一株白僵菌对红火蚁的毒力及...免疫酶活性与基因表达的影响_蔡霓.pdf

环境昆虫学报2022，44(6):1517 1527http:Journal of Environmental Entomologydoi:10.3969/j.issn.1674 0858.2022.06.22蔡霓，龙秀珍，刘蓉，吴雨欣，曾宪儒，农向群，王广君，涂雄兵，张泽华 一株白僵菌对红火蚁的毒力及对免疫酶活性与基因表达的影响 J 环境昆虫学报，2022，44(6):1517 1527一株白僵菌对红火蚁的毒力及对免疫酶活性与基因表达的影响蔡霓1*，龙秀珍2*，刘蓉1，吴雨欣3，曾宪儒2，农向群1，王广君1，涂雄兵1，张泽华1(1.中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193;2.广西农业科学院植物保护研究所，南宁 530007;3.长江大学农学院，湖北荆州 434000)摘要:白僵菌是最具防治害虫潜力的一类昆虫病原真菌。本研究测定了球孢白僵菌 Beauveria bassiana 237 菌株对红火蚁 Solenopsis invicta 的感染毒力，并探究了白僵菌侵染对红火蚁免疫相关酶活性及相关基因表达的影响。结果显示，该白僵菌菌株对红火蚁的毒力较强，在孢子悬浮液 108孢子/mL 浓度下，对红火蚁的致死中时间 LT50为5.288 0.2014 d;在 104108孢子/mL 的不同浓度处理下，红火蚁死亡率随孢子浓度的增加而显著增加。经计算，第 4 10 天致死中浓度 LC50值由 8.82 106孢子/mL 降低到 8.95 105孢子/mL。红火蚁被球孢白僵菌感染后，体内保护酶和解毒酶发生了不同程度的改变。其中保护酶类酚氧化酶(PO)的活性在白僵菌处理后的第12 h 已出现抑制，而在第 24 h、48 h、72 h 时均显著高于对照;超氧化物歧化酶(SOD)活性在 12 h 时与对照无显著差异，但在 24 48 h 阶段酶活显著上升，之后下降;过氧化物酶(POD)在较早时段保持与对照无显著差异水平，至中后期 48 72 h 出现持续升高。解毒酶类混合功能氧化酶系(MFO)的活性在整个检测时间段内表现为抑制 上升 抑制 上升的波动状态;谷胱甘肽 S-转移酶(GSTs)活性的变化与 SOD 相似，只在 24 48 h 阶段出现上升。白僵菌还导致红火蚁免疫信号通路 Toll 途径相关基因表达量变化。在处理后 12 h，识别因子 GNBP1、Spaetzle 即被激活，维持上调 回调波动趋势;而信号传递因子 Myd88、pelle 在检测的12 72 h 内基本处于被抑制状态，只有 Myd88 在 48 h 时表达量上升;转录因子 Dorsal 以及抗菌肽 Defensin 在 12 24 h 都已被显著激活，而在后续 48 72 h 被抑制。综上所述，球孢白僵菌 237 菌株通过调节红火蚁酶活以及免疫相关基因的表达量实现成功侵染和致病作用，具有很高的生防应用价值。关键词:球孢白僵菌;红火蚁;毒力;酶活;Toll 通路;免疫中图分类号:Q968.1;S433;S476文献标识码:A文章编号:1674 0858(2022)06 1517 11基金项目:国家重点研发计划项目(2021YFD1000500)*共同第一作者:蔡霓，女，博士，研究方向为农业害虫生物防治，E mail:;龙秀珍，硕士，副研究员，研究方向为农业害虫与害虫防治，E mail:通讯作者 Author for correspondence:农向群，女，博士，研究员，主要研究方向为昆虫病原真菌及其应用，E mail:xqnong 收稿日期 eceived:2022 09 15;接受日期 Accepted:2022 10 23Virulence and regulating immune-associated enzyme activity and geneexpression of a Beauveria bassiana strain against red fire antsCAI Ni1*，LONG Xiu-Zhen2*，LIU ong1，WU Yu-Xin3，ZENG Xian-u2，NONG Xiang-Qun1，WANG Guang-Jun1，TU Xiong-Bing1，ZHANG Ze-Hua1(1.State Key Laboratory for Biology of PlantDiseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China;2.Institute of Plant Protection，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，China;3.College of Agriculture，Yangtze University，Jingzhou 434000，HubeiProvince，China)环境昆虫学报 Journal of Environmental Entomology44 卷Abstract:Beauveria is one genus of the most promising entomopathogenic fungi for pest bio-control.Inthis study，the virulence of Beauveria bassiana 237 strain to red fire ant Solenopsis invicta wasdetermined，and the effects of the fungal strain on immune-related enzyme and gene expression level ofthe infected S.invicta was investigated.The results showed that B.bassiana 237 strain was highlyvirulent to red fire ants.At the fungal concentration of 108spores/mL，the lethal medium time(LT50)ofred fire ants was 5.288 0.2014 d.Under different concentrations of 104108spores/mL，the deathrate of red fire ants increased significantly with the increase of spore concentration.The lethal mediumconcentration(LC50)decreased from 8.82 106spores/mL to 8.95 105spores/mL during the 4thto10thday.After infected by B.bassiana，the protective enzymes and detoxification enzymes in red fireants were changed to different degrees.The activity of phenol oxidase(PO)，a protective enzyme，wasinhibited at the 12thh after treatment with B.bassiana，but was significantly higher than that of thecontrol at the 24th，48thand 72th The activity of superoxide dismutase(SOD)was not significantlydifferent from that of the control group at 12 h，but increased significantly at 24 48 h and thendecreased.The level of peroxidase(POD)was not significantly different from that of the control at theearly stage，but subsequently increase at 48 72 h in the middle and late stage.For two detoxificationenzymes tested，the activity of detoxification enzyme mixed functional oxidase system(MFO)fluctuatedin a state of inhibition-increase-inhibition-increase during the whole detection period.The change ofglutathione S-transferase(GSTs)activity was similar to SOD，and only increased at 24 48 h.Inaddition，B.bassiana also caused changes in the expression of immune-related genes of Toll signalingpathway in red fire ants.The genes of recognition factors GNBP1 and Spaetzle were activated at 12 h aftertreatment，maintaining an alternate up and down trend.The signal transfer factors，Myd88 and pelle，were overall suppressed during the 12 72 h detection，but only Myd88 increased expression at 48 h.The transcription factor Dorsal and the antimicrobial peptide Defensin have been significantly activated at12 24 h then inhibited at 48 72 h.In conclusion，B.bassiana 237 strain successfully infected andcaused disease to red fire ants by regulating the enzyme activity and the expression of immune-relatedgenes in red fire ant，which has a high value of biocontrol applicationKey words:Beauveria bassiana;Solenopsis invicta;virulence;enzyme activity;Toll pathway;immunity红火蚁 Solenopsis invicta Buren 是一种危险的外来入侵害虫，入侵我国后迅速适应环境并扩散繁殖。其蚁巢常驻在农田、林地、果园、草坪、荒地、路边等地，也常见于在人口密集的居民区及校园内等公共地带，还存在于地面电气箱体内、电线等一些基础设施中(罗礼智，2005;江世宏等，2005)，不仅对农、林业和生态环境造成重大损害，在遭受惊扰时还会攻击人畜，对居民和公园游客构成生命安全威胁(Vinson and Mackay，1990)。由于该蚁繁殖力强，在新入侵地缺乏有效的天敌抑制，其种群快速扩张，至今难以达到有效的可持续防治。昆虫病原真菌白僵菌属 Beauveria 被认为是红火蚁生物防治最有前途的病原性天敌(Lofgrenet al.，1975)。已知它们的寄主覆盖了绝大多数昆虫的目类及其科类，包含膜翅目 Hymenoptera 蚁科Formicidae，种类达 700 多种(Arthurs and Dara，2019)。1986 年报道了野外调查发现球孢白僵菌Beauveria bassiana 和 微 孢 子 菌 类 的 变 形 孢 菌Vairimorpha invictae 能够侵染红火蚁(Jouvenaz andEllis，1986)。1987 年报道了从巴西 Matto Grosso 和Sao Paul 地区采集的球孢白僵菌、布氏白僵菌 B.brongniartii 和金龟子绿僵菌 M.anisopliae 对 2 种红火蚁(S.invicta 和 S.saevissima)均有较高的致病性，接种后 4 10 d 发病率达到高峰(Perinottoet al.，2012)。1988 年报道了 3 个从 S.invicta 分离的球孢白僵菌菌株也同时能够高效感染上述2 种红火蚁(Alves et al.，1988)。我国大陆于2004 年底首次发现红火蚁传入(曾玲等，2005;农业部，2005)。2006 年报道了几种分离自白蚁的81516 期蔡霓等:一株白僵菌对红火蚁的毒力及对免疫酶活性与基因表达的影响白僵菌和绿僵菌对红火蚁具有较强的致病力，喷施 1 108孢子/mL 孢子悬浮液后，15 d 的累计死亡率均达到 86%以上(刘晓燕，2007)。用11 株球孢白僵菌菌株在 1 107孢子/mL 菌悬液处理红火蚁时，10 d 后导致 6.5%67.1%死亡率(吴志鹏和童应华，2020)。此外，使用球孢白僵菌 1 108孢子/mL 处理红火蚁时，在温度 21、25 和29条件下 15 d 均能导致 100%死亡率(刘晓燕等，2014)。这些实验结果显示了球孢白僵菌对红火蚁防治的突出能力。白僵菌对昆虫寄主的侵染和致病的过程一般要经历几个阶段，即分生孢子附着、萌发、穿透表皮，随后菌丝在血腔内生长，摄取营养，产生毒素，破坏寄主组织。此过程中昆虫寄主的防御系统会产生应答和抵抗作用，通过细胞反应和体液反应来抵抗外源物的入侵(杨晓峰等，2008)。昆虫天然免疫分为体液免疫(cellular immune)和细胞免疫(humoral immune)，两者共同识别并清除病原物(Lemaitre and Hoffmann，2007;osales，2017)。在细胞免疫过程中，昆虫血细胞激发酚氧化酶(PO)的级联反应，多酚氧化酶(PPO)活化后形成 PO，激活的 PO 将酪氨酸羟基化为多巴，多巴再被氧化为多巴色素、二羟吲哚，最后形成黑色素，这些黑色素协同具有细胞毒性的醌类中间产物沉积到入侵的病原体周围，起到隔离杀死病原体的作用(杨松等，2003)。除此之外，对于真菌入侵过程中释放的效应分子和毒素，寄主的一些保护酶如 POD、SOD、CAT 及解毒酶 GSTs、MFO、AchE 等也会参与免疫过程(李毅平和龚和，1998;Zhou et al.，2018)。体液免疫主要包括Toll、IMD、JAK/STAT 和 JNK 信号通路，也与凝集、黑化反应及活性氧产生密切相关(Lemaitreand Hoffmann，2007)。Toll 通路是一条在进化上保守的信号通路，该通路的模式识别蛋白 GNBP1 和PGP-SA/SD 与病原物结合后，激活胞外细胞因子SPZ(sptzle-like proteins)与细胞膜上的 Toll 受体结合，致使胞浆蛋白(MyD88、Tube、Pelle)及其他物质在胞内聚集(Lemaitre and Hoffmann，2007;Cao et al.，2015)。随后，抑制因子 Catcus发生磷酸化，再通过水解后与 NF-kB 转录因子Dif/Dorsal 分开，Dif/Dorsal 进入细胞核诱导防御素 Defensin 等抗菌肽及其他应答分子基因的表达(Lindsay and Wasserman，2014)，进而激活昆虫的免疫。白僵菌需要克服寄主免疫反应以达到成功侵染和致病。关于球孢白僵菌对红火蚁的致病机理目前未见报道。笔者所在实验室发现了 1 株分离自稻飞虱的球孢白僵菌具有感染红火蚁的毒力，因此，本研究在室内检测评价了该菌株对红火蚁的致病性，并测定了红火蚁被感染后体内保护酶、解毒酶活性和 Toll 通路相关基因的表达变化，为进一步探究球孢白僵菌对红火蚁的作用机理提供基础数据。1材料与方法1.1供试菌株及孢子培养球孢白僵菌 Beauveria bassiana 237 菌株由本实验室分离鉴定并保存。将供试菌株的孢子悬液涂布在铺有灭菌玻璃纸的 SDAY(1 L 培养基中含蔗糖 20 g，酵母粉5 g，土豆 200 g 削皮煮水，琼脂粉 20 g)平板上，25 1恒温培养 10 d，待其充分产孢后将玻璃纸上的孢子粉刮下，称取适量孢子粉，备用。1.2供试昆虫红火蚁工蚁采集自广西南宁市西乡塘区广西壮族自治区农科院科研试验基地，用火腿肠诱集法采集工蚁，并在室内饲养一段时间，待种群稳定后挑取大小基本一致的健康蚁用于试验。1.3杀虫活性测定采用浸渍法。用含 0.05%吐温-80 的无菌水将菌株孢子配制成孢子悬浮液，经血球计数板计数后调整至 1 108孢子/mL 浓度。选取大小基本一致的红火蚁工蚁浸入配制好的悬浮液中，5 s 后取出，放入垫有湿润滤纸的塑料杯中，杯口周围涂有一层特氟龙防止红火蚁逃逸。每杯接入试虫约50 头，重复3 次。同时以0.05%吐温-80 的无菌水处理作为对照。杯内放置塞有棉花的灭菌“水试管”和 10%蔗糖水的 5 mL 试管各 1 支，于室温27 30 饲养，每天观察记录死亡的试虫数量，连续观察 10 d。根据处理时间和累计死亡率建立线性回归方程，并计算致死中时间 LT50。测定致死中浓度时，将 1.0 108孢子/mL孢子悬浮液按 1 9 依次稀释成 107、106、105、104孢子/mL，获得 5 个递减的浓度梯度。接种处9151环境昆虫学报 Journal of Environmental Entomology44 卷理和观察方法同上述。应用时间 剂量 死亡率模型进行模拟分析(冯明光，1998)，再用拟合的剂量效应和时间效应参数估计随时间变化的致死中浓度 LC50。1.4红火蚁体内保护酶与解毒酶活性测定1.4.1样品处理按照与 1.3 相同方法的处理红火蚁，所用孢子悬浮液为 1.0 107孢子/mL，以无菌 0.05%吐温-80 的水溶液为空白对照，采用浸渍法接种。浸渍处理后，每杯接入试虫大于 200 头，重复16 杯，分成 4 组，每组 4 杯重复。分别于 12、24、48、72 h 取样，每个重复取样 50 头。将取样管放入液氮罐冷冻，再转放至 80冰箱中保存待用。1.4.2酶活测定每处理取 150 头红火蚁，于液氮中研磨均匀，分装成 6 份小样，每份 0.1 g，用于酶活检测及总NA 的提取。保护酶活性测定:超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)试剂盒购自北京索莱宝生物工程公司，酚氧化酶(PO)试剂盒购自苏州格锐思生物科技有限公司，操作步骤按说明书的方法进行。每个样本重复测定 5 次。解毒酶活性测定:多功能氧化酶(MFO)试剂盒购自苏州格锐思生物科技有限公司，谷胱甘肽 S-转移酶(GSTs)试剂盒购自北京索莱宝生物工程公司，操作步骤按说明书的方法进行。每个样本重复测定 5 次。使用 VersaMax(美谷分子仪器(上海)有限公司)酶标仪读取待测样品的吸光值，根据说明书上的计算方法计算各个酶活。1.5红火蚁免疫信号通路相关基因表达量检测1.5.1NA 提取及反转录取上述1.4.1 研磨好的红火蚁组织样品0.1 g，利用 TIzol分 离 试 剂 盒(Invitrogen)提 取 总NA。用 5 All-In-One T Master Mix 反转录试剂盒(Applied Biological Materials Inc.，Canada)进行 NA 反转录，得到 cDNA。并用 NanoPhotometer微量分光光度计(IMPLEN，德国)检测浓度。1.5.2实时荧光定量 PC(qT-PC)拟检测红火蚁 Toll 通路相关基因的表达量，包括上游 GNBP1 与 Spaetzle 基因、信号传递的Myd88 与 pelle，下游的转录因子 Dorsal 以及抗菌肽Defensin 基因。基因 ef1-beta(translation elongationfactor 1)作为内参基因(Cheng et al.，2013)，各基因引物序列见表 1。表 1免疫基因及其特异性引物Table 1Immune related genes and specific primers基因名称Gene name引物序列Primer sequence基因名称Gene name引物序列Primer sequenceef1-beta5-TGAAGACCGATAAGGGCAPelle5-GCTGGTGCTTGGATGAAATA5-TCGTCCGAACCAAAGAGA5-CTGCTTGCGTGATAAGTTCTGGNBP15-GTGAACGCTACAGATGTTTCGDorsal5-TACGGTTTCGCTATGAATGC5-CGCCGAGAGTGATAAAGAACT5-AAGATTGTGCGGATGAGGTCSpaetzle5-TTTCAAGCACAGGCTCACCDefensin5-CAGGCAAATGAAGACGGA5-ATCAACGCTCTCCAGGAACC5-TGAGGATACAGTGAGCAGCGMyd885-TCAAGTGTCAGCAGAGCCA5-TTCATTACCGCTTCGTGCqT-PC 使用美国 EVE-BIGHTINC.的2 SYB Green qPC Master Mix 进行，并使用 ABIQuantStudio 5 系统根据制造商说明进行检测。反应体系为 2 SYB Green Master Mix 10 L，正反向引物 各 1 L，cDNA 0.8 L，补 足 ddH2O 至20 L。PC 扩增程序为 95 预变性 2 min;95变性 5 s，60复性 30 s，40 个循环。每样品 3 次技术重复，基因相对表达量采用 2 Ct的方法进行分析。所有结果以平均数 标准误(SE)表示，采用 Duncans multiple-range test 检验(SPSS 26.0)的单因素方差分析认为 P 0.05 差异显著。02516 期蔡霓等:一株白僵菌对红火蚁的毒力及对免疫酶活性与基因表达的影响2结果与分析2.1球孢白僵菌对红火蚁的毒力球孢白僵菌 237 菌株对红火蚁的生物测定显示，该菌株对红火蚁有较高的毒力。处理后第 3天开始出现死亡，死亡率为 10%，从第 3 天到第10 天，每天的累计死亡率都显著高于对照(P 0.05)。处理后第 7 天死亡率达到 83.3%，第10 天的死亡率为 87%(图 1)。死亡率 时间的回归方程为 y=11.624x 11.333，致死中时间 LT50为 5.288 0.2014 d，表明该菌株对红火蚁能够有较好的防治效果。图 1球孢白僵菌 237 菌株处理下红火蚁的死亡率Fig.1Mortality of Solenopsis invicta treated byBeauveria bassiana 237 strain在球孢白僵菌不同浓度处理下，红火蚁第3 天各个处理组开始出现死亡。随着浓度的升高，死亡速度逐渐加快。其中 1.0 108孢子/mL 处理下，第 4 天 红 火 蚁 的 死 亡 率 已 大 于 50%(为65.66%)，1.0 107孢子/mL 处理组到第 5 天死亡率也达到 54.35%，其余较低浓度处理组到第10 天时死亡率均未超过 50%(图 2)。对各个浓度处理下累计死亡率进行差异显著性分析后发现，不同浓度的白僵菌对红火蚁的致死率在第 4 天开始出现显著性分化，1.0 108孢子/mL 处理组死亡率显著高于其他浓度(表 2)。从致死中浓度 LC50来看，随着处理时间的增长，LC50值下降，接菌后4 7 d，LC50值由8.82 106孢子/mL 降低到 1.41 106孢子/mL，第 7 10 天的 LC50值继续下降，第10 天的 LC50仅为 4 d 时的 10.1%(表 3)。说明白僵菌237 菌株对红火蚁的杀虫毒力存在浓度正相关性。图 2球孢白僵菌 237 菌株不同浓度处理下红火蚁的死亡率Fig.2Cumulative mortality of Solenopsis invicta under differentconcentrations of Beauveria bassiana 237 strain condidia表 2各浓度累计死亡率差异显著性分析Table 2Analysis of the significance of differences in cumulative mortality among different concentrations处理(孢子/mL)Treatment处理时间(d)Treatment time123456789101.0 108aaaaaaaaaa1.0 107bbbbbbbbbb1.0 106bbcbbbccbccc1.0 105bbcccccccdc1.0 104bcbcddddddede对照 Controlcbcdddddee注:同列数据不同小写字母表示差异显著(P 0.05)。Note:Data in the same column followed by different lowercase lettersrepresented significant difference at 0.05 level1251环境昆虫学报 Journal of Environmental Entomology44 卷表 3球孢白僵 237 菌株对红火蚁的致死中浓度Table 3Lethal medium concentration of the strain to Solenopsis invicta 237 strain处理天数(d)Treatment time毒力回归方程Virulence regression equation相关系数(2)Correlation coefficientLC50(孢子/mL)LC50(spore/mL)4y=13.072x 40.7880.99488.82 1065y=16.195x 53.4170.97892.43 1066y=17.562x 59.2470.98071.66 1067y=18.179x 61.7990.97121.41 1068y=18.859x 64.990.96621.25 1069y=19.681x 68.4710.96331.05 10610y=20.311x 70.8880.95848.95 1052.2球孢白僵菌对红火蚁 Toll 通路免疫基因表达量的影响荧光定量 PC 检测结果显示，球孢白僵菌处理红火蚁后，引起了 Toll 途径免疫相关基因的表达变化。其中，Toll 途径上游 GNBP1 与 Spaetzle 基因的表达情况类似，均在 12 h 和 48 h 表达量显著高于对照，而在 24 h 和 72 h 基因表达量则受到抑制(P 0.01)，其中 12 h 基因的表达量最高，分别为 48 h 时基因表达量的 9.35 倍和 3.36 倍。Toll途径中游的 Myd88 在处理后的第 48 h 表达量显著高于对照(P 0.01)，Pelle 在处理后 12 h 时与对照无显著差异(P=0.32)，其他时间均被显著抑制(P 0.01)。Toll 途径下游的 Dorsal 和 Defensin在白僵菌处理后的第 12 h 和 24 h 被显著的激活，但在 48 h 和 72 h 受到抑制(P 0.01)(图 3)。2.3球孢白僵菌对红火蚁酶活免疫的影响2.3.1对红火蚁保护酶活性的影响在球孢白僵菌处理后，与对照相比，红火蚁体内酚氧化酶(PO)在 12 h 时活性被显著抑制，而在第 24 h、48 h、72 h 则显著升高(P 0.01)。过氧化物酶(POD)在处理初期的 12 h、24 h 时与对照无显著差异，在第 48 h、72 h 显著高于对照(P 0.01);超氧化物歧化酶(SOD)的活性主要在 24 h、48 h 显示较高水平，在处理 12 h 和72 h 比无显著差异(P 0.01)(图 4)。2.3.2对红火蚁解毒酶活性的影响在球孢白僵菌处理后，红火蚁体内的多功能氧化酶(MFO)活性呈现波动，在处理初期第12 h，MFO 的活性被显著的抑制(P 0.05)，24 h 时，MFO 的活性又显著高于对照，在处理后第 48 h，MFO 酶活性无显著差异，但在处理后的第 72 h，MFO 酶活性显著高于对照(P 0.01)。谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)活性在 24 h、48 h 与对照相比显著积累上升，在处理初期 12 h 及后期的 72 h 比对照相比无显著差异(图 5)。3结论与讨论虽然球孢白僵菌有广泛的昆虫寄主，并有一些菌株已经被研发成为生物杀虫剂，用于多种农林及卫生害虫的防治，但对于防控入侵害虫红火蚁还处于较初步的阶段，从菌株的生物测定看，一些高毒力菌株显然具有良好的防控应用潜力。我国发现红火蚁进入以后，研究人员就迅速开始探索利用白僵菌、绿僵菌进行生物防治，报道了一些室内筛选的对红火蚁高毒力菌株(杨佳后等，2009;吕利华等，2011;Li et al.，2016)。目前大部分研究都是在实验室进行菌株毒力测定，只有少数评估了作为红火蚁诱捕防控制剂的田间应用潜力，尚未见有商业菌剂或大面积的防治应用。筛选优良菌株和分析菌株对红火蚁作用机理是促进球孢白僵菌防治红火蚁应用的必要基础。本研究评价的球孢白僵菌 237 菌株对红火蚁具有高毒力，在 1.0 108孢子/mL 浓度下对红火蚁的致死中时间为5.288 0.2014 d，第10 天的累计死亡率可达 87%以上，处理后第 4 10 天，致死中浓度由 8.82 106孢子/mL 下降为 8.95 105孢子/mL。这表明球孢白僵菌237 对红火蚁毒力较高，是红火蚁生物杀虫剂研发的潜力资源。22516 期蔡霓等:一株白僵菌对红火蚁的毒力及对免疫酶活性与基因表达的影响图 3T-qPC 检测球孢白僵菌处理红火蚁的免疫相关基因表达量Fig.3T-qPC detection of expression levels of immune-related genes in red fire ants treated by Beauveria bassiana注:表示与对照差异极其显著，P 0.01;*表示与对照差异显著，P 0.05。下图同。Note:meant a extremelysignificant difference to the control at P 0.01 and*meant a significant difference at P 0.05 Same belowToll 信号通路是昆虫调节免疫和发育的主要途径之一，通过识别信号因子，激活 NF-kB 转录因子，介导细胞自噬以及免疫基因的表达。在免疫过程中主要通过识别受体(GNBPs、PGP)和Spaetzle 的活化，膜质信号(Myd88、pelle、tube)的传导，转录因子(Dorsal/Dif)的激活以及抗菌肽(Defensin)的释放等过程启动免疫(Zambonet al.，2005;Valanne et al.，2011)。本研究发现，红火蚁感染球孢白僵菌后，GNBP1 与 Spaetzle 的转录水平在 12 72 h 期间呈现相似的激活 抑制 激活 抑制波动趋势;在信号向下传递过程中，Myd88 和 pelle 的表达水平总体上受到抑制，仅Myd88 在 48 h 表达量显著高于对照;转录因子Dorsal 和抗菌肽 Defensin 表达模式为在 12 24 h 被显著激活，而 48 72 h 受到抑制。说明在信号转导过程中，负责前期信号识别的受体已经被激活，并且在与白僵菌对抗中出现消长波动。类似研究结果也有报道，巴氏新小绥螨 Neoseiulus barkeri 在遭到球孢白僵菌感染后，PGP、Spaetzle 在早期2 h 就被激活，在 4 72 h 被抑制，之后 96 h 表达3251环境昆虫学报 Journal of Environmental Entomology44 卷图 4红火蚁保护酶活性比较Fig.4Comparison of protective enzyme activities of Solenopsis invicta图 5红火蚁解毒酶活性比较Fig.5Comparison of detoxification enzyme activities of Solenopsis invicta量又显著上升(况再银，2020)。此外，本实验中，中间信号因子(Myd88 和 pelle)受到抑制，但并未能阻断下游抗菌肽(defensin)的产生，推测红火蚁在对抗白僵菌的入侵时，除了激活 Toll途径，还存在其他免疫调节通路共同作用。反之也说明球孢白僵菌能够成功侵染红火蚁依赖于多途径协同作用，这种入侵致病作用与红火蚁的免疫对抗机制还需要更多的研究探讨。另一方面，昆虫体内存在保护酶系、解毒酶系，可清除或溶解体内的有毒物质，包括由病原体产生的毒蛋白或毒性小分子，以达到自我保护的目的。保护酶主要包括羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、酚氧化酶(PO)、超氧化物歧 化 酶(SOD)、过 氧 化 氢 酶(CAT)等(Dubovskiy et al.，2008;Zou et al.，2017)。酚氧化酶 PO 是参与黑化反应的关键酶，在德国小蠊42516 期蔡霓等:一株白僵菌对红火蚁的毒力及对免疫酶活性与基因表达的影响Blattella germanica 对大肠杆菌 Escherichia coli 的感染试验中，其活性在 12 h 之前与对照无显著差异，但 24 h、36 h 酶活显著上升(张道伟等，2014)。本研究中，红火蚁感染白僵菌后，PO 活性出现类似反应，在第 12 h 受到抑制，而第 24 h、48 h、72 h 酶活均显著高于对照，推测在初期 12 h 内，白僵菌处于孢子萌发早期，对红火蚁还未造成威胁，因此红火蚁 PO 尚无响应或受到抑制，表现为酶活水平较低;但随着白僵菌的萌发侵入，虫体启动了免疫系统，产生保护酶反应，PO 酶活上升，黑化反应增强。此外，PO 酶活的触发也与免疫受体的识别有关。病原体中所含有的病原相关分子模式被细胞表面的免疫识别受体识别后，会引起颗粒细胞释放酚氧化酶原(proPO)激活系统的成分。通过丝氨酸蛋白酶级联反应，酚氧化酶原活化酶原被切割和修饰，从而使 proPO 活化成酚氧化酶 PO 来发挥相应的免疫功能(Sderhll andCerenius，1998)。在本研究中，免疫识 别 受 体GNBP1 和 Spaetzle 在 12 h 即被显著的激活(图3)，PO 酶活则在24 h 后显著高于对照(图 4)，且维持较高水平，推测基因转录后到蛋白功能及酶活响应需要一段过程时间，它们协同影响了虫体免疫反应。在绿僵菌和氯虫苯甲酰胺协同作用东亚飞蝗 Locusta migratoria manilensis 的 研 究 中 发 现，GNBP1、Toll、dMyD88、Pelle、PPO1 和 PPO2 等基因之