实验室标准操作规程SOP.doc

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烟台新海水产食品有限公司 2007年08月08日发布 第0次修改

实验室标准操作程序
（SOP）

版 号：第一版
编 制：
审 核：
批 准：呵僚钧鳃晌微陪棵汇搁旭肖努庄谰桐承疲秉旱慕庙既锌圈维檀尤绕曳炙趴袜眨德季窿貉峻态歼泼跑倔犬垒矗功委草藐犯退隋彰壁随越影溪姬俐锗盖蔚偷鸳梢媒醛周崭挫帜殆顿军角颈姬构揍阮僳磁匈裴掂弹迎田柬伯样投督滓砚蚀珊蠢轰凑册堰坏槐厩职释足芋寡叁阉傍能蹦曝诵嘲揣争绊肥拖虐宦疗觅乍涯柿宿洱衣掳款深栈渺锨萄棵竭瞻穿脾肩蕾好蚀悄懊翁挖鲁串荷虱挚嘉测古饶聂揽爆地欣茫囚站琐智汪澈渗脖遏弟纹逐樊二班瓤慎腿沛袄莱融挟霜阐柳格怀摘从妄困荤射份扇与拐卫宝搂栅贯店稍檬忍巧显渐柠匀健逼射镭钵尺蹦胸瑞厕挡腥鸽蔚座畔堆谈慑而歹吭亏壳顽肋痈寒粉凤殖千呢实验室标准操作规程SOP糜首瞩水鸥泄被缆酶企趋拐并啪主痪半鲤童弦昼廷进泅蕾搪妮自猾涅灸顿窒垢抑壤陇燥范宫邻幽根信橡欺神敦乾拆丝拆帜蕴贪咖悠蔫渺竣笋垄啊特永骇杜莲匹里崩受挛投酒搓庭讹窑腰式桥钥韵峙飞空至凤朴和瓜竿浆官阂干舵魏铜聘蝴粪勘踌桑录檀博渡诅好掂耕慷区词症泛徽朝鄙侄谗铁枢辰店遵岩氯橡镐裕结办馅斤惋丽燃故器秧槐苯灵脆境阜迹扦振椅志悲闽辕读唤营童抒荆倪抡缺蓉檀勉绷妖掉幸淫芒增敬皇糠灭纸盐啪伎聋抑涸虹伴羽吨妒射信缓迅赋驹颠鞠赣糜堵伸钟临捷势灯秧螟氨帝涧躲攘榔奢槽换并凌讯幼劈厘性盎目烙白晒渊幅挨窖粗臀霉锦惕懦霍膨苛电歌何颈宴柄葡甚雀醒

实验室标准操作程序
（SOP）

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发布日期: 2007年08月08日 实施日期: 2007年08月08日

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00. 目 录
章节
标题
页数
01
细菌总数的检验
4
02
大肠菌群、大肠杆菌的检验
5
03
金黄色葡萄球菌的检验
5
04
沙门氏菌的检验
6
05
副溶血性弧菌的检验
7
06
霍乱弧菌的检验
8
07
单核细胞增生李斯特氏菌的检验
9
08
志贺氏菌的检验
10
09
霉菌的检验
11
10
表面样品的检验
12
11
水的检验
13

01. 出口食品细菌总数的检验方法
1.仪器和设备
1．1恒温培养箱：36±1℃
1．2恒温水浴箱：45±1℃
1．3高压灭菌锅
1．4均质器
1. 5冰箱：0-4℃和-15～-20℃
1．6试管:18×150mm
1．7锥形瓶:500ml 250ml
1．8平皿：直径为90mm
1．9灭菌吸管
1．10灭菌均质杯
1．11酒精棉
1．12天平:感量0.1g
2．培养基的制备
2.1 生理盐水:
称氯化钠8.5g溶于1000.0ml蒸馏水中,分装锥形瓶和试管内,每管吸9ml，121℃高压灭菌。
2.2平板计数琼脂
称平板计数琼脂23.5g加入1000.0ml蒸馏水中，煮沸溶解，分装锥形瓶内，121℃高压灭菌。
3.操作程序
3.1样品稀释

以无菌操作取25g样品 放入装有225ml生理盐水的灭菌均质杯内，
均质1分30秒，制成1：10的样品匀液 用灭菌吸管吸取1ml样液
放入9ml生理盐水中，摇匀。 从试管中吸取1ml样液 分别注入两个平皿内，
制成10倍的样品稀释液， 依次类推（10-2、10-3） 平板计数琼脂（恒温45±1℃）
分别倒12-15ml平板计数琼脂入各平皿 待琼脂凝固后将平皿翻转
立即将平皿内的样液和琼脂充分混合 将平皿旋转，注意倾注时间不宜太长
立即放进36±1℃的恒温培养箱内 培养48±2h
3.2培养
4.计算如下表（备注：25-250个菌落为合适范围，菌落成链状明显的计为一个菌落，不明显的不计数，平皿边缘和琼脂表面成水膜样菌落或生长过量的，即报告为蔓延菌落。）

样品号
菌 落 数
平皿菌落数
1：10 1：100 1：1000
1
238 16 0
212 18 0
2.3×103个/g
2
236 26 0
227 28 0
2.5×103个/g
3
18 0 0
14 4 0
1.6×102个/g
4
多不可计 245 23
多不可计 278 20
2.6×104个/g
5
0 0 0
0 0 0
＜10个/g
6
多不可计 255 21
多不可计 225 40
2.7×104个/g
7
多不可计 210 18
多不可计 240 28
2.3×104个/g
8
多不可计 260 30
多不可计 230 28
2.7×104个/g
9
多不可计 多不可计 523
多不可计 多不可计 487
5.1×105个/g
10
多不可计 245 35
多不可计 230 蔓延菌落
2.9×104个/g

02.出口食品大肠菌群和大肠杆菌的检验方法
1． 仪器和设备
1．1恒温培养箱：36±1℃
1．2恒温水浴箱：44.5±1℃
1．3高压灭菌锅
1．4均质器
1．5试管:18×150mm、18×180mm
1．6锥形瓶:500ml 250ml
1．7平皿：直径为90mm
1．8灭菌均质杯
1．9灭菌吸管
1．10酒精棉
1．11天平：感量0.1g
1.12冰箱：0-4℃和-15～-20℃
1.13显微镜
2．培养基的制备
2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤
称35.6g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18×180mm试管中，每管10ml，于121℃高压灭菌15min。
2.2煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）
称40g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18×180mm试管中，每管10ml，121℃高压灭菌15min。
2.3EC肉汤
称37g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18×180mm试管中，每管吸8ml，121℃高压灭菌15min。
2.4伊红美蓝琼脂（EMB）
称37.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于三角烧瓶，121℃高压灭菌15min。摇匀冷却至45℃倾注平皿。
2.5营养琼脂
称33g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，121℃高压灭菌15min。制成斜面备用。
2.6生理盐水
称氯化钠8.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，分装锥形瓶和18×150mm试管内，121℃高压灭菌15min。
2.7成品生化管
2.7.1色氨酸肉汤 2.7.2 MR-VP 2.7.3 Koser氏枸橼酸盐琼脂 2.7.4革兰氏染色试剂盒 2.7.5 Kovacs氏靛基质试剂2.7.6 甲基红指示剂 2.7.7 V-P 试剂甲液和乙液
3.操作步骤
3.1样品的稀释和培养
以无菌操作取25g样品
放入装有225ml生理盐水的无菌均质杯内，
均质1分30秒，制成1：10的样品匀液
用灭菌吸管吸取1ml均质好的样液

放入9ml生理盐水中，摇匀

前3支LST中分别注入1ml均质好的样液
作为十倍的连续稀释度的样品稀释液

从9ml生理盐水中吸取1ml稀释液，

先注入另一支9ml生理盐水中摇匀
接着吸取1ml样品稀释液
分别注入中间3支LST中，

作为百倍的连续稀释度的稀释液

再从9ml生理盐水中吸取1ml稀释液
分别注入后三支LST中
作为千倍的连续稀释度的稀释液

将LST放入36±1℃培养箱培养48±2h

培养后观察导管内是否有气泡产生
未产气报告为阴性,产气者进一步实验

3.2大肠菌群的测定
将所有产气管用接种环接到BGLB中

放入36±1℃培养箱培养48±2h

查MPN表报告大肠菌群的MPN值

3.3大肠杆菌的测定
同时将所有LST培养物接种到EC肉汤中

放入44.5±1℃的水浴箱内培养48±2h
注意水浴箱的水面应高于肉汤管液面
如产气将培养物接种于EMB平板

放入36±1℃培养箱培养48±2h

未产气报告阴性查MPN表

观察平板有无黑色中心、有无光泽菌落

如有菌落挑两个典型的接种营养斜面

36±1℃培养18~24h

3.4将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化实验。
3.4.1
色氨酸肉汤36±1℃培养24±2h后

加kovacs氏靛基质两滴

上层出现红色为阳性反应

MR-VP培养基36±1℃培养48±2h

无菌操作移取培养物1ml至灭菌试管中

加5％ａ-萘酚乙醇溶液0.6ml，

40％KOH溶液0.2ml和少许肌酸结晶

3.4.2

振摇试管后静置2 h出现红色为阳性

剩余MR-VP再培养48h滴加5d甲基红

如变红为阳性，变黄为阴性

3.4.3
36±1℃培养96h记录有无生长

Koser氏枸橼酸盐琼脂

3.4.4
革兰氏染色

取18h斜面培养物作革兰氏染色

大肠杆菌为革兰氏阴性

靛基质
MR
VP
枸橼酸盐
鉴定（型别）
＋
－
＋
＋
－
－
－
－
典型大肠杆菌
非典型大肠杆菌
3.4.5大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：
3.5结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为＋＋－－或－＋－－，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克样品中大肠杆菌MPN值。
1g样品中最近似值(MPN)表
使用三管法,接种量分别为0.1g,0.01g,0.001g
阳性管数
MPN
阳性管数
MPN
0.1 0.01 0.001
0.1 0.01 0.001
0
0
0
＜3
2
0
0
9.1
0
0
1
3
2
0
1
14
0
0
2
6
2
0
2
20
0
0
3
9
2
0
3
26
0
1
0
3
2
1
0
15
0
1
1
6.1
2
1
1
20
0
1
2
9.2
2
1
2
27
0
1
3
12
2
1
3
34
0
2
0
6.2
2
2
0
21
0
2
1
9.3
2
2
1
28
0
2
2
12
2
2
2
35
0
2
3
16
2
2
3
42
0
3
0
9.4
2
3
0
29
0
3
1
13
2
3
1
36
0
3
2
16
2
3
2
44
0
3
3
19
2
3
3
53
1
0
0
3.6
3
0
0
23
1
0
1
7.2
3
0
1
39
1
0
2
11
3
0
2
64
1
0
3
15
3
0
3
95
1
1
0
7.3
3
1
0
43
1
1
1
11
3
1
1
75
1
1
2
15
3
1
2
120
1
1
3
19
3
1
3
160
1
2
0
11
3
2
0
93
1
2
1
15
3
2
1
150
1
2
2
20
3
2
2
210
1
2
3
24
3
2
3
290
1
3
0
16
3
3
0
240
1
3
1
20
3
3
1
460
1
3
2
24
3
3
2
1100
1
3
3
29
3
3
3
＞1100
备注： 1.上表采用3个稀释度（0.1g、0.01g和0.001g）每个稀释度3管。 2.如检样量改用1g、0.1g和0.01g时，表内数字相应降低10倍；如改位0.01g、0.001g和0.0001g时，表内数字相应增加10倍，其余类推。

03.出口食品金黄色葡萄球菌的检验方法仪器和设备
1．1恒温培养箱：36±1℃
1．2恒温水浴箱：45±1℃
1．3高压灭菌锅
1．4均质器
1．5试管:18×150mm 18×180mm
1．6锥形瓶:500ml 250ml
1．7平皿：直径为90mm
1．8灭菌吸管
1．9灭菌均质杯
1．10酒精棉
1．11天平:感量0.1g
1．12冰箱：0-4℃和-15～-20℃
2．培养基的制备
2.1生理盐水
称氯化钠8.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，分装锥形瓶和18×150mm试管内，每管吸9ml,121℃高压灭菌15min。
2.2胰蛋白胨大豆肉汤
称大豆肉汤30g和氯化钠95g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装18×180mm试管内，每管吸10ml,121℃高压灭菌15min。
2.3Baird-parker培养基
称6.3g溶于95ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装锥形瓶内，121℃高压灭菌15min。冷却至50℃，加入1瓶亚碲酸钾卵黄增菌液（冻干粉加5ml无菌生理盐水溶解）混匀。倾注平板备用，待平板凝固后放入冰箱0-4℃。
2.4普通肉汤培养基
称18g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装18×180mm试管，每管吸10ml，121℃高压灭菌15min。
2.5冻干血浆（凝固酶试验）
每支安瓶中加入0.5ml灭菌生理盐水至完全溶解，然后加入0.3ml待检液，于37℃6 h培养，观察判定结果。
3.操作步骤
3.1样品的稀释和培养
以无菌操作取25g样品
放入装有225ml生理盐水的无菌均质杯内，
均质1分30秒，制成1：10的样品匀液
用灭菌吸管吸取1ml均质好的样液

先放入9ml生理盐水中，摇匀
前3支大豆肉汤分别吸1ml均质好的样液
作为十倍的连续稀释度的样品稀释液

从9ml生理盐水中吸取1ml稀释液，

先注入另一支9ml生理盐水中摇匀
接着吸取1ml样品稀释液
分别注入中间3支大豆肉汤中，

作为百倍的连续稀释度的稀释液

再从9ml生理盐水中吸取1ml稀释液
分别注入后三支大豆肉汤中
作为千倍的连续稀释度的稀释液

放入36±1℃培养箱培养48±2h

从各管接1环划线于Baird-parker平板
放入36±1℃培养箱培养48±2h

再从每一平板上挑取1个可疑菌落

移种到肉汤培养基中，36℃培养24h

取肉汤培养物0.3ml和0.5ml凝固酶试验
于灭菌试管内充分混合，36℃培养

观察6h是否有凝块，完全凝固为阳性

备注：金黄色葡萄球菌的单个菌落在Baird-Parker琼脂平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润，直径2～3mm。灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围饶以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同，从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落，其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥。
3.2报告结果
查MPN表，报告金黄色葡萄球菌MPN/g。

04.出口食品沙门氏菌属的检验方法
1．仪器和设备
1．1恒温培养箱：36±1℃
1．2恒温水浴箱：45±1℃
1．3高压灭菌锅
1．4均质器
1. 5冰箱：0-4℃和-15～-20℃
1．6试管:18×150mm 12 mm×100 mm
1．7锥形瓶:500ml 250ml
1．8平皿：直径为90mm
1．9灭菌吸管
1．10灭菌均质杯
1．11酒精棉
1．12天平:感量0.1g
2．培养基的制备
2．1亚硒酸胱氨酸增菌液（SC）
称取23g于1升蒸馏水中在无菌容器中溶解，定量分装备用。
2．2亚硫酸铋琼脂（BS）
称取49.6g于1升蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，冷却至55℃，摇匀，倾注灭菌平板备用。培养基不需要高压灭菌，平板为橙黄色。
2．3胆硫乳琼脂
称取64.3g于1升蒸馏水中，浸泡15分钟，煮沸至完全溶解，冷却至55℃，倾注灭菌平板备用。培养基不需要高压灭菌，新制备的培养基为玉白色不透明，
2．4三糖铁（TSI）
称取65g于1升蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12 mm×100 mm，每管约2～4ml，115℃15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用，桔红色。
2．5尿素酶琼脂基础（U）
称取2.21g于95ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃15分钟高压灭菌，冷却至55℃灭菌加入40％尿素溶液5ml，混匀，分装灭菌试管12 mm×100 mm，每管2～3ml， 制成斜面备用。
实验与判断：大量接种于37℃培养24±2h，强阳性反应为深红色，弱阳性为粉红色，阴性为黄色或不变色。
2．6赖氨酸脱羧酶培养基（LD）
称取1.9g于100ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12 mm×100 mm，每管1～1.5ml，，121℃15分钟高压灭菌备用。
试验与判断：大量接种于37℃培养24±2h，阳性反应为紫色，阴性反应为黄色。
2．7吲哚培养基（I）
称取1.6g于100ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12 mm×100 mm，每管1～1.5ml，121℃15分钟高压灭菌。

2．7．1试验
接种于37℃培养24±2h，滴加柯凡克试剂0.1ml。
2．7．2判断
阳性反应出现红色环；阴性为黄棕色环。
2．8V-P半固体琼脂（VP）生化管
试验：接种后于37℃培养24±2h，将甲液0.2ml(约6滴)加入试管中，摇匀，再加乙液0.1ml（约3滴），再摇匀。
判断：阳性反应立即或在15min内呈现红色，阴性为铜色。阴性结果在1h后再做一次检查。有些试管在数小时后红色会逐渐消失，此仍作阳性反应。
2．9丙二酸钠生化管（M）
试验与判断：接种大量幼嫩试菌，于37℃培养24±2h，阳性反应为普蓝色；阴性不变色。
2．10卫矛醇半固体（D）
试验与判断：穿刺接种待试菌，于37℃培养24±2h，阳性反应为黄色阴性不变色
3．操作程序
3.1分离培养
再加入25g样品（无菌操作）
在装有225ml无菌水中加上5.2gSC
于37℃培养24±2h
划线接种BS和DHL琼脂平板各一个

于37℃培养24～48h

每个平板至少挑取2个典型或可疑菌落
分别接种LD和U管，
接种后不须灭菌接种针，直接接种TSI

于37℃培养24±2h

挑取菌落后的琼脂平板,应置于4～8℃
至少保留24h，以备必要时复查。

沙门氏菌落特征
琼脂平板
沙门氏菌落特征
BS琼脂
棕褐色或灰色至黑色，有时有金属光泽，周围培养基呈棕色或黑色，有些菌株呈灰绿色，周围培养基不变或微变暗
DHL琼脂
无色半透明有黑色中心或几乎全为黑色，有些菌株无色半透明
3．2按下表进行试验与判断：
TSI和LD培养基筛选
TSI琼脂
LD培养基
初步判断
斜面
底层
产气
硫化氢
K
A
＋（－）
＋（－）
＋
可疑沙门氏菌属
K
A
＋（－）
＋（－）
－
可疑沙门氏菌属
A
A
＋（－）
＋（－）
－
非沙门氏菌属
K
K
＋/－
＋/－
＋/－
非沙门氏菌属
注：K－产碱；＋－阳性反应；（－）－少见反应；A－产酸；－－阴性反应；＋/－－阳性或阴性反应。
TSI和U琼脂筛选
TSI琼脂
U琼脂
初步判断
斜面
底层
产气
硫化氢
K
A
＋（－）
＋（－）
－
可疑沙门氏菌属
K
A
＋（－）
＋（－）
＋
非沙门氏菌属
A
A
＋（－）
＋（－）
＋
非沙门氏菌属
K
K
＋/－
＋/－
＋/－
非沙门氏菌属
注：K－产碱；＋－阳性反应；（－）－少见反应；A－产酸；－－阴性反应；＋/－－阳性或阴性反应。

4．生化试验
4．1将符合可疑沙门氏菌属特征的TSI琼脂培养物，按下表进行生化试验。
序号
生化项目
沙门氏反应
1
U试验
－
2
V-P试验
－
3
LD试验
＋
4
吲哚试验
－
5
丙二酸钠试验
－
6
卫矛醇试验
d
注：＋－阳性反应；－－阴性反应；d－反应不定。
4．2所有生化试管均于37℃培养24±2h。
4．3生化试管结果符合沙门氏菌属特性按血清学试验进行。
4．4血清学试验
4．4．1检查培养物有无自凝性
在洁净的玻片上加一滴生理盐水，将待试培养物混合于生理盐水滴内，使成为均一性的 浑浊悬液，将玻片轻轻摇动30～60s，在黑色背景下观察反应（最好用放大镜观察）。如菌体彼此相凝集成明显或比较显小颗粒状物，即认为有自凝性，反之无自凝性。
4．4．2检查“O”抗原
对无自凝性的培物，按3.4.1的程度进行试验,但以多价“O”血清代替生理盐水,在2min判断结果.如为阳性结果以单价“O”血清进行分群试验.如为阴性结果,必要时,可结合生化试验结果按“Vi”抗原进行试验,再以多价和单价“O”血清进行试验.
4．4．3检查“Vi”抗原
按3.4.1的程序进行,但以“Vi” 血清代替生理盐水。
5．报告结果：
5．1报告阳性结果：发现沙门氏菌。
5．2报告阴性结果：未发现沙门氏菌。

06.出口食品霍乱弧菌的检验方法
1．仪器和设备
1．1恒温培养箱：36±1℃
1．2恒温水浴箱：45±1℃
1．3高压灭菌锅
1．4拍打式均质器
1．5菌落计数器
1．6试管:18×150mm 12 mm×100 mm
1．7锥形瓶:500ml 250ml
1．8平皿：直径为90mm
1．9灭菌盒和枪头
1．10灭菌袋
1．11酒精棉
1．12天平:感量0.1g
1.13冰箱：0-4℃和-15～-20℃
2．培养基的制备
2．1碱性蛋白胨水
称取15g干粉于1000.0ml蒸馏水中，加热溶解，分装，121℃10min高压灭菌。
2．2硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂（TCBS）
称取89.1g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，冷至55℃倾注平板备用。
2．3三糖铁（TSI）
称取65g于1升蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12 mm×100 mm，每管约2～4ml，115℃15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用，桔红色。
2．4霍乱双糖铁琼脂（KIA）
称取64.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热溶解，分装。121℃15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用。
2．5T1N1琼脂
称取35g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃15分钟高压灭菌。倾注平板备用。
在上项成分中改变氯化钠的含量，去除琼脂可制成T1N0 和T1N3肉汤。
2．6精氨酸葡萄糖斜面琼脂（AGS）
称取58g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装，121℃15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用。
2．7 O/F实验用培养基（HLGB）
称取45.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装，每管3ml（有的加矿物油覆盖）121℃15分钟高压灭菌备用。
2．8赖氨酸脱羧酶肉汤生化管
2．9MR-VP肉汤生化管
3.1样品的分离培养和初步鉴定:
以无菌操作取25g样品
放入装有225ml生理盐水的无菌袋内，
均质1分30秒，制成1：10的样品匀液
用灭菌枪头吸取1ml均质好的样液

放入9ml碱性蛋白胨水中
36±1℃培养18~24h

接种TCBS琼脂,36±1℃培养12~18h

划线接种于T1N1琼脂36±1℃培养12~18h

以无菌白色滤纸沾T1N1琼脂表面培养物

滴加氧化酶试剂进行氧化酶试验

用接种环取氧化酶阳性培养物

0.5％去氧胆酸钠液滴中进行粘丝试验

以接种针取氧化酶和粘丝试验阳性物

接种TSI 、KIA和AGS，

穿刺底层并划线斜面

在取氧化酶和粘丝试验阳性培养物

接种T1N0 和T1N3肉汤

将TSI 、KIA、AGS、T1N0、T1N3肉汤

于36±1℃培养18~24h

注：霍乱弧菌菌落特征形状大，光滑，黄色，稍平，具有不透明中心和半透明的边缘。
霍乱弧菌初步鉴定试验中的反应

KIA
TSI
T1N0
T1N3
斜面
底层
斜面
底层
斜面
底层
霍乱弧菌

A(K少见)
A
A
a
＋
＋
注：K-碱性；A-酸性；a-微酸性。
霍乱菌属细菌在TSI、KIA、AGS中不产H2S，也不产气。一些气单胞菌属菌株可能产气。
3．2确认试验
以接种环取初步鉴定试验符合霍乱弧菌反应的T1N3培养物，分别接种到以下培养基：
Hugh-Leifson葡萄糖肉汤（HLGB），36±1℃培养18~24h。
ONPG胨水，36±1℃培养1h～3h或24h。
赖氨酸脱羧酶肉汤，36±1℃培养24~96h。
阿拉伯糖肉汤，36±1℃培养24h。
O/129试验用培养基，36±1℃培养18~24h。
霍乱弧菌的生化反应表
生化项目
生化性状
生化项目
生化性状
TCBS
Y
D-甘露糖
＋
AGS
Ka
氧化酶ONPG
＋
Nacl 0％
＋
V-P
v
3％
＋
精氨酸双水解酶
－
6％
－
赖氨酸脱羧酶
＋
8％
－
鸟氨酸脱羧酶
＋
10％
－
抑菌试验

42℃生长
＋
10ugO/129
S
蔗糖
－
150 ugO/129
S
D-纤维二糖
－
明胶酶
＋
乳糖
－
尿素酶
－
阿拉伯糖
－

注：Y-黄色；K-碱性；＋-80％或更多的菌株阳性；－-80％或更多的菌株阴性；v-依据种或菌株的可变反应；S-敏感；AGS-精氨酸-葡萄糖斜面。
所有试验均不产H2S和气体。
4．血清学凝集试验
4．1自分离培养基上挑取可疑菌落与O1群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。如可疑菌落在诊断血清中很快（一般在10s）出现肉眼可见的明显凝集，在生理盐水中不凝集者判为阳性。
5报告结果
霍乱弧菌的检出，可依据以下性状报告：
革兰氏染色阴性，无芽孢或弯曲杆菌；
TSI：斜面产酸/底层产酸，不产气，不产H2S；
Hugh-Leifson 试验：葡萄糖发酵阳性；
氧化酶：阳性；
精氨酸脱羧酶试验：阴性；
赖氨酸脱羧酶试验：阳性；
42℃生长：阳性；
嗜盐性试验：0％Nacl＋(有的非O1群霍乱弧菌不生长)
3％Nacl＋
6％Nacl－
蔗糖发酵：阳性；
ONPG试验：阳性；
阿拉伯糖发酵：阴性
O/129抑菌试验：10ug敏感；150ug敏感；
血清学试验：O1群、O139群、非O1群。
最终结果的报告，应在生化试验的基础上报告血清群别、血清型别和生物型别。

口
07.出口食品单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法
1．仪器和设备
1．1恒温培养箱：36±1℃
1．2恒温水浴箱：45±1℃
1．3高压灭菌锅
1．4均质器
1. 5冰箱：0-4℃和-15～-20℃
1．6试管:18×150mm 12 mm×100 mm
1．7锥形瓶:500ml 250ml
1．8平皿：直径为90mm
1．9灭菌吸管
1．10灭菌均质杯
1．11酒精棉
1．12天平:感量0.1g
2．培养基的制备
2．1含0.6％酵母浸膏的胰酪大豆肉汤（TSB-YE）
称取3.6g药品溶入100ml蒸馏水中，水浴加热30min，分装试管，121℃高压灭菌15min，冷却后0～4℃冰箱保存备用。
2.2含0.6％酵母浸膏的胰酪大豆琼脂（TSA-YE）
称取4.7g药品溶入100ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却50℃左右倒平板，待琼脂凝固后，放入0～4℃冰箱保存备用。
2.3 Fraser肉汤增菌液（FB1 、FB2）
FB1 ：称取12.38g药品溶入225ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃左右加入FB1 添加剂1和添加剂2各1支备用。
FB2：称取1.1g药品溶入20ml蒸馏水中，水浴加热30min，分装试管，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃左右加入FB2添加剂1和添加剂2各1支备用。
2.4 PALCAM琼脂
称取6.61g药品溶入100ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃左右加入PALCAM添加剂1和添加剂2各0.4ml，倒平板，待琼脂凝固后，放入0～4℃冰箱保存备用。
2.5 OXA琼脂
称取5.85g药品溶入100ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃左右加入吖啶黄素、放线菌酮、多粘菌素E各1支，倒平板，待琼脂凝固后，放入0～4℃冰箱保存备用。
2.6 7％羊血琼脂
2.7 SIM动力培养基
称取3.0g药品溶入100ml蒸馏水中，水浴加热30min，分装试管，121℃高压灭菌15min，制成高层斜面，冷却后0～4℃冰箱保存备用。
2.8硝酸盐培养基
2.9缓冲葡萄糖蛋白胨水
2.10糖发酵培养基
2.11过氧化氢酶试验
3.操作程序
3.1样品的培养和分离
30±1℃培养25±1h前增菌
称取25g样品放入225ml FB1 培养基中
吸取1ml培养物，加入FB1 增菌液中，
30±1℃培养25±1h二次增菌

挑取可疑菌落，接种TSA-YE琼脂平板
取1环划线分离于OXA和PALCAM平板
35℃培养24h

3．2生化鉴定
3．2．1
取菌落于载玻片上，
典型运动镜检
用0.85％灭菌生理盐水制成悬浊液，
压上盖玻片，于显微镜下观察

呈短棒杆菌，见有轻微旋转翻滚

3．2．2
菌落呈短杆状革兰氏阳性
革兰氏染色

以无菌操作取25g样品

3．2．3
去菌落于洁净载玻片上，
过氧化氢酶试验
滴加1滴3％的H2O2溶液，
菌落呈过氧化氢酶阳性反应

3．2．4
将羊血琼脂平板划分为25个小格，
溶血试验
每格刺种1个菌落，30℃培养28～48h，
菌落呈β-型溶血环

3．2．5
30℃培养24h，
转种典型菌于TSB-YET肉汤中，
蓝色菌落检验

3．2．5．1
取培养物穿刺接种SIM半固体培养基，
动力试验
室温（20～25℃）培养48h至7天，
在半固体试管内呈典型伞状生长。

3．2．5．2
取培养物接种硝酸盐肉汤中，
硝酸盐还原试验
35℃培养5天，
加入甲液0.2ml再加入乙液0.2ml，混匀，

2min内呈红色为阳性

3．2．5．3
取培养物接种MR-VP肉汤中，
MR-VP试验
35℃培养48h，
取1ml培养物于洁净试管中，

再加入4％氢氧化钾溶液0.2ml,摇匀，
加5％α-萘酚溶液0.5ml，
呈红色为VP阳性,
剩余培养物继续培养48h,加甲基红1d,

出现红色为MR阳性反应。

3．2．5．4
取培养物接种于三糖铁琼脂，
三糖铁试验
35℃培养5天，
斜面和底层产酸，不产硫化氢。