尼罗罗非鱼高迁移率族蛋白4...在细菌感染过程中的表达特征_江栢坚.pdf

第 38 卷第 1 期大 连 海 洋 大 学 学 报大 连 海 洋 大 学 学 报Vol.38 No.12 0 2 3 年 2 月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITYFeb.2 0 2 3DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2022-083文章编号:2095-1388(2023)01-0086-09尼罗罗非鱼高迁移率族蛋白 4(TOX4)基因克隆及其在细菌感染过程中的表达特征江栢坚1,2,张志强1,2,巫祎琴1,2,于劼豪1,2,黄瑜1,2,简纪常1,2(1.广东海洋大学 水产学院,广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室,广东 湛江 524088;2.广东省高等学校水产动物疾病控制重点实验室,南方海洋科学与工程广东省实验室,广东 湛江 524088)摘要:为了解析与胸腺细胞选择相关的高迁移率族蛋白 4(tox high mobility group box family member 4,TOX4)在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)响应无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染过程中的功能,利用聚合酶链式反应(PCR)克隆和鉴定尼罗罗非鱼 TOX4 基因(GenBank 登录号:XP003458812)的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,对推导的 TOX4 氨基酸序列进行生物信息学分析,分析其亚细胞定位特征,以及在尼罗罗非鱼头肾淋巴细胞亚群的分布特征,并利用荧光定量 PCR(qRT-PCR)技术分析 TOX4 基因在健康鱼各组织及响应无乳链球菌感染过程中的表达模式。结果表明:尼罗罗非鱼 TOX4基因的 ORF 全长为 2 004 bp,编码 667 个氨基酸,预测 TOX4 蛋白的相对分子质量为 69 060,理论等电点为 4.69,无信号肽序列及跨膜结构,具有一个 HMG 保守结构域;亚细胞定位结果显示,TOX4 蛋白主要表达于细胞核中;多序列比对及系统进化分析均显示,尼罗罗非鱼与斑马拟丽鱼(Maylandia zebra)TOX4 氨基酸序列的同源性最高;qRT-PCR 分析显示,TOX4 基因在健康尼罗罗非鱼各组织中均有表达,且在血液中表达量最高;单细胞转录组数据分析显示,TOX4 基因主要在尼罗罗非鱼非特异性细胞毒性细胞(non-specific cytotoxic cell,NCC)和巨噬细胞(macrophage,M)中表达;经无乳链球菌感染后,尼罗罗非鱼脑、头肾、肠道和脾脏中 TOX4 基因的表达量显著上调,并在感染后 12 h(脑、头肾、肠道)和 48 h(脾脏)达到峰值。研究表明,TOX4 可能参与尼罗罗非鱼响应细菌感染的免疫应答过程。关键词:尼罗罗非鱼;胸腺细胞选择相关的高迁移率族蛋白 4(TOX4);无乳链球菌;表达模式中图分类号:S 917.4 文献标志码:A HMG(high mobility group)蛋白是一种染色质结合蛋白,因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有高迁移率特征,又称高迁移率基团1。HMG 家族蛋白通常根据 HMG 结构域数量与 DNA 的结合特异性分为两个亚群,第一种能识别 DNA 的结构特征,但是却较少或无序列特异性,具有广泛的组织分布,通常 包 含 两 个 或 者 更 多 的 HMG-box 基 序,如BMGB12;第二种能以序列特异性的方式与 DNA结合,包含一个 HMG-box 结构域,由胸腺细胞选择相关的高迁移率族蛋白盒(thymocyte selection-associated HMG box protein,TOX)3和性别决定基因(sexdetermining region Y,SRY)相关的高迁移率 族 蛋 白 盒(SRY related HMG box protein,SOX)4家族成员等多种蛋白组成。HMG 家族蛋白具有的 HMG-box 基序会形成 3 个螺旋(典型的L 型结构),可与 DNA 双螺旋的小沟结合,促进染色体解开5。HMG-box 同时还可以结合转录因子和其他基于 DNA 活动所需要的调节因子,调节基因的复制、转录和 DNA 序列的修复6-8。TOX4 是一种高迁移率基团(HMG)盒转录调节因子,可与 DNA 结合,调控基因的转录,在免疫系统和癌症中发挥作用,作为 PTW/PP1 磷酸酶复合物的组成部分,在有丝分裂向间期过渡期间,对染色质结构和细胞周期进程起控制作用9-10。除此之外,TOX4 还是一种新的调节细胞命运的因子,TOX4 在重编程早期就参与其中11。Aliahmad 等12通过 qRT-PCR、免疫荧光和细胞分选等技术研究发现,TOX 是适应性免疫系统发育的调节因子,收稿日期:2022-03-22 基金项目:国家自然科学基金(32073006,32002426);湛江市非资助科技攻关计划项目(2020B01169)作者简介:江栢坚(1997),男,硕士研究生。E-mail:282992090 通信作者:黄瑜(1986),男,博士,讲师。E-mail:huangyu 参与 NK 细胞(nature killer cell)和 CD4+T 细胞的发育。Morchikh 等13通过共定位和过表达等方法研究发现,TOX4 与剪接辅助因子 NOVA1 在 DNA存在的情况下相互作用,可能涉及慢病毒整合、DNA 修复和转录调控等过程。Sun 等14通过 RNA干扰和基因敲除技术发现,甲基-CpG-结合结构域蛋 白 2(methyl-CpG binding domain protein 2,MBD2)通过激活 TOX4 在横纹肌溶解综合征诱导的急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)中诱导肾细胞凋亡。由此可见,TOX4 在哺乳动物中广泛参与免疫应答,但其在鱼类免疫应答过程中的作用尚未见相关报道。尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)隶属于鲈形目(Percomorpha)丽鱼科(Cichlaidae)罗非鱼属(Oreochromis),原产于非洲大陆,又名非洲鲫。因其肉质细嫩、味道鲜美、营养价值高、繁殖能力强、生长速度快、适应能力强和易于养殖等特点,已成为中国南方重要的养殖品种15。近年来,无乳链球菌病的暴发,严重影响了中国罗非鱼养殖业的发展16-17,因此,了解罗非鱼自身的免疫机制在抵抗无乳链球菌感染中的作用就显得尤为重要。本研究中,对 TOX4 基因的 ORF 序列进行克隆,并进行生物信息学及亚细胞定位分析,同时利用荧光定量 PCR(qRT-PCR)技术,分析该基因在健康和无乳链球菌刺激后罗非鱼主要免疫组织中的表达模式,以期为 TOX4 在鱼类中的免疫功能研究提供数据参考。1 材料与方法1.1 材料试验用健康尼罗罗非鱼购自湛江市某养殖场,体质量为(10010)g;以 20 ind./m3的密度驯养14 d 用于后续试验,养殖水温为(301),每日换水 1/3,投喂 3%鱼体质量的饵料。感受态细胞大肠杆菌(Escherichia coil)DH5 及无乳链球菌(Streptococcus agalctiae)ZQ0910 菌种由广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室提供。RNA 提取试 剂 盒(Trans Zol Up Plus RNA Kit)、qRT-PCR 试 剂 盒(PerfectStart II Probe qPCR SuperMix)均购自北京全式金公司;cDNA合成试剂盒(Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser)、pMD19-T 载体均购自 TaKaRa 大连公司;DNA 纯化试剂盒(Gene JET Gel Extraction Kit)购自 Thermo 公司;去内毒素质粒提取试剂盒(E.Z.N.A.Endo-Free Plasmid DNA Mini Kit I)购自上海远慕生物有限公司。PCR 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.2 方法1.2.1 总 RNA 提取及 cDNA 制备 取 3 尾健康罗非鱼用 MS-222 麻醉,采集血液后,解剖并分离其肌肉、胸腺、头肾、皮肤、鳃、脾脏、脑、肝脏和肠道组织。参照 TransZol Up Plus RNA Kit 说明书提取上述血液及各组织样品的总 RNA。参照 Trans-Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 说明书消化 gDNA,并反转录为 cDNA 模板用于后续试验。1.2.2 攻毒试验及 RNA 提取 随机选取 100 尾健康罗非鱼并随机分为空白对照组和试验组,每组50 尾。试验组,每尾鱼腹腔注射 0.1 mL 无乳链球菌(1107CFU/mL,溶于灭菌 PBS 中);对照组,每尾鱼腹腔注射 0.1 mL PBS。于注射后 0、3、6、12、24、48、72、96 h 从各组随机取罗非鱼 3 尾,收集脾脏、头肾、肠道和脑 4 个组织样品,并参照上述方法提取 RNA 并制备 cDNA,将 cDNA 按1 50 的比例,用单蒸水稀释,用于后续试验。1.2.3 引物设计根据 NCBI 上公布的尼罗罗非鱼 TOX4 基因序列,利用 NCBI 在线引物设计工具(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计 TOX4 基因克隆引物、真核表达质粒构建引物和荧光定量 PCR 引物,以-actin 为内参基因18(表 1)。表 1 试验引物序列Tab.1 Primers used in present experiment引物 primer序列 sequence(5-3)用途 purposeTOX4F:ATGGATCTGAATTTTTACTCGGATTR:CTATGTTACCGTGGTGGAGTTCTGT基因克隆TOX4-pEGFP-C1F:AAATATGCGGCCGCATGGATCTG-AATTTTTACTCGGATTR:CCGCTCGAGTGTTACCGTGGTGG-AGTTCTGT构建真核表达质粒q-TOX4F:GCTGGAGCACCTGACTCTTR:CCAATGGGATGACCGAGAqPCR-actinF:AACAACCACACACCACACATTTCR:TGTCTCCTTCATCGTTCCAGTTTqPCR1.2.4 TOX4 基因的克隆及序列分析 以罗非鱼头肾 cDNA 为模板,使用扩增引物 TOX4-F 和 TOX4-R,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增 TOX4 基因ORF 序列。PCR 产物经凝胶电泳检测、切胶回收,连接至 pMD 19-T 载体并转化至 DH5 感受态细胞后,菌落经 PCR 验证,将阳性克隆送至公司测序。78第 1 期 江栢坚,等:尼罗罗非鱼高迁移率族蛋白 4(TOX4)基因克隆及其在细菌感染过程中的表达特征采用 ExPASy Proteomics Server 软件(http:/ca.expasy.org)分析推导的 TOX4 蛋白的分子量及等电点;采用 TMHMM Server 2.0 软件(http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)预测蛋白的跨膜结构域;采用 SMART(http:/smart.embl-hedel-berg.de/)预测蛋白的功能结构域;采用 Softberry(http:/ Euk-mPLoc 2.0 软件(http:/ SOPMA(https:/npsa-pra-bi.ibcp.fr/cgibin/npsa _ automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测蛋白的二级结构,通过 SWISS-MODEL(http:/www.expasy.org/)预测蛋白的三维结构;采用 DNAMAN 软件进行多重序列比对;通过 MEGA 6.0 软件,采用邻接法(Neighbor-Join-ing)构建系统进化树(bootstrap=1 000)。1.2.5 TOX4 蛋白在 293T 细胞中的亚细胞定位使用带酶切位点引物 TOX4-pEGFP-C1-F 和 TOX4-pEGFP-C1-R,以及“1.2.2 节”中稀释好的 cDNA为模板进行 PCR 扩增。PCR 产物经切胶回收后,使用相同的限制性核酸内切酶,对回收产物和 pEGFP-C1 进行双酶切。将酶切产物纯化后,采用 T4 连接酶对目的片段和载体进行连接,然后转入 DH5 感受态细胞中,涂布于含卡那霉素(Kana+)的 LB 琼脂平板上,在 37 恒温培养箱中培养 1012 h。挑选单菌落置于含 Kana+的 LB 液体培养基中,于 37 下以 130 r/min 振荡培养 34 h。用通用引物 pEGFP-C-5和 pEGFP-C-3进行菌落 PCR 鉴定,将阳性克隆菌液送至生工生物工程(广州)股份有限公司进行测序。选取测序正确的菌液进行去内毒素质粒的提取,用于后续的细胞转染试验。将 293T 细胞接种于 12 孔细胞培养板内,当细胞密度增殖到 85%90%时,根据 Lip3000 使用说明书,将构建好的质粒 TOX4-pEGFP-C1 和空载pEGFP-C1 转染至细胞内。在 12 孔板中放入经灭菌处理的 12 孔细胞爬片,转染 24 h 后对细胞进行消化处理,加入 10%(体积分数)的胎牛血清、1%(体积分数)的青霉素与链霉素混合液及M199 培养基培养5 h,使细胞附着于细胞爬片,并设置 3 个复孔。然后用体积分数为 4%的多聚甲醛固定细胞,固定 40 min 后吸取固定液,并用 PBS洗涤,取出细胞爬片用含有 DAPI 的封片剂封片,于正置荧光显微镜下观察拍照19。1.2.6 TOX4 基因的组织表达模式(qRT-PCR)以-actin 为内参基因,用 QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR Systems(Thermo Fisher Scientific,Waltham,USA)检测 TOX4 基因在尼罗罗非鱼各个健康组织,以及无乳链球菌感染过程中不同时间点的表达量,并用 2-Ct法计算基因的相对表达量。所有试验均设置 3 个生物学重复和 3 个技术重复。1.2.7 TOX4 基因在头肾淋巴细胞亚群中的表达量分析 本实验室前期对罗非鱼头肾源白细胞进行了单细胞转录组测序分析,相关成果已经发表20。依据测序结果和特定细胞的标志分子,将主要白细胞分为 4 大类,分别为 B 细胞、T 细胞、巨噬细胞(macrophage,M)和 非 特 异 性 细 胞 毒 性 细 胞(nonspecific cytotoxic cell,NCC),通过对原始数据在线分析,对 TOX4 基因在尼罗罗非鱼不同类群细胞中的表达量进行了初步研究。根据单细胞转录组测序结果,用不同亚群总的表达量除以不同亚群总的细胞数,得出在每个细胞中表达量的平均值,把最小的表达量设为 1,本试验中以 B 细胞为基值,将数据归一化处理。1.3 数据处理试验结果以平均值标准差(meanS.D.)表示,采用 SPSS 21 软件进行单因素方差分析,用 T检验进行组间多重比较,显著性水平设为 0.05。2 结果与分析2.1 尼罗罗非鱼 TOX4 基因克隆及其序列分析尼罗罗非鱼 TOX4 基因的 ORF 为 2 004 bp,编码 667 个氨基酸。经 ExPASy 预测,该基因编码的蛋白相对分子质量为 69 060,理论等电点为 4.69,有 70 个带负电荷的氨基酸残基(Asp+Glu)和41 个带正电荷的氨基酸残基(Arg+Lys),脂肪指数为 69.91,总平均亲水性为-0.351,属于亲水蛋白,不稳定系数为 59.38,归类为不稳定蛋白。经Euk-mPLoc 2.0 预测,该蛋白为细胞核蛋白。采用Softberry 预测发现,TOX4 蛋白有 N-糖基化位点2 个,蛋白激酶 C 磷酸化位点 4 个,酪蛋白激酶磷酸化位点 10 个,酪氨酸激酶磷酸化位点 1 个,N-肉豆蔻酰基化位点 19 个,酰胺化位点 3 个,异戊二烯基结合位点 1 个,微体 C 端靶向信号 4 个(图 1)。SMART 在线软件预测发现,尼罗罗非鱼88大连海洋大学学报 第 38 卷【】【】N-糖基化位点;蛋白激酶 C 磷酸化位点;酪蛋白激酶磷酸化位点;酪氨酸激酶磷酸化位点;()()N-肉豆蔻酰基化位点;酰胺化位点;异戊二烯基结合位点;微体 C 端靶向信号;加粗部分为保守结构域;终止密码子。【】【】N-glycosylation site;protein kinase C phosphorylation site;casein kinase phosphorylation site;tyrosine kinase phos-phorylation site;()()N-myristoylation site;amidation site;prenyl group binding site(CAAX box);microbodies C-terminal targeting signal;bold parts are conserved domains;stop codon.图 1 尼罗罗非鱼 TOX4 氨基酸序列和功能位点分析Fig.1 Amino acid sequence and functional site of TOX4 in Oreochromis niloticusTOX4 蛋白在第 300 位到第 370 位含有一个 HMG保守结构域(图 2)。图 2 尼罗罗非鱼 TOX4 蛋白的保守结构域预测Fig.2Prediction of the conserved domain of TOX4 protein in Oreochromis niloticus2.2 TOX4 蛋白的二级结构和三级结构分析采用 SOPMA 软件预测 TOX4 蛋白二级结构,发现其由 螺旋、折叠、延伸链和无规则卷曲构成,其中,130 个氨基酸呈现 螺旋结构(占肽链氨基酸总数的 19.49%),30 个氨基酸呈现 折叠结构(占肽链氨基酸总数的 4.50%),122 个氨基酸为延伸链结构(占肽链氨基酸总数的 18.29%),385 个氨基酸为无规则卷曲结构(占肽链氨基酸总数的 57.72%)(图 3)。通过 SWISS-MODEL 软件对尼 罗 罗 非 鱼 TOX4 蛋 白 进 行 同 源 建 模,以2co9.1.A 为模板,分别用尼罗罗非鱼和人类的TOX4 氨基酸序列构建蛋白的三维结构(图 4),佐证了二级结构的正确性。图 3 尼罗罗非鱼 TOX4 蛋白的二级结构预测结果Fig.3Prediction of secondary structure of TOX4 pro-tein analyzed in Oreochromis niloticus98第 1 期 江栢坚,等:尼罗罗非鱼高迁移率族蛋白 4(TOX4)基因克隆及其在细菌感染过程中的表达特征图 4 尼罗罗非鱼和人类 TOX4 蛋白的三维结构Fig.4 Three-dimensional structure of TOX4 protein in Oreochromis niloticus and Homo sapiens2.3 同源性及系统进化分析将克隆得到的尼罗罗非鱼 TOX4 氨基酸序列与智人(Homo sapiens)、家鼠(Mus musculus)、非洲蟾蜍(Xenopus tropicalis,)、斑马拟丽鱼(May-landia zebra)、斑马鱼(Danio rerio)、橙胸镖鲈(Etheostoma spectabile)和大刺鳅(Mastacembelus armatus)等 7 个物种的 TOX4 氨基酸序列进行同源性比对(图 5),结果显示,与尼罗罗非鱼 TOX4 氨基酸序列一致性最高的是斑马拟丽鱼,为 88.98%,黑色框表示保守结构域。The black box represents the conserved domain.图 5 尼罗罗非鱼与其他物种 TOX4 氨基酸的多重序列比对Fig.5 Multiple alignments of TOX4 amino acid sequence of Oreochromis niloticus with other species09大连海洋大学学报 第 38 卷其次是大刺鳅(77.55%)、橙胸镖鲈(73.06%)、斑马 鱼(53.47%)、家 鼠(37.28%)和 智 人(36.73%),一致性最低的是非洲蟾蜍(35.65%)。基于 TOX4 氨基酸序列,利用 NJ 法构建系统进化树,发现尼罗罗非鱼与斑马拟丽鱼首先聚为一支,表明两者的亲缘关系最近(图 6)。图 6 基于邻接法构建的尼罗罗非鱼 TOX4 氨基酸序列系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree of TOX4 amino acid sequences in Oreochromis niloticus by Neighbour-Joining method2.4 TOX4 蛋白的亚细胞定位分析将构建的绿色荧光标签载体 TOX4-pEGFP-C1 与空载 pEGFP-C1 分别转入 293T 细胞,经 DAPI 染色后结果如图 7 所示,pEGFP-C1 全细胞分布,TOX4-pEGFP-C1 主要分布于细胞核,与预测结果一致。A1 和 B1 分别为 pEGFP-N1、TOX4-pEGFP-C1 细胞核的 DAPI染色;A2 和 B2 分别为 pEGFP-C1、TOX4-pEGFP-C1 的绿色荧光蛋白;A3 和 B3 为细胞核与绿色荧光蛋白的叠加。A1 and B1,the nuclei of pEGFP-N1 and TOX4-pEGFP-C1 are stained by DAPI;A2 and B2,green fluorescent protein of pEGFP-C1 and TOX4-pEGFP-C1;A3 and B3,merged images with green fluorescent protein.图 7 TOX4 蛋白在 293T 细胞中的亚细胞定位Fig.7 Subcellular localization of TOX4 protein in 293T cell2.5 TOX4 基因的组织表达分布从图 8 可见,TOX4 基因在健康尼罗罗非鱼的10 个组织中均有表达,且在血液中表达量最高,其次是肝脏、肠道、脑、脾脏、鳃、皮肤、头肾和胸腺,在肌肉中表达量最低。设定肌肉中的表达量为 1。The expression level in muscle is set as 1.图 8 TOX4 基因在不同组织中的相对表达量Fig.8Relative expression levels of TOX4 gene in dif-ferent tissues2.6 TOX4 基因在头肾淋巴细胞亚群中的表达通过对本实验室前期得到的头肾淋巴细胞单细胞转录组数据20分析发现,TOX4 基因在尼罗罗非鱼头肾淋巴细胞亚群 B 细胞、T 细胞、巨噬细胞和非特异性细胞毒性细胞均有表达,其中,在B 细胞中表达量最低,在 NCC 中表达量最高(图 9)。M巨噬细胞;NCC非特异性细胞毒性细胞。设 B 细胞的表达量为 1。Mmacrophage;NCCnonspecific cytotoxic cell.The expression level in B cell is set as 1.图 9 TOX4 基因在头肾淋巴细胞亚群中的相对表达量Fig.9 Relative expression levels of TOX4 gene in lym-phocyte subsets of the head kidney2.7 无乳链球菌刺激后 TOX4 基因在尼罗罗非鱼脑、头肾、肠道和脾脏中的表达从图 10 可见:在无乳链球菌感染过程中,尼罗罗非鱼脑、头肾、肠道和脾脏组织中不同时间点TOX4 基因的表达量差异较大,在脑、头肾和肠道中,12 h 时表达量极显著上调(P0.01),之后慢慢恢复到正常水平;在脾脏组织中,3、48 h 时均极显著上调(P0.01);总体上,无乳链球菌攻毒后 TOX4 基因在尼罗罗非鱼头肾、脑、肠道和脾脏19第 1 期 江栢坚,等:尼罗罗非鱼高迁移率族蛋白 4(TOX4)基因克隆及其在细菌感染过程中的表达特征组织中呈先升后降趋势,最后恢复到正常水平变化。表示与 0 h(对照)有显著性差异(P0.05);表示与0 h(对照)有极显著性差异(P75%),但鱼类、哺乳动物及两栖类间的同源性较低,然而一些功能位点是保守的,如 HMG结构域。系统进化分析表明,尼罗罗非鱼 TOX4 与其他鱼类的 TOX4 聚为一支,表明其亲缘关系较近,而两栖类和哺乳类分别聚为另一支。亚细胞定位结果显示,尼罗罗非鱼 TOX4 蛋白存在于细胞核中,与哺乳动物人和小鼠相同13。以上结果暗示,TOX4 基因虽然在不同物种中具有序列差异,但其蛋白功能仍然具有一定保守性,均在细胞核中发挥功能。3.2 TOX4 基因的组织分布及单细胞转录组测序结果分析根据已有的报道,TOX4 基因在哺乳动物的各个组织中均有表达,且在淋巴组织中表达量较高,包括骨髓和胸腺21,其中,主要在 T 细胞和 NK细胞中表达,调控 T 细胞的分化22-23和 NK 细胞的发育12。另外,TOX4 基因还有调节糖代谢过程的功能10。本研究中,在罗非鱼组织层面,TOX4基因在血液中表达量最高,在肝脏中的表达量也比较高,在脑、肾脏和脾脏等主要免疫器官均有表达,而在肌肉中表达量最低(图 8);在细胞层面,对尼罗罗非鱼头肾白细胞单细胞转录组数据分析发现,TOX4 基因在尼罗罗非鱼 NCC 中表达量最高,其次是巨噬细胞,在 B、T 淋巴细胞亚群也有表达(图 9),这与哺乳动物相比存在一定差异。TOX4基因在尼罗罗非鱼血液和免疫器官及肝脏中的表达量较高,表明 TOX4 可能参与罗非鱼机体的免疫应答及肝脏代谢调节。在鱼类血液中存在许多先天免疫细胞包括 NCC 和巨噬细胞,而 NCC 被认为是NK 细胞进化上的前体细胞24,且在跟黏膜免疫相关的肠道中表达量也较高。这表明,TOX4 有可能参与尼罗罗非鱼 NCC 的发育,参与先天免疫的调控。有趣的是,在哺乳动物胸腺中 TOX4 基因的表达量较高,而本研究中尼罗罗非鱼胸腺中 TOX4 基因的表达量却较低,这可能是因为鱼类在性成熟过程、鱼龄增长和环境胁迫等条件下胸腺会退化25-26,B、T 淋巴细胞会迁徙到肾脏和脾脏中27,从而造成 TOX4 基因在胸腺中表达量较低而在肾脏和脾脏中表达量较高。这表明,TOX4 可能参与尼罗罗非鱼 B、T 细胞的发育调节。3.3 无乳链球菌刺激后 TOX4 基因的表达变化本研究中,在无乳链球菌刺激下,TOX4 基因在尼罗罗非鱼脑、头肾、肠道和脾脏等组织中的表达均显著上调,脑、头肾和肠道中的表达量在12 h达到最高峰,脾脏中的表达量在 48 h 达到最高峰。而无乳链球菌可通过血-脑屏障感染脑组织,头肾和脾脏是硬骨鱼类重要的免疫器官和组织27,肠道主要跟黏膜免疫相关。在这 4 个不同组织中,经无乳链球菌刺激后,尼罗罗非鱼 TOX4 基因的表达均呈现时间依赖性上调,这暗示 TOX4 基因在这4 个组织中发挥相似的功能,并参与罗非鱼机体的免疫调控,推测在免疫应答过程中需要 TOX4 的参29大连海洋大学学报 第 38 卷与来增加免疫相关因子的表达。在罗非鱼的其他HMG 蛋白如 HMGB12及 HMG20A28中也出现相似的结果,这些均表明,TOX4 参与了罗非鱼机体的抗细菌免疫反应。值得注意的是,TOX4 基因表达量在尼罗罗非鱼脾脏组织中 3 h 时显著上调,在 48 h 时才达到峰值,晚于其他组织的达峰时间,可能是因为无乳链球菌引起的免疫反应在不同器官中的应答时间和持续时间不同,但具体的调控机制还有待进一步研究。4 结论1)本研究中,克隆并鉴定了尼罗罗非鱼TOX4 基因,其生物信息分析和亚细胞定位分析结果表明,尼罗罗非鱼 TOX4 蛋白与其他物种的TOX4 蛋白具有相似的结构特征和功能特征。2)TOX4 基因广泛分布于尼罗罗非鱼的不同组织中,其中,血液中的含量最高。单细胞转录组测序结果表明,TOX4 基因主要在尼罗罗非鱼非特异性细胞毒性细胞中高表达,其次是巨噬细胞、T细胞和 B 细胞。这表明,尼罗罗非鱼 TOX4 在先天免疫应答中起作用,并参与 B、T 细胞的发育调节。3)经无乳链球菌刺激后,尼罗罗非鱼组织中TOX4 基因呈时间依赖性上调,这表明 TOX4 参与了尼罗罗非鱼抵抗无乳链球菌感染的免疫应答。参考文献:1TESSEMA M,YINGLING C M,GRIMES M J,et al.Differential epigenetic regulation of TOX subfamily high mobility group box genes in lung and breast cancersJ.PLoS One,2012,7(4):e34850.2 NIU J Z,WU F L,HUANG Y,et al.Identification and character-ization of high-mobility group box 1(HMGB1)from Nile tilapia(Oreochromis niloticus)J.Aquaculture Reports,2021,19:100573.3 OFLAHERTY E,KAYE J.TOX defines a conserved subfamily of HMG-box proteinsJ.BMC Genomics,2003,4(1):13.4 SOULLIER S,JAY P,POULAT F,et al.Diversification pattern of the HMG and SOX family members during evolutionJ.Journal of Molecular Evolution,1999,48(5):517-527.5 THOMAS J O,TRAVERS A A.HMG 1 and 2,and related archi-tectural DNA-binding proteinsJ.Trends in Biochemical Sci-ences,2001,26(3):167-174.6 BEWLEY C A,GRONENBORN A M,CLORE G 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