一株枯草芽孢杆菌发酵培养基和培养条件的优化_曹阳.pdf

年 月 第 卷第 期收稿日期：基金项目：牡丹江市应用技术研究与开发计划（编号：）作者简介：曹阳（），女，讲师，研究方向为植物保护，生物农药。一株枯草芽孢杆菌发酵培养基和培养条件的优化一株枯草芽孢杆菌发酵培养基和培养条件的优化曹 阳，孙平平，刘 彬（黑龙江农业经济职业学院，黑龙江 牡丹江 ）摘要：对枯草芽孢杆菌（）发酵培养基及培养条件进行了优化，结果表明：菌株最适发酵培养基为可溶性淀粉，酵母膏，；最适发酵培养条件为：接种量为，发酵时间为，温度为，值为，转数为 。关键词：枯草芽孢杆菌；发酵培养基；条件；优化中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，）：，：；，：；引言枯草芽孢杆菌（）具有抑制植物病害的能力，所分泌的抑菌物质对病原微生物的孢子萌发和菌丝生长均有抑制作用，可通过竞争性的生长繁育扩展生存空间以此来阻止植物病原真菌的生长繁殖，对真菌引起的病害防治效果尤其明显。枯草芽孢杆菌是自然界中分布广泛的非致病性微生物和植物内生性细菌，易于工业化生产，对人畜无毒、无害、无副作用且不污染环境，是一类重要的微生物农药资源。我国的微生物发酵研究处于新的发展阶段，在发酵基质选择及发酵条件优化方面都开展了很多的研究。普遍通过单因素实验、正交实验、响应面法中的一种或几种方法研究相应细菌菌株的最优发酵培养基，影响细菌发酵影响因子液有发酵液的配比组成、发酵液浓度等。很多学者对细菌发酵培养基做了大量的摸索。例如，杨铿等对解磷芽孢杆菌液体培养基进行研究确定其最佳发酵条件；李野等通过研究蜡质芽孢探杆菌，优化确定了发酵条件和发酵配方；贾玉等对根瘤菌多糖的发酵优化研究确定了最佳培养基配方；朱孔亮曾用泡菜中分离得到的菌 为出发菌株研究得出了较优培养基配方；侍宝路以筛选出的产细菌素乳酸菌进行研究，确定了最佳发酵条件。在枯草芽孢杆菌方面，朱晓立探索了枯草芽孢杆菌产芽孢发酵培养基的最佳配方；王晴等确定了具有生防潜力的枯草芽孢杆菌 最优培养基组分为葡萄糖 、酵母粉 及 （）。此外，刘亚楠等对枯草芽孢杆菌 的发酵条件进行了优化，结果表明：最优发酵时间 、接种量、发酵温度。本研究前期从水稻健康种苗中内分离到一株枯草芽孢杆菌 菌株，该菌株在室内拮抗试验中表现为对多种致病真菌有较好的拮抗效果，温室苗床抗病试验表明，该菌株对水稻立枯病具有较好的防治效DOI:10.16663/ki.lskj.2022.24.039曹阳，等：一株枯草芽孢杆菌发酵培养基和培养条件的优化绿色创新研究：工程与技术果，并对水稻有一定的促生增产效果，具有良好的应用开发前景。因此本研究以菌株发酵液对病原菌尖孢镰刀菌（）的抑菌率为指标，采用单因素试验对枯草芽孢杆菌发酵培养基和培养条件进行优化，为该菌株的工业化生产奠定基础。材料和方法 材料 菌株枯草芽孢杆菌 由黑龙江农业经济职业学院实训基地的水稻健康种苗中分离得到并保存；病原菌尖孢镰孢菌，由东北农业大学农学院病理实验室提供。培养基（）培养基：胰蛋白胨 ，氯化钠，酵母提取物，加蒸馏水至。（）基础发酵培养基：葡萄糖 ，酵母浸膏，加蒸馏水至。（）培养基：马铃薯 ，葡萄糖，琼脂 ，加蒸馏水至。方法 种子液的制备和指示菌的活化种子液制备：将斜面菌种 转接于液体 培养基中，在 条件下，震荡培养 。指示菌的活化：将保存在冰箱中的病原菌尖孢镰刀菌种转接到 培养基上，条件下，恒温培养。上清液抑菌活性测定采用滤纸法测定发酵液的抑菌活性。将活化好的尖孢镰刀菌用直径为 的无菌打孔器打孔取菌饼，放置到 培养基平板中心，在距离尖孢镰刀菌饼 处左右各放置一个无菌滤纸片，每个滤纸片上添加 菌株 发酵液，条件下培养，测量抑菌圈直径，计算抑菌率的大小。发酵培养基的优化（）最佳碳源的选择。用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉作为唯一碳源做单因素实验，基础发酵培养基中的其他组分含量不变，将的种子制备液接入碳源不同的种培养基中，条件下进行恒温振荡培养 ，测定其抑菌作用，根据抑菌率大小确定最佳碳源。（）最佳氮源的选择。用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、黄豆粉、玉米浆作为唯一氮源，基础发酵培养基中的其他组分含量不变，将的种子制备液接入氮源不同的种培养基中，条件下培养，计算抑菌率，根据抑菌率大小筛选出最佳的发酵培养基氮源。发酵条件优化（）接种量。以筛选出的最佳碳源、氮源的发酵培养基，分别按、的种子液接入发酵液培养基后，、条件下进行恒温振荡培养，每个处理次重复，制备发酵液后测定其抑菌作用，计算抑菌率，根据抑菌率大小筛选出最佳接种量。（）培养时间。以筛选出的最佳碳源、氮源的发酵培养基，将 的种子液接入发酵液培养基后，条件下进行恒温振荡培养，分别在、后制备发酵液，测定其抑菌作用，计算抑菌率，根据抑菌率大小筛选出最佳的发酵培养时间。（）培养温度。以筛选出的最佳碳源、氮源的发酵培养基，将的种子液接入发酵液培养基后，分别在、的不同温度下，条件下进行恒温振荡培养，每个处理次重复，制备发酵液后测定其抑菌作用，计算抑菌率，根据抑菌率大小筛选出最佳的发酵温度。（）值。以筛选出的最佳碳源、氮源的发酵培养基，将 值分别调成 、，在按照的种子液接入发酵液培养基后，条件下进行恒温振荡培养，每个处理次重复，制备发酵液后测定其抑菌作用，计算抑菌率，根据抑菌率大小筛选出最佳的 值。（）转数。以筛选出的最佳碳源、氮源、无机盐为基础的发酵培养基，按照的种子液接入发酵液培养基后，条件下，分别按照 、进行恒温振荡培养，每个处理次重复，制备发酵液后测定其抑菌作用，计算抑菌率，根据抑菌率大小筛选出最佳的发酵摇床转数。发酵优化前后抑菌活性比较滤纸法测定优化后的发酵培养基及条件下的发酵液对尖孢镰刀菌的抑制作用。将活化好的尖孢镰刀菌用直径为 的无菌打孔器打孔取菌饼，转接在直径为 的 培养基平板中心，在距离尖孢镰刀菌饼 处左右各放置一个无菌滤纸片，每个滤纸片上添加 菌株 发酵液，无菌水作为空白对照，每个处理个重复，放置在 恒温条件下的，测量抑菌圈直径，计算抑菌率的大小。年 月绿 色 科 技（）第 期 结果与分析 发酵培养基单因素筛选 最佳碳源对菌株 的抑菌率影响由图可以看出，菌株 在种不同碳源的培养基中的发酵液对尖孢镰刀菌的抑菌效果不同。其中，在以可溶性淀粉作为碳源时的发酵液对供试病原菌的抑制率最高，可达 ，其次为蔗糖、葡萄糖、麦 芽 糖 和 乳 糖，其 抑 菌 率 分 别 为 、，因此选择可溶性淀粉作为菌株 的发酵培养基的最佳碳源。图碳源对菌株 抑菌率的影响 最佳氮源对菌株 的抑菌率影响由图可以看出，菌株 在种不同氮源的培养基中的发酵液对尖孢镰刀菌的抑菌效果不同。其中，在以酵母膏作为氮源时的发酵液对供试病原菌的抑制率最高，可达 ，其次为牛肉膏、玉米浆、蛋 白 胨、黄 豆 粉，其 抑 菌 率 分 别 为 、，因此选择酵母膏作为菌株 的发酵培养基的最佳氮源。图氮源对菌株 抑菌率的影响 发酵条件单因素筛选 发酵接种量对菌株 的抑菌率影响由图可以看出接种量为的发酵液抑菌活性呈现上升的趋势，接种量为时的发酵液抑菌活性最低，为 ，接种量为时的发酵液抑菌活性最高，达到 。值为时的发酵液抑菌活性呈现缓慢下降的趋势。因此确定接种量为时是菌株 的最佳发酵接种量。图不同接种量对菌株 抑菌率的影响 发酵培养时间对菌株 的抑菌率影响以优化后的初始培养基进行发酵培养，分别在不同时间点进行抑菌测定。由图可以看出发酵 的发酵液抑菌活性呈现上升的趋势，发酵 的发酵液抑菌活性最低，为 ，而发酵 的发酵液抑菌活性最高，达到 。的发酵液抑菌活性呈现缓慢下降的趋势。因此确定菌株 的最佳发酵时间为。图发酵时间对菌株 抑菌率的影响 发酵培养温度对菌株 的抑菌率影响以优化后的初始培养基进行发酵培养，分别测定不同温度下的发酵液抑菌率。由图可以看出发酵温度为 的发酵液抑菌活性呈现上升的趋势，发 酵温 度为 的发 酵 液 抑 菌 活 性 最 低，为 ，时 的 发 酵 液 抑 菌 活 性 最 高，达 到 。时的发酵液抑菌活性呈现缓慢下降的趋势。总体而言，温度对发酵液的抑菌活性影响不大，比较平稳。图发酵温度对菌株 抑菌率的影响 发酵 值对菌株 的抑菌率影响以优化后的初始培养基进行发酵培养，分别测定曹阳，等：一株枯草芽孢杆菌发酵培养基和培养条件的优化绿色创新研究：工程与技术不同 值的发酵液抑菌率。由图可以看出，值为 的发酵液抑菌活性呈现上升的趋势，值为 时的发酵液抑菌活性最低，为 ，值 为 时 的 发 酵 液 抑 菌 活 性 最 高，达 到 。值为 时的发酵液抑菌活性呈下降趋势，因此确定 值 为菌株 的最佳发酵 值。图不同 值对菌株 抑菌率的影响 发酵摇床转数对菌株抑菌率影响以优化后的初始培养基进行发酵培养，分别测定不同摇床转数的发酵液抑菌率。由图可以看出，摇床转数为 时的发酵液抑菌活性最低，为 ，随摇床转数逐渐增大，发酵液抑菌活性也逐渐增高，转数为 时，抑菌活性最大，抑菌率达到 。而后呈现缓慢下降的趋势。因此确定菌株 最佳发酵摇床转数为 。图摇床转数对菌株 抑菌率的影响 结论与讨论枯草芽孢杆菌属因其能够产生多种有效抑制病原微生物的次生代谢产物，是研究的热点方向。枯草芽孢杆菌对营养的要求比较低，但不同亚种对营养的利用率也不同，通常在进行发酵条件探究实验时，对单一菌种进行具体研究，去探寻适合其发酵及产次生代谢产物的营养源种类。培养基的组成和配比是否恰当对枯草芽孢杆菌生长和抗菌物质合成有巨大影响。大量研究表明，枯草芽孢杆菌不同的发酵条件，包括温度、值等对其产生的抗菌物质会产生不同的影响。本研究通过对枯草芽孢杆菌 发酵培养基及条件的研究，确定最佳碳源为可溶性淀粉，最佳氮源为酵母膏，最佳发酵接种量为，最佳发酵温度为，最佳发酵时间为，最佳发酵 值为，最佳发酵摇床转数为 。该研究结果可为后续抑菌物质进一步的分离纯化及抗菌蛋白的鉴定研究提供理论基础，为其他枯草芽孢杆菌抑菌性能及其抑菌物质的研究提供借鉴。参考文献：朱晓立，俞巍蔚 枯草芽孢杆菌产芽孢发酵培养基的优化研究化工设计通讯，（）：李达，姜媛媛，周洋，等饲用枯草芽孢杆菌高密度发酵培养基的优化 东北农业科学，（）：刘雪，叶婧，穆长青，等枯草芽孢杆菌 菌株发酵条件的研究 中国农学通报，（）：谢凤行，张峰峰，周可，等水质净化乳酸菌的分离鉴定及发酵参数优化微生物学报，（）：胡亚杰，韦建玉，卢健，等 枯草芽孢杆菌在农作物生产上的应用研究进展 作物研究，（）：游景茂，熊坤，穆森，等 内生细菌 的鉴定及对白术根腐病的生物防治研究中国中药杂志，（）：侍宝路，王梓旭，胡丹丹，等产细菌素乳酸菌的筛选及其发酵牛奶的工艺优化饲料工业，（）：贺晓凌，张先楠，孟红艳，等响应面法优化产细菌纤维素菌发酵条件天津工业大学学报，（）：孔菲，蔡宇杰，许晨，等海洋细菌 发酵产色素培养基的优化报 食品与生物技术学报，（）：贾玉香，耿晓琦，黄正梅，等根瘤菌多糖的发酵优化及抗肿瘤活性食品与发酵工业，（）：杨铿，梁晓华，杨莺莺，等解磷芽孢杆菌 液体培养基及发农酵条件的优化广东农业科学，（）：陈敏，郭旭文，李春远，等解淀粉芽孢杆菌 的抑菌活性及其液生体发酵条 件的优化 生态科学，（）：赵新林，赵思峰枯草芽孢杆菌对植物病害生物防治的作用机理湖北农业科学，（）：韩长志，周银钩状木霉与枯草芽孢杆菌在核桃根际土壤中的定殖研究 北京林业大学学报，（）：李健，何鹏飞，李咏梅，等 枯草芽孢杆菌 在柑橘上的定殖能力及其防治绿霉病 效 果 华 中 农 业 大学 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台、数字底板建设奠定了基础。在“四预”平台基础上，利用长系列水文径流等资料，基于来水、需水预报模型，利用水资源优化配置模型对茶园水库的水资源进行合理配置，进行了水资源优化配置与调度的初步探索，为后续清水江数字孪生流域建设、水资源管理建设奠定了扎实的基础，为数字孪生防洪“四预”、水资源管理调配提供借鉴与参考。后续可以收集更为详细的历史径流系列资料，进一步提高洪水预报、水资源来水预报精度，为防洪、需水、供水提供更为准确的决策依据，为茶园水库防洪、水资源配置与调度提供有力的支持。参考文献：蔡阳，成建国，曾焱，等加快构建具有“四预”功能的智慧水利体系中国水利，（）：李国英推动新阶段水利高质量发展为全面建设社会主义现代化国家提供水安全保障中国水利，（）：魏向阳，祝杰，朱玉坤，等黄河流域防汛智能化探讨中国防汛抗旱，（）：，黄艳，喻杉，罗斌，等面向流域水工程防灾联合智能调度的数字孪生长江探索水利学报，（）：黄艳数字孪生长江建设关键技术与试点初探中国防汛抗旱，（）：李文学，寇怀忠关于建设数字孪生黄河的思考中国防汛抗旱，（）：陈月华，林少喆，赵梦杰淮河流域防洪“四预”试点和演练中国防汛抗旱，（）：李琛亮永定河“四预”智慧防洪系统建设初探中国防汛抗旱，（）：范光伟，王高丹，杨跃，等珠江流域抗旱抑咸“四预”系统研发与应用中国水利，（）：，廖晓玉，高远，金思凡，等松辽流域智慧水利建设方案初探中国防汛抗旱，（）：，金思凡，廖晓玉，高远数字孪生松辽流域防洪“四预”应用建设探究中国水利，（）：，王权森长江中下游行蓄洪空间数字孪生建设方案构想人民长江，（）：中华人民共和国水利部 年全国水利发展统计公报北京：中华人民共和国水利部，张永平山东省水资源合理配置交互式情景共享模拟系统研究与应用济南：山东大学，檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶 （上接第 页），（）：，：李野，张小平，张克强，等蜡质芽孢探杆菌 发酵条件探讨及培养基优化微生物学通报，（）：张雷芽，赵长山，何付丽解淀粉芽孢杆菌 的摇瓶发酵条件优化东北农业科学，（）：