分子生物学课程教学讲义-朱玉贤教程文件.doc

学习-好资料分子生物学课程教学讲义 朱玉贤第一讲 序论二、现代分子生物学中的主要里程碑分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。当人们意识到同一生物不同世代之间的连续性是由生物体自身所携带的遗传物质所决定的，科学家为揭示这些遗传密码所进行的努力就成为人类征服自然的一部分，而以生物大分子为研究对像的分子生物学就迅速成为现代社会中最具活力的科学。从1847年Schleiden和Schwann提出细胞学说，证明动、植物都是由细胞组成的到今天，虽然不过短短一百多年时间，我们对生物大分子-细胞的化学组成却有了深刻的认识。孟德尔的遗传学规律最先使人们对性状遗传产生了理性认识，而Morgan的基因学说则进一步将性状与基因相耦联，成为分子遗传学的奠基石。Watson和Crick所提出的脱氧核糖酸双螺旋模型，为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。在蛋白质化学方面，继Sumner在1936年证实酶是蛋白质之后，Sanger利用纸电泳及层析技术于1953年首次阐明胰岛素的一级结构，开创了蛋白质序列分析的先河。而Kendrew和Perutz利用X射线衍射技术解析了肌红蛋白（myoglobin）及血红蛋白（hemoglobin）的三维结构，论证了这些蛋白质在输送分子氧过程中的特殊作用，成为研究生物大分子空间立体构型的先驱。1910年，德国科学家Kossel第一个分离了腺嘌呤，胸腺嘧啶和组氨酸。1959年，美国科学家Uchoa第一次合成了核糖核酸，实现了将基因内的遗传信息通过RNA翻译成蛋白质的过程。同年，Kornberg实现了试管内细菌细胞中DNA的复制。1962年，Watson（美）和Crick（英）因为在1953年提出DNA的反向平行双螺旋模型而与Wilkins共获Noble生理医学奖，后者通过X射线衍射证实了Watson-Crick模型。1965年，法国科学家Jacob和Monod提出并证实了操纵子（operon）作为调节细菌细胞代谢的分子机制。此外，他们还首次推测存在一种与DNA序列相互补、能将它所编码的遗传信息带到蛋白质合成场所（细胞质）并翻译产生蛋白质的mRNA（信使核糖核酸）。 1972年，Paul Berg（美）第一次进行了DNA重组。 1977年，Sanger和Gilbert（英）第一次进行了DNA序列分析。1988年，McClintock由于在50年代提出并发现了可移动遗传因子（jumping gene或称mobile element）而获得Nobel奖。 1993年，美国科学家Roberts和Sharp因发现断裂基因（introns）而获得Nobel奖。Mullis由于发明PCR仪而与加拿大学者Smith（第一个设计基因定点突变）共享Nobel化学奖。 此外，Griffith（1928）及Avery（1944）等人关于致病力强的光滑型（S型）肺炎链球菌DNA导致致病力弱的粗糙型（R型）细菌发生遗传转化的实验；Hershey和Chase（1952）关于DNA是遗传物质的实验；Crick于1954年所提出的遗传信息传递规律（即中心法则）:Meselson和Stahl（1958）关于DNA半保留复制的实验以及Yanofsky和Brener（1961）年关于遗传密码三联子的设想都为分子生物学的发展做出了重大贡献。我国生物科学家吴宪20世纪20年代初回国后在协和医科大学生化系与汪猷、张昌颖等人一道完成了蛋白质变性理论、血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究，成为我国生物化学界的先驱。20世纪60年代、70年代和80年代，我国科学家相继实现了人工全合成有生物学活性的结晶牛胰岛素，解出了三方二锌猪胰岛素的晶体结构，采用有机合成与酶促相结合的方法完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工全合成，在酶学研究、蛋白质结构及生物膜结构与功能等方面都有世所瞩目的建树。 三、分子生物学的主要研究内容所有生物体中的有机大分子都是以碳原子为核心，并以共价键的形式与氢、氧、氮及磷以不同方式构成的。不仅如此，一切生物体中的各类有机大分子都是由完全相同的单体，如蛋白质分子中的20种氨基酸、DNA及RNA中的8种碱基所组合而成的，由此产生了分子生物学的3条基本原理：1 构成生物体有机大分子的单体在不同生物中都是相同的；2 生物体内一切有机大分子的建成都遵循着各自特定的规则；3 某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定了它的属性。分子生物学研究内容:DNA重组技术-基因工程基因表达调控-核酸生物学 生物大分子结构功能-结构分子生物学DNA重组技术（又称基因工程）这是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同DNA片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。严格地说，DNA重组技术并不完全等于基因工程，因为后者还包括其他可能使生物细胞基因组结构得到改造的体系。DNA重组技术是核酸化学、蛋白质化学、酶工程及微生物学、遗传学、细胞学长期深入研究的结晶，而限制性内切酶DNA连接酶及其他工具酶的发现与应用则是这一技术得以建立的关键。DNA重组技术有着广阔的应用前景:DNA重组技术可用于定向改造某些生物基因组结构，使它们所具备的特殊经济价值或功能得以成百 上千倍的地提高。DNA重组技术还被用来进行基础研究。如果说，分子生物学研究的核心是遗传信息的传递和控制，那么根据中心法则，我们要研究的就是从DNA到RNA，再到蛋白质的全过程，也即基因的表达与调控。在这里，无论是对启动子的研究（包括调控元件或称顺式作用元件），还是对转录因子的克隆及分析，都离不开重组DNA技术的应用。基因表达调控研究 因为蛋白质分子参与并控制了细胞的一切代谢活动，而决定蛋白质结构和合成时序的信息都由核酸（主要是脱氧核糖核酸）分子编码，表现为特定的核苷酸序列，所以基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译。在个体生长发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）。原核生物的基因组和染色体结构都比真核生物简单，转录和翻译在同一时间和空间内发生，基因表达的调控主要发生在转录水平。真核生物有细胞核结构，转录和翻译过程在时间和空间上都被分隔开，且在转录和翻译后都有复杂的信息加工过程，其基因表达的调控可以发生在各种不同的水平上。基因表达调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑3个方面。转录因子是一群能与基因5端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。 真核基因在结构上的不连续性是近10年来生物学上的重大发现之一。当基因转录成pre-mRNA后，除了在5端加帽及3端加多聚ApolyA之外，还要将隔开各个相邻编码区的内含子剪去，使外显子（编码区）相连后成为成熟mRNA。研究发现，有许多基因不是将它们的内含子全部剪去，而是在不同的细胞或不同的发育阶段有选择地剪接其中部分内含子，因此生成不同的mRNA及蛋白质分子。 结构分子生物学 生物大分子的结构功能研究（又称结构分子生物学） 一个生物大分子，无论是核酸、蛋白质或多糖，在发挥生物学功能时，必须具备两个前提:首先，它拥有特定的空间结构（三维结构）；其次，在它发挥生物学功能的过程中必定存在着结构和构象的变化。结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。它包括结构的测定、结构运动变化规律的探索及结构与功能相互关系的建立3个主要研究方向。最常见的研究三维结构及其运动规律的手段是X射线衍射的晶体学（又称蛋白质晶体学），其次是用二维核磁共振和多维核磁研究液相结构，也有人用电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法研究生物高分子的空间结构。 第二讲 染色体与DNA一、 DNA的组成与结构 Avery在1944年的研究报告中写道：当溶液中酒精的体积达到9/10时，有纤维状物质析出。如稍加搅拌，它就会象棉线在线轴上一样绕在硬棒上，溶液中的其它成份则呈颗粒状沉淀。溶解纤维状物质并重复数次，可提高其纯度。这一物质具有很强的生物学活性，初步实验证实，它很可能就是DNA（谁能想到！）。对DNA分子的物理化学研究导致了现代生物学翻天覆地的革命，这更是Avery所没有想到。所谓DNA的一级结构，就是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。核苷酸序列对DNA高级结构的形成有很大影响，如B-DNA中多聚（G-C）区易出现左手螺旋DNA（Z-DNA），而反向重复的DNA片段易出现发卡式结构等。DNA不仅具有严格的化学组成，还具有特殊的高级结构，它主要以有规则的双螺旋形式存在，其基本特点是： 1、DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。2、DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧。3、两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。这就是嘌呤与嘧啶配对，而且腺嘌呤（A）只能与胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）只能与胞嘧啶（C）配对。如一条链上某一碱基是C，另一条链上与它配对的碱基必定是G。碱基之间的这种一一对应的关系叫碱基互补配对原则。组成DNA分子的碱基虽然只有4种，它们的配对方式也只有A与T，C与G两种，但是，由于碱基可以任何顺序排列，构成了DNA分子的多样性。例如，某DNA分子的一条多核苷酸链有100个不同的碱基组成，它们的可能排列方式就是4100。 二、 DNA聚合酶与DNA的合成The accuracy of translation relies on the specificity of base pairing. The actual rate in bacteria seems to be -10-8-10-10. This corresponds to -1 error per genome per 1000 bacterial replication cycles, or -10-6 per gene per generation.DNA polymerase might improve the specificity of complementary base selection at either (or both) of two stages:1，It could scrutinize the incoming base for the proper complementarity with the template base; for example, by specifically recongnizing matching chemical features. This would be a presynthetic error control. 2，Or it could scrutinize the base pair after the new base has been added to the chain, and, in those cases in which a mistake has been made, remove the most recently added base. This would be a proofreading control. 三、DNA的生理意义及成分分析早在1928年英国科学家Griffith等人就发现肺炎链球菌使小鼠残废的原因是引起肺炎。细菌的毒性（致病力）是由细胞表面荚膜中的多糖所决定的。具有光滑外表的S型肺炎链球菌因为带有荚膜多糖而都能使小鼠发病，而具有粗糙外表的R型因为没有荚膜多糖而失去致病力（荚膜多糖能保护细菌免受运动白细胞攻击）。首先用实验证明基因就是DNA分子的是美国著名的微生物学家Avery。Avery等人将光滑型致病菌（S型）烧煮杀灭活性以后再侵染小鼠，发现这些死细菌自然丧失了致病能力。再用活的粗糙型细菌（R型）来侵染小鼠，也不能使之发病，因为粗糙型细菌天然无致病力。当他们将经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死了。解剖死鼠，发现有大量活的S型（而不是R型）细菌。他们推测，死细菌中的某一成分棗转化源（transforming principle）将无致病力的细菌转化成病原细菌。美国冷泉港卡内基遗传学实验室科学家Hershey和他的学生Chase在1952年从事噬菌体侵染细菌的实验。噬菌体专门寄生在细菌体内。它的头、尾外部都有由蛋白质组成的外壳，头内主要是DNA。噬菌体侵染细菌的过程可以分为以下5个步骤：噬菌体用尾部的末端（基片、尾丝）吸附在细菌表面；噬菌体通过尾轴把DNA全部注入细菌细胞内，噬菌体的蛋白质外壳则留在细胞外面；噬菌体的DNA一旦进入细菌体内，它就能利用细菌的生命过程合成噬菌体自身的DNA和蛋白质；新合成的DNA和蛋白质外壳，能组装成许许多多与亲代完全相同的子噬菌体；子代噬菌体由于细菌的解体而被释放出来，再去侵染其他细菌。他们发现被感染的细菌中带有70%的噬菌体DNA，但只带有20%的噬菌体蛋白质。子代噬菌体中带有50%标记的DNA，却只有1%的标记蛋白质。四. C-value和Cot1/2The total amount of DNA in the haploid genome is a characteristic of each living species known as C-value.Cot1/2 is the product of concentration and time required for 50% reassociation given in nucleotide-moles second/liter.五、 染色体结构DNA molecules are the largest macromolecules in the cell and are commonly packaged into structures called “chromosomes”, most bacteria & viruses have a single chromosome where as Eukaryotic cells usually contain many. 任何一条染色体上都带有许多基因，一条高等生物的染色体上可能带有成千上万个基因，一个细胞中的全部基因序列及其间隔序列统称为genomes（基因组）。 如果设想将人体细胞中的DNA分子绕地球一周，那么，每个碱基大约只占15厘米，而一个23kb的基因只相当于地球上一条数十米长，数厘米宽的线段！Genotype (基因型)： The genetic constitution of a given organism (指某个特定生物体细胞内的全部遗传物质)。Phenotype (表现型)： Visible property of any given organism (某个特定生物体中可观察到的物理或生理现象)。Mutations： 染色体DNA中可遗传的核苷酸序列变化。六、 染色体的组成 1染色质和核小体 染色质DNA的Tm值比自由DNA高，说明在染色质中DNA极可能与蛋白质分子相互作用；在染色质状态下，由DNA聚合酶和RNA聚合酶催化的DNA复制和转录活性大大低于在自由DNA中的反应；DNA酶I（DNaseI）对染色质DNA的消化远远慢于对纯DNA的作用。染色质的电子显微镜图显示出由核小体组成的念珠状结构，可以看到由一条细丝连接着的一连串直径为10nm的球状体。核小体是由H2A、H2B、H3、H4各两个分子生成的八聚体和由大约200bpDNA组成的。八聚体在中间，DNA分子盘绕在外，而H1则在核小体的外面。每个核小体只有一个H1。在核小体中DNA盘绕组蛋白八聚体核心，从而使分子收缩成1/7，200bpDNA的长度约为68nm，却被压缩在10nm的核小体中。但是，人中期染色体中含3.3109碱基对，其理论长度应是180cm，这么长的DNA被包含在46个51m长的圆柱体（染色体）中，其压缩比约为104。2染色体中的核酸组成不重复序列 在单倍体基因组里，这些序列一般只有一个或几个拷贝，它占DNA总量的40%80%。不重复序列长约7502000dp，相当于一个结构基因的长度。单拷贝基因通过基因扩增仍可合成大量的蛋白质，如一个蚕丝心蛋白基因可作为模板合成104个丝心蛋白mRNA，每个mRNA可存活4d，共合成105个丝心蛋白，这样，在几天之内，一个单拷贝丝心蛋白基因就可以合成109个丝心蛋白分子 。中度重复序列 这类重复序列的重复次数在10104之间，占总DNA的10%40%。各种rRNA、tRNA 及组蛋白基因等都属这一类。非洲爪蟾的18S、5.8S及28SrRNA基因是连在一起的，中间隔着不转录的间隔区，这些单位在DNA链上串联重复约5000次。在卵细胞形成过程中这些基因可进行几千次不同比例的复制，产生2106个拷贝，使rDNA占卵细胞DNA的75%，从而使该细胞能积累1012个核糖体。高度重复序列卫星DNA 这类DNA只在真核生物中发现，占基因组的10%60%，由6100个碱基组成，在DNA链上串联重复几百万次。由于碱基的组成不同，在CsCl密度梯度离心中易与其他DNA分开，形成含量较大的主峰及高度重复序列小峰，后者又称卫星区带（峰）。高等真核生物DNA无论从结构还是功能看都极为复杂，以小鼠为例：1.小鼠总DNA的10是小于10bp的高度重复序列，重复数十万到上百万次/genome。 2.总DNA的20是重复数千次、长约数百bp的中等重复序列。 3.总DNA的70是不重复或低重复序列,绝大部分功能基因都位于这类序列中。Centromere：是细胞有丝分裂期间纺锤体蛋白质与染色体的结合位点（attachment point），这种结合对于染色体对在子细胞中的有序和平均分配至关重要。在酵母中，centromere的功能单位长约130 bp，富含AT 碱基对。在高等真核细胞中，centromere都是由长约510 bp、方向相同的高度重复序列所组成。Telomeres are sequences at the ends of eukaryotic Chromosomes that help stabilize them。 酵母Telomeres一般以100 bp左右不精确重复序列所组成。5(TxGy)n3(AxCy)n其中X、Y一般为14，单细胞真核生物中n常为20100，高等真核生物中>1500。染色体末端的线性重复序列不能被DNA polymarase 所准确复制，它们一般在DNA复制完成以后由telomarase合成后加到染色体末端。Alu（长约300bp）是人类高度重复序列,因为该序列中带有AluI的识别序列而得名。数十万个Alu重复序列散布于整个人类、进化上的极端保守性。牛、猪、大鼠的H4氨基酸序列完全相同。牛的H4序列与豌豆序列相比只有两个氨基酸的差异（豌豆H4中的异亮氨基酸60缬氨酸60，精氨酸赖氨酸）。H3的保守性也很大，鲤鱼与小牛胸腺的H3只差一个氨基酸，小牛胸腺与豌豆H3只差4个氨基酸。 2、无组织特异性。到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色体不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白。 3、肽链上氨基酸分布的不对称性。碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。例如，N端的半条链上净电荷为+16，C端只有+3，大部分疏水基团都分布在C端。 组蛋白的修饰作用。包括甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。 非组蛋白的一般特性染色体上除了存在大约与DNA等量的组蛋白以外，还存在大量的非组蛋白。非组蛋白的多样性。非组蛋白的量大约是组蛋白的60%70%，但它的种类却很多，约在20-100种之间，其中常见的有15-20种。 非组蛋白的组织专一性和种属专一性。 (3)几类常见的非组蛋白a.HMG蛋白（high mobility group protein）。这是一类能用低盐（0.35mol/L NaCl）溶液抽提、能溶于2%的三氯乙酸、相对分子质量较低的非组蛋白，相对分子质量都在3.0104以下。b. DNA结合蛋白。用2mol/L NaCl除去全部组蛋白和70%非组蛋白后，还有一部分蛋白必须用2mol/L NaCl和5mol/L尿素才能与DNA解离。这些蛋白分子量较低，约占非组蛋白的20%，染色质的8%。七. 原核与真核染色体DNA比较原核生物中一般只有一条染色体且大都带有单拷贝基因，只有很少数基因如rRNA基因是以多拷贝形式存在； 整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列所组成； 几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。 Viral DNA molecules are relatively smallHIV = 9000 nt RNAQ = 4200 ntBactaria DNA is 100 times > than viralE. coli 4639221 bp double-strandedContour length = 1.7mm, 850倍细菌本身长度。细菌中常常带有质粒DNA。Eucaryotic cells果蝇带有25倍于E. Coli 的DNA,人类带有600倍于E. Coli 的DNA. Eucaryotic DNA 中基因密度明显低于原核和病毒。如人DNA中平均每毫米只带有50个基因,而E. Coli中基因密度每毫米DNA带有2400个基因！一个人细胞中所带有的DNA约有2m/1.7mm细菌。成人带有1X1014个细胞，成人体内全部DNA的总长度（Contour Length） 2X1011Km 第三讲 蛋白质合成一.基因与基因表达的一般概念基因作为唯一能够自主复制、永久存在的单位，其生理学功能以蛋白质形式得到表达。DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成mRNA，翻译生成蛋白质的过程控制所有生命现象。编码链（coding strand）又称sense strand，是指与mRNA序列相同的那条链。非编码链（anticoding strand），又称antisense strand，是指那条根据碱基互补原则指导mRNA生物合成的DNA链。Genetic information is perpetuated by replication（复制）in which a double- stranded nucleic acid is duplicated to give identical copies.基因表达包括转录（transcription）和翻译（translation）两个阶段。转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除了TU之外）的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤。翻译是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联子遗传密码翻译成氨基酸序列、合成蛋白质多肽链的过程，是基因表达的最终目的。只有mRNA所携带的遗传信息才被用来指导蛋白质生物合成，所以人们一般用U、C、A、G这4种核苷酸而不是T、C、A、G的组合来表示遗传性状。所谓翻译是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。二. 遗传密码三联子mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这3个核苷酸就称为一个密码，也叫三联子密码。翻译时从起始密码子AUG开始，沿mRNA53的方向连续阅读直到终止密码子，生成一条具有特定序列的多肽链。mRNA中只有4种核苷酸，而蛋白质中有20种氨基酸，若以一种核苷酸代表一种氨基酸，只能代表4种(41=4)。若以两种核苷酸作为一个密码（二联子），能代表42=16种氨基酸。而假定以3个核苷酸代表一个氨基酸，则可以有43=64种密码，满足了编码20种氨基酸的需要。50-60年代破译遗传密码方面的三项重要成果：（1）Paul Zamecnik等人证实细胞中蛋白质合成的场所。他们把放射性标记的氨基酸注射到大鼠体内，经过一段时间后收获其肝脏，进行蔗糖梯度沉淀并分析各种细胞成份中的放射性蛋白质。如果注射后经数小时（或数天）收获肝脏，所有细胞成份中都带有放射性标记的蛋白质;如果注射后几分钟内即收获肝脏，那么，放射性标记只存在于含有核糖体颗粒的细胞质成份中。（2）Francis Crick等人第一次证实只有用三联子密码的形式才能把包含在由AUGC四个字母组成遗传信息（核酸）准确无误地翻译成由20种不同氨基酸组成的蛋白质序列，实现遗传信息的表达。实验1:用吖啶类试剂（诱导核苷酸插入或丢失）处理T4噬菌体rII位点上的两个基因，使之发生移码突变（frame-shift），就生成完全不同的、没有功能的蛋白质。实验2:研究烟草坏死卫星病毒发现，其外壳蛋白亚基由400个氨基酸组成，相应的RNA片段长1200个核苷酸，与密码三联子体系正好相吻合。实验3:以均聚物为模板指导多肽的合成。 在含有tRNA、核糖体、AA-tRNA合成酶及其它蛋白质因子的细胞抽提物中加入mRNA或人工合成的均聚物作为模板以及ATP、GTP、氨基酸等成分时又能合成新的肽链，新生肽链的氨基酸顺序由外加的模板来决定。1961年，Nirenberg等以poly（U）作模板时发现合成了多聚苯丙氨酸，从而推出UUU代表苯丙氨酸（Phe）。以poly（C）及poly（A）做模板分别得到多聚脯氨酸和多聚赖氨酸。实验4:以特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成。以多聚二核苷酸作模板可合成由2个氨基酸组成的多肽， 5UGU GUG UGU GUG UGU GUG3,不管读码从U开始还是从G开始，都只能有UGU（Cys）及GUG（Val）两种密码子。实验5:以共聚三核苷酸作为模板可得到有3种氨基酸组成的多肽。如以多聚（UUC）为模板，可能有3种起读方式：5UUC UUC UUC UUC UUC3或 5UCU UCU UCU UCU UCU3或 5CUU CUU CUU CUU CUU3分别产生UUC（Phe）、UCU（Ser）或CUU（Leu）.多聚三核苷酸为模板时也可能只合成2种多肽：5GUA GUA GUA GUA GUA3或5UAG UAG UAG UAG UAG3或5AGU AGU AGU AGU AGU3由第二种读码方式产生的密码子UAG是终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生GUA（Val）或AGU（Ser）。实验6:以随机多聚物指导多肽合成。Nirenberg等及Ochoa等又用各种随机的多聚物作模板合成多肽。例如，以只含A、C的多聚核苷酸作模板，任意排列时可出现8种三联子，即CCC、CCA、CAC、ACC、CAA、ACA、AAC、AAA，获得由Asn、His、Pro、Gln、Thr、Lys等6种氨基酸组成的多肽。（3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技术。如果把氨基酸与ATP和肝脏细胞质共培养，氨基酸就会被固定在某些热稳定且可溶性RNA分子（transfer RNA，tRNA）上。现将氨基酸活化后的产物称为氨基酰-tRNA（aminoacyl-tRNA），并把催化该过程的酶称为氨基酰合成酶（aminoacyl-tRNA Synthetase）。以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的反应液中保温后通过硝酸纤维素滤膜，只有游离的AA-tRNA因相对分子质量小而通过滤膜，而核糖体或与核糖体结合的AA-tRNA则留在滤膜上，这样可把已结合与未结合的AA-tRNA分开。当体系中带有多聚核苷酸模板时，从大肠杆菌中提取的核糖体经常与特异性氨基酰-tRNA相结合。如果把核糖体与poly（U）和Phe-tRNAPhe共温育，核糖体就能同时与poly（U）和Phe-tRNAPhe相结合。 4种核苷酸组成61个编码氨基酸的密码子和3个终止密码子，它们不能与tRNA的反密码子配对，但能被终止因子或释放因子识别，终止肽链的合成。由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy），对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子（synonymous codon）。三密码子和反密码子的相互作用蛋白质生物合成过程中，tRNA的反密码子通过碱基的反向配对与mRNA的密码子相互作用。1966年，Crick根据立体化学原理提出摆动假说（wobble hypothesis），解释了反密码子中某些稀有成分如I以及许多有2个以上同源密码子的配对问题。Wobble hypothesis 任意一个密码子的前两位碱基都与tRNA anticodon中的相应碱基形成Watson-Crick碱基配对。 反密码子第一位是A或C时，只能识别一个密码子。当反密码子第一位是U或G时，能识别两个密码子。当Inosine（I）作为反密码子第一位时，能识别三个密码子。 如果数个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、二位碱基不相同的密码子都对应于各自的tRNA。 根据上述规则，至少需要32种不同的tRNA才能翻译61个密码子。四tRNAtRNA在蛋白质合成中处于关键地位，被称为第二遗传密码。它不但为将每个三联子密码翻译成氨基酸提供了接合体，还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了载体。所有的tRNA都能够与核糖体的P位点和A位点结合，此时，tRNA分子三叶草型顶端突起部位通过密码子：反密码子的配对与mRNA相结合，而其3末端恰好将所转运的氨基酸送到正在延伸的多肽上。代表相同氨基酸的tRNA称为同工tRNA。在一个同工tRNA组内，所有tRNA均专一于相同的氨基酰- tRNA合成酶。1、tRNA的三叶草型二级结构受体臂（acceptor arm）主要由链两端序列碱基配对形成的杆状结构和3端末配对的3-4个碱基所组成，其3端的最后3个碱基序列永远是CCA，最后一个碱基的3或2自由羟基（OH）可以被氨酰化。TC臂是根据3个核苷酸命名的，其中表示拟尿嘧啶，是tRNA分子所拥有的不常见核苷酸。反密码子臂是根据位于套索中央的三联反密码子命名的。D臂是根据它含有二氢尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。最常见的tRNA分子有76个碱基，相对分子质量约为2.5104。不同的tRNA分子可有74-95个核苷酸不等，tRNA分子长度的不同主要是由其中的两条手臂引起的。tRNA的稀有碱基含量非常丰富，约有70余种。每个tRNA分子至少含有2个稀有碱基，最多有19个，多数分布在非配对区，特别是在反密码子3端邻近部位出现的频率最高，且大多为嘌呤核苷酸。这对于维持反密码子环的稳定性及密码子、反密码子之间的配对是很重要的。2tRNA的L形三级结构酵母和大肠杆菌tRNA的三级结构都呈L形折叠式。这种结构是靠氢键来维持的，tRNA的三级结构与AA- tRNA合成酶的识别有关。受体臂和TC臂的杆状区域构成了第一个双螺旋，D臂和反密码子臂的杆状区域形成了第二个双螺旋。tRNA的L形高级结构反映了其生物学功能，因为它上所运载的氨基酸必须靠近位于核糖体大亚基上的多肽合成位点，而它的反密码子必须与小亚基上的mRNA相配对，所以两个不同的功能基团最大限度分离。3tRNA的功能转录过程是信息从一种核酸分子（DNA）转移至另一种结构上极为相似的核酸分子（RNA）的过程，信息转移靠的是碱基配对。翻译阶段遗传信息从mRNA分子转移到结构极不相同的蛋白质分子，信息是以能被翻译成单个氨基酸的三联子密码形式存在的，在这里起作用的是解码机制。4tRNA的种类（1）起始tRNA和延伸tRNA能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸（Met）。（2）同工tRNA代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA，同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被AA- tRNA合成酶识别。（3）校正tRNA校正tRNA分为无义突变及错义突变校正。在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为无义突变。五AA- tRNA合成酶 是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶，其反应式如下：它实际上包括两步反应：第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸复合物。AA+ATP+酶（E）E-AA-AMP+PPi第二步是氨酰基转移到tRNA 3末端腺苷残基上，与其2或3-羟基结合。E-AA-AMP+ tRNAAA- tRNA +E+AMP 蛋白质合成的真实性主要决定于AA- tRNA合成酶是否能使氨基酸与对应的tRNA相结合。AA-tRNA合成酶既要能识别tRNA，又要能识别氨基酸，它对两者都具有高度的专一性。不同的tRNA有不同碱基组成和空间结构，容易被tRNA合成酶所识别，困难的是这些酶如何识别结构上非常相似的氨基酸。 有两道关口:The first filter is the initial binding of the amino acid to the enzyme and its activation to aminoacyl-AMP. The second filter is the binding of incorrect aminoacyl-AMP products to a separate active site on the enzyme. 核糖体像一个能沿mRNA模板移动的工厂，执行着蛋白质合成的功能。它是由几十种蛋白质和几种核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）组成的亚细胞颗粒。一个细菌细胞内约有20000个核糖体，而真核细胞内可达106个，在未成熟的蟾蜍卵细胞内则高达1012。核糖体和它的辅助因子为蛋白质合成提供了必