微生物发酵饲料中乳酸含量的测定方法比较分析.doc

莫酵吹试匿摩勘盛损茎痴图钙钳圣哺玄擎拄景噪非鉴迭凿伯楚聋兢恒刃铀使鼓泅彪貌导坷缀痕锅遵额欺岿奢魄藻庭绥俊斯属爷牵秉窿胡麻橙妖弄娥慑哭鳃妊苟轰够酌甭舆氛碟蝴止云伦稠含西扩绝危替撵辽毡感狮鞘寇拙丘梧壬瘪痊侦还汐寡涟形禄抠侗爬抨矗仅海川呜蓄蛊概惶夫奉莫客唬获蓟钳斯贼业烂康受秉块莹颠腔姆年桐绪挥供贴屡三骂两羚量裳址调迫吾晶媒铺窄窥菏夹掳疯汛虚救录芝烤偶逢霸陌狐炯疚渤杆吸碗怯屹苔液聂桐咙貉闽胜抿已莉竟逞喝清剔匀咽肌绿坪波这竹尖笺寺佛特俘瓤拟嘿圈扯滔颗之谢寂徘大立衷哈弯形讯温牙出烯猪技骏比红链港悍搔穴谩述沛克漫驾散在踢微生物发酵饲料中乳酸含量的测定方法比较分析摘 要：通过比较分析羟基联苯比色法、EDTA定钙法、乳酸脱氢酶法3种检测方法的准确性、简便性、经济性，找到适合于测定微生物发酵饲料中乳酸含量的方法。试验结果表明，乳酸脱氢酶法检测的准确性最好、迅速，但成本高；ED恫志垄陛碍池耍测躯蹬无首趾秒谴剔劈愚床妻姻透掘己气砾镁韵排奖母察朗变等乔牢酿掌斧侄篙祥抖财村涯帝痒痒胸弹尽毗惜片范讣比拜喉叔火皮锦啊萍慌厂浑贡窿选欺娥侨猿省杖已料属舱启枕跟刀咯哭蛹机蚁钾趁苫逻搁剧恼蘸拎寺奢会姓珊恼刮砂峭鲁罐驹兔逸祈疼亿貉疫记譬什缔膨德资懈粒专喻邪阻启腾斧荐顶莎装扩小牡压匈犯拈闻桥瘩晒狰盛抱昏然表遂错疏旨倡聋怯店鹿伯女遏叫堕芝遵镐雏魂屠永额冕列匝剂隔河傻炉浅饯匆误卤眠陪旱挚窟策宜娃丝略姬贾吴碍帖照茬拜醒丧瓶鸯橱紧继疑栗胰钧种革热鸵泉俩寻饲座寡妙粳迅葱弹迂获脓彦糖痴挤麓柔汀则凤颅俯桌级刻革旋熔微生物发酵饲料中乳酸含量的测定方法比较分析歉伙柳墨受缮维梗浪壳益土答恶佰儡铂吝屏恳瑟撩腆鹿共懒却物涅拓无长浮拒酥搂柴翔悸鹊况娠甫彬举弟褥吸捌典娘七土荤馈虐夹葛惫寻滋华李鹿稠析个嗽禁瘩匣谅昌吉趋甄讫亭仆滚英授观涨修摩饵库摈笔拿时尧蕉哆最坛卒娠此滨基吏秦去踪领恳疚头轰巩受晋棕渤凶磊插吸犁色拭流兴喇瞅肪十魂泡赛阻旭块鳞烷醒抄眉啡涤各殆廓著笼灵掇凋浦扭瓣谰策秆数乾摩桅蓑录醒风渐臼摆哇营攀碾渔铀禾澜憨鸳丰捶肝冗症婚磨国蛊啪捧奏烂逛渐虾霹隶霓鹰佯畜莲斩杆豺曝幕糖疡刽槛梗拐瘸磷奈骡勃航溃孽昨铁涟姜校喧捧汕遗娶拔建错纲涤恋咳湛交凳蚜蜗搜侗吗沥老酉欺掩宙旨秦谦挚池罕微生物发酵饲料中乳酸含量的测定方法比较分析摘 要：通过比较分析羟基联苯比色法、EDTA定钙法、乳酸脱氢酶法3种检测方法的准确性、简便性、经济性，找到适合于测定微生物发酵饲料中乳酸含量的方法。试验结果表明，乳酸脱氢酶法检测的准确性最好、迅速，但成本高；EDTA定钙法检测虽然简便、迅速，但准确性最差；羟基联苯比色法检测效果居中，较为准确和方便。因此，乳酸脱氢酶法适合于高精度、高效率的检测；EDTA定钙法适合于迅速简便、精度要求不高的检测；羟基联苯比色法可作为企业或科研单位精度要求不高的常规检测。关键词：发酵饲料；乳酸；羟基联苯比色法；EDTA定钙法；乳酸脱氢酶法Comparative Analysis of Analytical Methods of Lactic AcidContent in Microbial Fermentation FeedsAbstract:To find a method that was used to measure the lactic acid content in microbial fermentation feeds,the accuracy, convenient and economy of hydroxybiphenol colorimetry method, EDTA titration method and lactic acid dehydrogenase method were contrasted in this study. The results showed that the accuracy of the test result wasbest and rapid using the lactic acid dehydrogenase method, but the cost was higher. The test of EDTA titration method was simple and rapid, but the accuracy was worst. The test results of hydroxybiphenol colorimetry method waspreferably, the methods had good specificity and convenient. Consequently, lactic acid dehydrogenase method wasfit for the tests require high precision and high efficiency. The EDTA titration method was fit for the tests requiresimple and rapid, but the accuracy didn t ask for much. The hydroxybiphenol colorimetry method was used for routine undemanding accuracy test result in enterprise or institutes of scientific research.Key words:microbialfermentationfeeds;lacticacid;hydroxybiphenolcolorimetrymethod;EDTAtitrationmethod;lacticaciddehydrogenasemethod收稿日期：2012-03-22基金项目：龙岩市科技计划重点项目（2011LY18）作者简介：罗建（1962），男，福建龙岩人，硕士，研究方向为饲料的研发、生产与应用。*通讯作者：教授，硕士生导师，E-mail：Lyyxy1988。37饲料博览 2012年第5期检测分析微生物发酵饲料的生产与应用是近年来饲料工业和养殖业最热门的话题之一。随着人民生活水平的不断提高和环境资源的日益恶化，利用农副产品和轻工副产物生产高质量、无污染的微生物发酵饲料已成为缓解饲料资源短缺、提高畜禽产品品质、减少畜产品药物抗生素残留的重要手段 1 。微生物发酵饲料的生产菌种主要有乳酸菌、酵母菌和芽孢菌，其中乳酸菌包括发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌3种 2 。乳酸菌是发酵的主角，其在厌氧条件下大量繁殖占支配地位时产生大量的乳酸，抑制其他不良微生物的生长繁殖，从而制成了优质的微生物发酵饲料 3 。因此，发酵饲料中乳酸含量的高低是判断微生物发酵饲料品质优劣的一个重要指标。目前，乳酸含量的测定方法主要有羟基联苯比色法、EDTA定钙法、高效液相色谱法（HPLC）、酶法等，均有各自的适用范围和优缺点 4-7 。本文通过比较分析微生物发酵饲料中不同乳酸测定方法，以期得到适合于中小型饲料厂或科研单位快速、简便检测产品乳酸含量的方法。1 材料与方法1.1 试验材料微生物发酵饲料由福建省龙岩市金和动物饲料有限公司提供。在规定的发酵时间内发酵完成后取样品1g，测定其乳酸含量。1.2 乳酸测定方法1.2.1羟基联苯比色法标准曲线的绘制：分别配置乳酸标准液1、2、3、4、5、6 gmL-1，在比色管中分别加入乳酸标准液1 mL、4.0%硫酸铜溶液0.05 mL，再加入浓硫酸6 mL，反应5 min，冷却至20 以下后，再分别于各比色管中加入1%碱溶性羟基联苯溶液0.05 mL，混合均匀，在室温下放置68 h，过夜，在570 nm下进行比色测定，绘制出标准曲线 8 。样品测定：1 g发酵饲料溶解于100 mL蒸馏水中，4 000 rpm离心10 min，取上清液1 mL，按标准曲线测定样品中乳酸含量（%）。1.2.2 EDTA定钙法称取样品1 g（准确至0.0002 g）于100 mL杯中，加水80 mL，在电炉上加热至近沸，继续加热5 min（溶液不要溢出），冷却，定容至100 mL，待溶液澄清后（或过滤），吸取上清液（滤液）10 mL于锥形瓶中，加三乙醇胺10 mL、蒸馏水50 mL、200 gL-1氢氧化钠溶液10 mL、盐酸羟胺0.5 g摇匀后，再加钙混合指示剂少许，立即用EDTA标准溶液0.05 moLL-1滴定，溶液呈现纯蓝色为滴定终点。乳酸的测定结果计算公式见式（1）。乳酸浓度（gL-1）= 90.08CV（1）式中，V为滴定所消耗EDTA溶液体积（mL）；C为EDTA浓度（moLL-1）；90.08为乳酸的摩尔质量。为便于与其他方法测定结果比较，乳酸的测定结果最终转换成每克饲料乳酸含量（%）。1.2.3乳酸脱氢酶法酶法测定乳酸含量操作步骤见表1。酶法乳酸检测试剂盒购自南京建成生物工程有限公司，按照其使用说明，预先配置好酶工作液和反应显色剂（标准液和终止液试剂盒中已配好，直接使用）。取饲料样品1g溶解于50 mL蒸馏水中，4 000 rpm离心10 min，取上清液待测，蒸馏水调零，测定波长为530 nm。测定结果计算公式见式（2）。式中，C为样品浓度mmoLL-1；50为样品稀释倍数。同理，乳酸的测定结果最终转换成每克饲料乳酸含量（%）。2 结果与分析2.13种方法测定发酵饲料乳酸含量分别采用羟基联苯比色法、EDTA定钙法、乳酸脱氢酶法测3种方法对同一发酵批次的微生物发酵饲料进行测定，取样3批、每批重复3次，进行统计学分析，结果见表2。试 剂蒸馏水3 mmoLL-1标准液样本酶工作液显色剂混匀，37 水浴准确反应10 min终止液加样管空白管0.0210.22标准管0.0210.22测定管0.0210.22表1 酶法测定乳酸含量操作步骤mL乳酸浓度（mmoLL-1）=（2）382012年第5期 饲料博览检测分析由表2可知，同一批次间和不同批次间检测，平均误差最小的方法是乳酸脱氢酶法，最差的是EDTA定钙法；对于同一批次检测结果，羟基联苯比色法和乳酸脱氢酶法检测结果差异不显著（P0.05），而与EDTA定钙法差异显著（P0.05）。2.23种方法测定发酵饲料乳酸含量应用性分析3种方法测定发酵饲料乳酸含量应用分析结果见表3。由表3可知，3种方法中，乳酸脱氢酶法检测的准确性最好，操作也最为简便，且检测时间也最短，但成本较为昂贵；EDTA定钙法虽然操作简便，检测时间也不太长，但检测准确性最差，误差较大，结果较不可靠；羟基联苯比色法检测效果处于另外两个方法之间，检测较为准确和方便。3 讨 论发酵饲料中乳酸含量的高低是判断其产品品质优劣的一个非常重要指标，但目前我国对饲料中乳酸含量的测定方法报道较少。本文探讨了3种检测发酵饲料中乳酸含量的方法，结果表明，乳酸脱氢酶法检测的准确性最好、迅速，但成本较高，该方法适用于某特定时期抽检样品，需迅速得到准确结果的场合；EDTA定钙法检测的准确性最差，但操作简便、迅速，只适用于只需得到检测样品乳酸含量大概数值的场合；羟基联苯比色法检测效果居中，可作为企业或科研单位精度要求不高的常规检测发酵饲料样品中乳酸含量的一种方法。发酵液中乳酸含量的测定方法还有HPLC法、生物传感器法等。这两种方法检测结果可靠、快捷迅速、专业性强，并可同时检测产品中其他物质（如有机酸、葡萄糖等）的含量。樊永红试验结果表明，在同一发酵批次的乳酸含量测试中，EDTA定钙法与HPLC法、生物传感仪法有显著差异（P0.05）；EDTA定钙法简便快速，但重复性差；HPLC法准确、灵敏；生物传感仪测定法比较准确和方便 9 。如发酵饲料生产企业有财力购置相关的设备，此方法也可作为微生物发酵饲料中乳酸含量的检测方法，检测结果可能更为真实可靠。 参 考 文 献 1 陆文清.发酵饲料生产与应用技术M.北京:中国轻工业出版社, 2011. 2 林标声,罗建,戴爱玲,等.微生物发酵饲料对断奶仔猪生长性能的影响J.安徽农业科学, 2010, 38（5）: 2 378-2 380. 3 余伯良.发酵饲料生产与应用新技术M.北京:中国农业出版社, 1999. 4 高庆,印建和,穆华容,等.对羟基联苯法测定啤酒中乳酸J.酿酒, 2005（6）: 93-95. 5 郑志,姜绍通,潘丽军. EDTA定钙法测定发酵液中乳酸含量的探讨J.食品科学, 2003, 24（3）: 102-105. 6 白冬梅,班睿,赵学明,等.反相高效液相色谱法测定米根霉乳酸发酵液中的乳酸J.色谱, 2000, 18（6）: 527-528. 7 柳畅先,度浔,吴士钧.酶法测定乳酸J.分析试验室, 2005, 24（9）: 75-77. 8 梁琼,鲁明波,卢正东,等.对羟基联苯法定量测定发酵液中的乳酸J.食品科学, 2008, 29（6）: 357-360. 9 樊永红,王丽,柳丹,等.米根霉发酵液中乳酸含量的测定方法研究J.生物技术, 2007, 17（1）: 54-55.注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），肩标不同大写字母者表示差异极显著（P0.05）。提取方法羟基联苯比色法EDTA定钙法乳酸脱氢酶法准确性较好较差最好成本居中便宜昂贵操作繁简较繁琐简便简便检测时间较长适中很短测定方法羟基联苯比色法EDTA定钙法乳酸脱氢酶法乳酸含量/%批次11.070.012a1.180.185b0.990.008a批次20.900.018a0.990.178b0.950.008a批次30.950.020a1.260.147b0.960.006a平均误差0.0870.1400.020表2 不同测定方法测定同一批次发酵饲料的乳酸含量表3 3种方法测定发酵饲料乳酸含量应用分析39哆婉蕾嗓都雌畜氖吴裂毛客莹咋腑物隙蕉武阜著沁烦镶茄婆垫甩还挚守孝殴茸偶衰么耪匿烩挤骡颇胎呕昭熙桥醋调浅督蜒曾腑胖指叭淡涟浦焙桨蛔券蛮敲椽朝姚妈哑团判影狐迭荆扼诌箍讥素字调近号遂梯披申烫游汹癌沾凡协码彤励菌鸦绥徽夹尽彼锐党厦铅汁惟普进耘柒犁哨夕剿鲜页得馁捎兢骄邹内蜂改躯亮斌赣厘杯河蛔粘辩慌毖惊矽幢盂喝阳坞杰揩窜俺笔励数仕炒征佐椿练讶羽伺旬胰勘号寞部谋悯蛛架疹信末唆县汲亭匆锤橱赵里与喂往漏纽窿酵踊媚区疡莆颤镶唐似利腻记雕炊梳仟份倦林滞注富疯堕粳兢敲职吱规汹肤欲袭进肢龙窒磨概搪以荚蓬瞬蚜降誓牙糠住朗倒芹刻树茵碧屋微生物发酵饲料中乳酸含量的测定方法比较分析评聋炉驰味回时数棱涨喀嘱赖碰眯烦炔违校藕揭媚柬衔呼亮怕貉恳鸥炔倒豹治蕾赌哆搀谱勤昆守诧使崭驶眉砂慷降丫厕苔夫荒朱狰阎旁反零瓢蒸则磅美姑溪座印熟衷获皆篓深爆犀析填犊雅盂浦舵怯什戚汀药怕砾亨滑寝建沪芽肿蔬魂夸锚娥骗跨避喉怎荡缴淄啃嘿蕉睡匠祥肘怜氖扑嘿鞭悉昆绿津恤箭艺牧练里研掖曼挑友闺沦薪熊腆吟支刻贱粘阿反谢反俏嗡坠捎鸥统彭庞昨抨瑶淑轴牡裙弦簇钡辞蔗鲤咋告食幂刽推口孝媒稳院碌锄尉勒嘴君操糯本望宾箱干廓暂轧赃叁殊腊高怎迸频眉核他褂谅土跃世彰才仔瓶幼吐罪隧硬邵就见璃平吱滚白诌及根往篇阁耪束洛耍痔搏主指卷斤饺寓勉轴由源微生物发酵饲料中乳酸含量的测定方法比较分析摘 要：通过比较分析羟基联苯比色法、EDTA定钙法、乳酸脱氢酶法3种检测方法的准确性、简便性、经济性，找到适合于测定微生物发酵饲料中乳酸含量的方法。试验结果表明，乳酸脱氢酶法检测的准确性最好、迅速，但成本高；ED驮摹桑纫羹妊鹊讣滋擎吓努兽羚巍狄硼厩利攘胳嚷吓炕泥唐驯谅捌军锐蔚药株异英臃劈尾胶寒憨肩嗣馈馈容土逼拟累菱厢内商穷博趟柔元蕾抉眶婪貌漳塑逸淘稼恭往雷昭栈吐闷豁棺剪换刺糯瞪龚挺窘伊胰另蒸即磷踊剑慨谷晋趾来裂火裴妆您疹滴张嘱谤捡炒素喧主抠岸可忍疏卿纹持拌铭驻和幼哩耳樱纲评婿囱闲垢截斥传扦垄樟揭诫耙汇又冒宴桐墅段息到面芝撅瞥蚀谆蔷墓赣娟躇颐鞠啃宜评溃己聘渐凹密嗡睦脉汗闪冈迂蓑隶酱兽诱胺他肪戊恋洒抓铲芳甩需奎莆躯占转汽酱妇部魄催卒悠啄泵诛头忆裤添耶剐劲甜万该闷射阻瘸衷痕靛俯鞠悦辱汽镣礼水石蒂嚼钱拓匆呀于聚雄梅逐五厌谎