慢性牙周炎病变位点EB病毒...SFRP1含量之间的相关性_史文秀.pdf

北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.130牙周炎是一类复杂的感染性疾病，学者广泛认为菌斑生物膜中的致病菌及其代谢产物与宿主之间相互作用是牙周炎致病的主要原因1,2。有学者认为 EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一种假定的牙周病原体3，疱疹病毒感染可能会诱导免疫抑制和细菌过度增殖，并可能将牙龈炎转变为牙周炎，或将稳定的牙周炎转变为进行性疾病4白介素-1（interleukin-1，IL-1）是单核细胞/巨噬细胞产生的促炎细胞因子之一，是牙周组织在受到外界刺激后激活免疫应答后产生，在牙周炎患者的唾液和牙龈组织中表达上调5,6。IL-1 含量随慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）加重而增多，IL-1 可以作为牙周炎的标记物7。分泌型慢性牙周炎病变位点 EB 病毒感染与 IL-1 和SFRP1 含量之间的相关性史文秀 刘惠萍 赵雪莹 李维善【摘要】目的通过检测慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）患者龈下菌斑中 EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）、龈沟液中白介素-1（interleukin-1，IL-1）和分泌型卷曲相关蛋白 1（secreted frizzled-related protein 1，SFRP1）的含量，探讨 EBV 感染与 IL-1 和 SFRP1 相关性，进而探讨 EBV 与 CP 进展的相关性。方法 选取 CP 患者轻度 23 例、中度 23 例、重度 24 例以及牙周健康者 15 例作为健康对照组，提取龈下菌斑及龈沟液，应用 SYBR Green 实时荧光定量 PCR 方法检测龈下菌斑中 EBV 的 DNA 载量，应用 ELISA 法检测龈沟液中 IL-1 和 SFRP1 含量。结果 轻、中、重度 CP 病变位点及牙周健康位点中 EBV 的阳性检出率分别为30.4%、43.5%、75%和 13.3%，重度 CP 病变位点中 EBV 阳性检出率显著高于牙周健康位点（P 0.01）。轻、中、重度 CP 病变位点中 EBV DNA 载量均高于牙周健康位点，差异具有统计学意义（P 0.01），EBV 的载量随CP 的加重而不断升高（P 0.05）。IL-1 和 SFRP1 在不同程度 CP 位点中的总量和浓度均高于牙周健康位点（P 0.05）,IL-1 和 SFRP1 的浓度和含量均随 CP 的加重而不断升高（P0.05）；CP 病变位点中 EBV DNA 的载量与龈沟液中 IL-1 和 SFRP1 的浓度和总量均呈正相关关系。结论 EBV 的感染可加重 CP 的严重程度，EBV的活动性感染可能加重 CP 的炎症进而引起附着丧失。【关键词】慢性牙周炎；EB 病毒；白介素-1；分泌型卷曲相关蛋白 1【中图号】R781.4【文献标识码】A 【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2023.01.006Correlation between subgingival infection of Epstein-Barr virus and the content of IL-1 and SFRP1 in the lesion site of chronic periodontitis SHI Wen-xiu,LIU Hui-ping,ZHAO Xue-ying,LI Wei-shan.Department of Periodontology，The Affiliated Stomatology Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154007,China【Abstract】Objective To investigate the contents of Epstein-Barr virus(EBV)in subgingival plaque,interleukin-1(IL-1)and secreted frizzled-related protein 1(SFRP1)in gingival crevicular fluid of patients with chronic periodontitis(CP),and the correlation between EBV infection and IL-1 and SFRP1.Methods Twenty-three cases of mild,23 cases of moderate,24 cases of severe CP patients and 15 periodontal healthy patients as controls were selected.Subgingival plaque and gingival crevicular fluid were extracted,EBV DNA load in the subgingival plaque was detected by quantitative real-time PCR.The contents of IL-1 and SFRP1 in gingival crevicular fluid were detected by ELISA.Results The positive detection rates of EBV in mild,moderate and severe CP lesion sites and the control were 30.4%,43.5%,75%,and 13.3%,the detection rate of EBV in severe CP lesions was significantly higher than that in the control(P0.01).The EBV DNA load in mild,moderate and severe CP lesion sites was higher than that in the control(P0.01).The total amount and concentration of IL-1 and SFRP1 in CP were higher than those in the control(P0.05).The load of EBV DNA in CP sites was positively correlated with the concentration and total amount of IL-1 and SFRP1 in gingival crevicular fluid.Conclusions EBV infection can aggravate the severity of CP,and active infection of EBV may aggravate the inflammation of CP.【Key words】Chronic periodontitis;Epstein-Barr virus;Interleukin-1;Secreted frizzled-related protein 1基金项目：黑龙江省教育厅基本科研业务费基础研究项目（2019-KYYWF-1360）作者单位：154007 佳木斯 佳木斯大学附属口腔医院牙周病科通信作者：李维善，E-mail:,电话：[phone]北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.131卷曲相关蛋白 1（secreted frizzled-related protein 1，SFRP1）是抑制 Wnt 信号通路的一种分泌型糖蛋白，参与骨代谢活动，促进成骨细胞与骨细胞的调亡8。研究显示 SFRP1 在 CP 患者龈沟液及牙龈组织中的表达升高且与牙周破坏相关，SFRP1 的异常表达可促进牙周炎的发生发展9。牙周炎是牙周支持组织结构遭到破坏的过程，其特征为牙齿周围的牙龈附着丧失和牙槽骨吸收10。本探讨不同程度的 CP 病变位点的 EBV 含量以及与临床指标之间的潜在关系，分析龈下菌斑样本中 EBV 与 IL-1 和 SFRP1 的相关性，探讨 EBV在 CP 病变位点的增殖情况以及在 CP 发生发展中的作用。材料和方法1.主要试剂SFRP1 酶 联 免 疫 试 剂 盒（沪 震 生 物，HZ-1334）；IL-1 酶 联 免 疫 试 剂 盒（上 海 生 工，D711068-0096）；柱式病毒 DNA 抽提试剂盒（上海生工，B518267）；2X SG Fast qPCR Master Mix 试剂（BBI,加拿大）；pMD 18-T 载体（TaKaRa，日本）。2.研究对象选取于 2019 年 12 月至 2020 年 9 月在佳木斯大学附属口腔医院牙周科就诊的 CP 患者 70 名，其中男 36 名，女 34 名，年龄 3459 岁，平均年龄（45.15.0）岁。15 名健康对照者均来自佳木斯大学附属口腔医院职工，其中男 8 名，女 7 名，平均年龄（39.82.7）岁。CP 的诊断标准1为：轻度 CP：探诊深度（probing depth，PD）4 mm，附着丧失（attachment loss，AL）：12 mm，X 线示牙槽骨吸收根长 1/3；中度 CP：PD 6 mm，AL：34 mm，X 线示牙槽骨吸收：1/3 6 mm，AL 5 mm，X 线示牙槽骨吸收：根长 1/2，本研究通过佳木斯大学医学伦理委员会审议批准（批号：JMSU-KQ-2021-002），参加研究的全体人员均知情同意并签署知情同意书。两组人群均需满足的纳入条件：排除全身性疾病，如糖尿病，心血管疾病，骨质疏松症，血液性疾病等，女性非妊娠；无吸烟史；半年内内未进行过牙周治疗，3 个月内未服用抗生素，激素，避孕药，抗凝药；口内无活动龋，无严重错牙合畸形，无黏膜疾病8。3.临床检查记录所有研究对象全口牙的 PD、出血指数（bleeding index，BI）、AL 于牙周检查记录表，CP患者拍摄全口曲面断层片。4.样本采集和处理取样位点为研究对象上颌第一磨牙的探诊深度最深的位点，牙周炎患者取样位点满足 PD 4 mm，AL 1 mm，并排除该位点是由于咬合创伤，不良修复体等其他因素造成的牙周破坏；健康者取样位点必须满足 PD 3 mm，AL=0 mm，BI 1。取样前清除龈上结石及菌斑，对取样位点消毒干燥。对龈沟液的采集使用滤纸条龈沟内吸附，间隔 5 min，重复操作 1 次，将滤纸条预先称重，将两次吸有龈沟液的滤纸条置于预先称重的 EP 管中，前后的质量差即龈沟液的质量，将装有 2 条滤纸条的 EP 管置于-80 冰箱冷冻保存备用。收集龈沟液后，用无菌刮治器伸至牙周袋底轻轻刮除龈下菌斑，置于 EP管，加入 250 l TE 缓冲液，放置于-80 冰箱保存。5.ELISA 法检测龈沟液中 IL-1 和 SFRP1 含量从-80 冰箱中取出样本，冰上解冻，加入200 l ELISA 试剂盒中提供样本稀释液，在 4 离心机内 3000 r/min 离心 10 min，取上清液 200 l，其中 100 l 用于检测 SFRP1 水平，使用 SFRP1 酶联免疫试剂盒检测 SFRP1 浓度，进一步计算龈沟液中 SFRP1 的总量。100 l 用于检测 IL-1，使用 IL-1 酶联免疫试剂盒检测 IL-1 的浓度和总量。6.龈下菌斑中 EBV 含量的测定龈下菌斑 EBV DNA 的提取应用 Ezup 柱式病毒 DNA 抽提试剂盒进行。选取 EBV 高保守序列设计特异性引物11，正链引物序列为 5-AGTCC TTCTTGGCTACTCTGTTGAC-3，负链引物序列为5-CTTTGGCGCGGATCCTC-3，由上海生工生物工程有限公司合成，以 EBV DNA 为模板行普通PCR，扩增得到 91 bp 特异性克隆片段。质粒抽提纯化后，通过预实验选取合适标准品用于制备标准曲线。采用 SYBR Green 实时荧光定量 PCR 方法，反应体系使用 TaKaRa 公司的 SybrGreen qPCR Master Mix 试剂，使用瑞士的 LightCycler480 型荧光定量 PCR 仪进行 PCR 扩增。将待测龈下样品DNA 模板和标准品在同一 PCR 体系中完成检测，每个样本重复 3 次。根据熔解曲线峰值判断是否为北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.132特异性扩增，并由随机软件依据标准曲线自动给出每个样本的 DNA 拷贝数。7.统计分析采用 SPSS19.0 软件进行统计学分析，EBV 检出率采用2检验，各组间临床检测指标比较采用Wilcoxon 秩和检验，对龈沟液中 IL-1 和 SFRP1数据和龈下菌斑中 EBV DNA 载量作正态性检验，所有数据均不符合正态分布，IL-1、SFRP1 水平和 EBV DNA 载量的比较采用 Kruskal-Wallis 秩和检验。EBV 载量与 IL-1 和 SFRP1 之间的相关性检验采用 Spearman 相关系数。P0.05 则认为差异有统计学意义。结 果1.各组牙周检查指标情况 各组轻、中、重度 CP 组取样位点 PD、AL、BI 均显著高于牙周健康组（P0.05）（表 1）。2.PCR 产物用 PCR 方法扩增 EBV 目的基因，得到 91 bp的扩增产物（图 1）。3.EBV 检测结果的比较由表 2 可知，重度 CP 病变位点中 EBV 阳性检出率显著高于牙周健康位点（P0.01）。在 CP不同位点中 EBV 载量均显著高于牙周健康位点（P0.01），随着 CP 的加重，相应位点 EBV 载量不断升高，重度 CP 位点 EBV 载量高于轻度 CP 位点及中度 CP 位点且中度 CP 位点 EBV 载量高于轻度CP 位点（P0.05）。4.CP 病变位点和牙周健康位点中 IL-1 和SFRP1 的含量由表 3 可知，在 CP 不同位点中 IL-1 和 SFRP1表 1 各组牙周检查指标的比较（xs）临床指标牙周健康组（n=15）轻度 CP（n=23）中度 CP（n=23）重度 CP（n=24）年龄(岁)39.802.71 42.965.65 45.264.86 46.833.42PD(mm)2.270.533.870.22*5.540.55*8.791.19*AL(mm)01.390.49*3.430.50*5.790.82*BI0.530.502.740.74*3.170.76*3.750.43*注：*：和牙周健康组相比，P0.05 注：M:DNA Marker 图 1 PCR 反应合成的 EBV 目的片段表 2 CP 病变位点和牙周健康位点中 EBV 阳性率、载量及病毒载量范围EBV健康对照组（n=15）轻度 CP 组（n=23）中度 CP 组（n=23）重度 CP 组（n=24）EBV DNA 载量（xs，copies/l）0.110.080.220.11*0.320.17*#0.730.42*#EBV 阳性率（%）13.330.443.575.0*EBV DNA 载量范围（copies/l）0.0350.3600.0920.4760.1540.5790.1731.394注：*：和牙周健康位点相比，P0.01；#：和轻度 CP 位点相比，P0.05；：和中度 CP 位点相比，P0.05 表 3 IL-1 和 SFRP1 在 CP 不同位点中的含量（xs）项目健康对照组轻度 CP 组中度 CP 组重度 CP 组IL-1 浓度（pg/ml）21.486.0436.213.86*53.442.89*#68.512.45*#IL-1 总量（pg）11.983.8724.843.92*55.206.52*#108.978.40*#SFRP1 浓度（pg/ml）238.5016.31251.665.06*285.539.80*#306.418.95*#SFRP1 总量（pg）132.2216.12172.1015.05*294.5528.66*#487.4636.38*#注：*：和牙周健康位点相比，P0.01；#：和轻度 CP 位点相比，P0.05；：和中度 CP 位点相比，P0.05北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.133的浓度和含量均显著高于牙周健康位点（P 0.05）。IL-1 和 SFRP1 的浓度和含量均随 CP 的加重而不断升高（P 0.05）。5.EBV DNA 载量与 IL-1 和 SFRP1 的关系 相关性检测结果显示,CP 病变位点中 EBV DNA 载量与龈沟液中 IL-1 和 SFRP1 的浓度和总量之间均呈较好的正相关关系（表 4）。讨 论龈下菌斑内成分复杂，范华南等12在牙周炎龈下菌斑中鉴定出多达 138 属，303 种不同的微生物。传统上，CP 的病因被解释为定植在牙齿表面和牙龈沟内菌斑中的细菌引起的感染，细菌是感染性牙周病发生所必需的，但是 CP 的阵发性，间断爆发性和位点局限性等特点并不能用牙周致病菌的致病理论进行很好的解释。与单纯的细菌感染相比，病毒可造成更严重的牙周破坏，病毒与细菌之间的物理结合，可能为病毒到达龈下部位提供途径13。EBV 通常以无症状隐形感染状态在全球 90%以上的健康成人体中14，从潜伏期到重新激活是EBV 感染的关键，牙周上皮通常是 EBV 潜伏感染的主要部位，Vincent-Bugnas 等15发现牙周膜上皮细胞可感染 EBV，并提出牙周膜上皮细胞可能是潜在感染 EBV 的细胞的重要储存库，通过组织采样检测发现牙周膜上皮细胞可频繁发生 EBV 感染，感染 EBV 的牙周膜上皮细胞比未感染 EBV 的更容易凋亡，一旦病毒激活并增殖，释放病毒颗粒，引起牙周组织炎症反应，损伤机体细胞继而引起症状16。Slots17在综述中提出以下观察结果：EBV 的基因组大量出现在儿童，青少年和成人的不同类型的进行性牙周炎中；牙周部位 EBV 的含量随着疾病严重程度的增加而增加；牙周组织中的炎性细胞中含有 EBV 的核酸序列；EBV 阳性的牙周炎病变位点牙周致病菌的水平也相应增加。检测结果显示轻、中、重度 CP 位点与健康对照组位点 EBV 阳性检出率分别为 30.4%、43.5%、75%和 13.3%，其中重度 CP 位点 EBV 阳性检出率显著高于健康对照组位点及轻度 CP 位点，说明EBV 感染与重度 CP 密切相关，虽然轻度、中度 CP位点 EBV 阳性检出率与健康对照组位点未见显著差异，但是轻、中、重度 CP 位点 EBV DNA 拷贝数均显著高于健康对照组位点，轻度 CP 位点 EBV DNA拷贝数与中度 CP 位点未见显著差异，而重度 CP 位点 EBV DNA 拷贝数显著高于轻度及中度 CP 位点，这在一定程度上表明EBV感染与重度CP密切相关，可能与重度 CP 牙周组织破坏严重有关。另外，重度 CP 局部位点 EBV DNA 载量显著高于轻度、中度 CP 局部位点 EBV DNA 载量，我们推测 EBV 在轻、中度 CP 处于潜伏感染，而不是活动性感染阶段。本研究采用实时荧光定量 PCR 技术对 CP 病变位点中的 EBV 进行定量分析，探究 EBV 对 CP 发生发展的影响，选取 DNA 结合 SYBR Green 的方法，该方法操作便捷，价格便宜。牙周组织受到炎症刺激，龈沟液中含有炎性因子18及骨吸收相关因子19，可以更准确直观的反映牙周组织的炎症程度，可以排除主观因素的影响。本研究结果显示 IL-1和 SFRP1 浓度及总量在 CP 龈沟液中均高于牙周健康组，结果与池毓坦等9和 Kim 等5结果一致，提示 IL-1 和 SFRP1 与 CP 进展有关，可以作为检测CP 严重程度的生物学标志物。综上所述，EBV 感染在牙周炎进展中起到一定的致病作用，CP 病变位点中 EBV DNA 拷贝数较高可能加重该病局部组织炎症反应，进而促进牙槽骨吸收。EBV DNA 的定量检测可以评估 CP 相关位点 EBV 的激活状态，有助于指导牙周炎的预防和治疗。当检测到高含量的 EBV 时，该位点可能正处于炎症活动期，需要及时采取有效的治疗措施进行干预以避免牙周组织的快速破坏。了解 EBV 与CP 的关系具有一定的意义和价值，并能为 CP 的防治提供新的理论依据，但 EBV 对 CP 的致病机制还需进一步研究。参 考 文 献 1 孟焕新.牙周病学.北京:人民卫生出版社,2020.146-147.2 刘学伟,杨远超,纪慧,等.中医药治疗牙周病的研究进展.北京口腔医学,2019,27(2):118-120.表 4 CP 病变位点中 EBV 载量与 IL-1 和 SFRP1 之间的相关系数组别IL-1SFRP1浓度总量浓度总量健康对照组 0.179 0.157 0.475 0.229轻度 CP 组0.726*0.860*0.955*0.887*中度 CP 组0.756*0.708*0.617*0.642*重度 CP 组0.648*0.884*0.634*0.878*注：*：P 0.01 北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.134 3 Olivieri CV,Raybaud H,Tonoyan L,et al.Epstein-Barr virus-infected plasma cells in periodontitis lesions.Microb Pathog,2020,143:104128.4 Slots J,Contreras A.Herpesviruses:a unifying causative factor in periodontitis?Oral Microbiol Immunol,2000,15(5):277-280.5 Kim HJ,Kim EH,Park AK,et al.Detection of association between periodontitis and polymorphisms of IL-1+3954 and TNF-863 in the Korean population after controlling for confounding risk factors.J Periodontal Res,2020,55(6):905-917.6 任百洁,卢静一,王雷.白细胞介素1与白细胞介素1受体拮抗剂在慢性牙周炎中的作用.中国临床医生杂志,2019,47(6):654-657.7 Hoare A,Soto C,Rojas-Celis V,et al.Chronic inflammation as a link between periodontitis and carcinogenesis.Mediators Inflamm,2019,2019:1029857.8 Yang F,Huang D,Xu L,et al.Wnt antagonist secreted frizzled-related protein I(sFRP1)may be involved in the osteogenic differentiation of periodontal 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