比较发情鉴定准确率、受胎率与产犊率、授精后产道疾病发生率、产后疾病发生率，发现优化后的娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛辅助繁殖技术的发情鉴定准确率高达85.98%，群体受配后整体妊娠率为85.86%，产犊率为92.09%，各指标与传统技术相比具有显著提升（表2）；与传统技术相比，优化技术使牦牛人工授精后子宫内膜炎发生率下降2.02%、流产率下降11.09%（表3），产后难产率下降6.51%、死胎率下降5.2%、胎衣不下的概率下降7.74%、子宫脱出的概率下降4.11%（表4）。以上结果说明，优化后的娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛技术可显著提升牦牛杂交改良的生产效果、降低牦牛产后疾病的发生率，对甘南牦牛产业高质量发展具有重要意义。讨论与展望近年来，不同团队采用不同的父本进行甘南牦牛杂交取得了一定进展，如利用中国草原红牛杂交改良甘南牦牛，其后代牛群在体技术类别牦牛总数（头）发情数量（头）发情准确率（%）妊娠数量（头）妊娠率（%）产犊数量（头）产犊率（%）传统技术36426572.802.16a20075.472.65a16281.002.06a优化技术42836885.983.85b31685.861.54b29192.093.82b技术类别受配数量（头）子宫内膜炎妊娠数量（头）流产数量（头）流产率（%）发病数量（头）发病率（%）传统技术265145.280.36a2003819.001.26a优化技术368123.260.52b316257.910.85a2023年 第53卷 第2期107格大小和生长速度方面均具有明显优势16；安格斯冻精改善青海牦牛，犊牛出生体重显著高于本地牦牛，但生产过程中难产发病率较高。目前，甘南草原农牧交错区常用的父本以安格斯和娟姗牛为主，两者均为小型牛种，且耐粗饲、环境适应性较强，尤其是对高寒低氧环境具有很好的适应性。安格斯与甘南牦牛杂交，后代具有良好的产肉优势，如生长发育快、早熟易肥、胴体品质好、出肉率高等4。娟姗牛与安格斯相比，其后代除具有产肉优势外还具备产奶优势，单位体重产奶量和乳脂含量优势均可遗传到后代娟犏牛体内，后代雌性娟犏牛最高日产奶量可达40kg，且奶质营养成分与高原牦牛极度相似。综上可见，娟姗牛已成为甘南牦牛杂交改良的最佳父本，有利于高效生产高寒农牧区乳肉兼用型牦牛。同时为了避免大量种公畜的引进造成草场与生态破坏，人工授精辅助繁殖技术已成为改良甘南牦牛的主要繁殖方式，当地政府也投入大量资金支持基层技术人员培训，但由于技术规范标准的缺乏或者操作时各环节的失误，导致该技术利用效率不高。本研究通过细化各环节操作标准，比较繁殖效果及生殖疾病的发生率，优化建立了高质量的娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛辅助繁殖技术，并且积极进行推广和普及，这对甘南牦牛产业的发展具有重要的推动作用。发情诊断的精确性对人工授精效果具有显著影响，建立高效、简单且易操作的牦牛发情诊断技术是牦牛人工授精成功的关键。可视输精枪结合生殖道电阻值的测定已成为甘南牦牛杂交改良的关键技术手段，但仍存在一些不足之处，如电阻值的测定评判标准主要以奶牛为参考，缺乏牦牛的生理数据，因此得出的发情结果并不精确。与其他牛种相比，牦牛的生殖道相对较细，采用普通牛种的可视输精枪和电阻值测定仪的测定过程中，往往会对生殖道造成一定伤害，引发生殖道炎症等疾病，反而降低了受精效果17。基于以上问题，本研究结合基层技术人员的知识背景与操作可行性确定了简单的牦牛发情鉴定方法，即根据外阴部症状、黏液分泌情况、卵巢发育状况及牦牛行为特征来综合判断10。当然目前仍需开展一些牦牛发情鉴定相关的基础研究，为研发适宜于牦牛发情诊断的设备提供理论依据。妊娠诊断的精确性主要影响牦牛人工授精后的下游生产，养殖管理人员可以根据牦牛的妊娠状态及时调整饲养与管理方式，提高杂交改良的繁殖效果。目前应用B超和直肠检查判断牦牛妊娠情况的诊断时间主要在45d至2个月之间，但B超的普遍适用性与基层的经费保障和操作人员知识储备紧密相关，目前尚未普及18。当下关于牦牛的早期妊娠诊断仍需大量的科学攻关，课题组也在通过现代分子生物学挖掘牦牛在其妊娠血液中的靶标分子，如早孕因子等19，但将其研发为临床诊断试剂仍需开展大量工作。本研究从牦牛群体的组建到妊娠期管理的全过程完善和优化娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛辅助繁殖技术，并通过临床应用比技术类别产犊数（头）难产死胎胎衣不下子宫脱出数量（头）难产率（%）数量（头）死胎率（%）数量（头）发病率（%）数量（头）发病率（%）传统技术162159.260.35a148.641.05a1710.491.05a106.170.50a优化技术29182.750.28b103.440.50b82.750.40b62.060.62b表4娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛优化技术授精后相关疾病发生率比较饲养管理1082023年 第53卷 第2期饲养管理较，发现该技术优化后可显著提高甘南牦牛的受胎率、产犊率等指标，且可以降低产后相关疾病的发生概率，具有较强的适用性和推广价值。参考文献1马登录,郭淑珍,李保明,等.应用娟姗牛冻精杂交改良甘南牦牛效果观察J.中国牛业科学,2018,44(1):23-25.2崔王芳,何红芳.甘南州畜牧业促进农牧民增收的分析与思考J.畜牧兽医杂志,2021,40(6):122-123+125.3王自科,李积友,马冬伍.基于甘南牦牛产业提质增效关键环节之探析J.畜牧兽医杂志,2022,41(5):160-163.4石红梅,李鹏霞,丁考仁青,等.甘南牦牛杂交后代生长发育分析J.中国牛业科学,2022,48(3):17-19.5丁考仁青,石红梅,李鹏霞,等.甘南牦牛不同杂交组合生产性能分析J.中国牛业科学,2020,46(5):11-14.6郭淑珍,马登录,李保明,等.娟姗牛与甘南牦牛杂交后代(娟犏牛)的生长发育观察J.中国牛业科学,2018,44(5):12-15+20.7郭淑珍,马登录,赵光平,等.娟姗牛在甘南高寒牧区的适应性观察初报J.畜牧兽医杂志,2015,34(6):7-9.8文涛,安添午,谢荣清,等.犏牛生产中母牦牛人工授精技术J.草学,2021(6):73-75.9高丽娟.微量元素对乏情母牛发情、受胎作用的影响J.饲料与畜牧,2017(16):87-88.10樊江峰,余四九,徐庚全,等.牦牛发情后生殖器官变化及卵巢动态发育过程J.中国牛业科学,2020,46(3):9-15+51.11 李福寿,仁青加,颜庭胜,等.青海省天峻县牦牛的同期发情及早期妊娠诊断J.安徽农业科学,2014,42(22):7437-7438.12巴羊,贺顺忠,季艾娜,等.妊娠末期牦牛补Se-VE制剂对犊牦牛部分血清活性酶浓度的影响J.青海畜牧兽医杂志,2022,52(3):9-12.13潘浩,聂召龙,王通,等.牦牛妊娠后期能量和蛋白质维持需要量的研究J.动物营养学报,2020,32(8):3750-3759.14王强,妊娠母牛和犊牛的饲养管理J.现代畜牧科技,2017(7):49.15李春梅,李国梅,贺顺忠,等.妊娠后期母牦牛补Se和VE对犊牦牛生长发育的影响J.青海畜牧兽医杂 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