生物化学实验省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

生物化学试验生物化学试验Biochemical Experiment第1页试验基本知识试验基本知识 第2页第3页第4页第5页第6页第7页容容 量量 瓶瓶第8页液体量取液体量取第9页第10页液体倾倒液体倾倒第11页滴管使用滴管使用第12页试纸使用试纸使用第13页第14页第15页第16页一定质量分数溶液配制一定质量分数溶液配制第17页滤纸折叠滤纸折叠第18页物质分离与提纯过滤物质分离与提纯过滤第19页萃取与分液萃取与分液第20页试验内容安排试验内容安排共共3636课时课时1 1、绪论生物化学试验规则及惯用仪器使用入门（、绪论生物化学试验规则及惯用仪器使用入门（2 2课时）课时）2 2、试验一、试验一 纸层析分离判定氨基酸纸层析分离判定氨基酸（6 6课时）课时）3 3、试验二、试验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳（4 4课时）课时）4 4、试验三、试验三 蛋白质颜色反应蛋白质颜色反应（2 2课时）课时）5 5、试验四、试验四 蛋白质沉淀、变性反应蛋白质沉淀、变性反应（3 3课时）课时）6 6、试验五、试验五 凝胶过滤法除蛋白质中离子凝胶过滤法除蛋白质中离子（4 4课时）课时）第21页7 7、试验六、试验六 酵母酵母RNARNA提取和判定提取和判定(4(4课时课时)8 8、试验七、试验七 血糖含量测定血糖含量测定（4 4课时）课时）9 9、试验八、试验八 脂肪酸脂肪酸-氧化氧化 （5 5课时）课时）1010、试验汇报讲解及考评、试验汇报讲解及考评 （2 2课时）课时）第22页1试验目标试验目标l掌握蛋白质、酶、核酸、糖等主要物质分离、掌握蛋白质、酶、核酸、糖等主要物质分离、纯化和测定技术原理及方法；纯化和测定技术原理及方法；l掌握生物化学基本知识、基本理论及基本试验掌握生物化学基本知识、基本理论及基本试验技能技能；l培养分析和处理问题能力以及严谨细致科学作培养分析和处理问题能力以及严谨细致科学作风、创新能力等综合素质。风、创新能力等综合素质。绪论绪论第23页2 经过生物化学试验应该做到经过生物化学试验应该做到l学习设计一个试验基本思绪，掌握各个试验基学习设计一个试验基本思绪，掌握各个试验基本原理，学会严密地组织自己试验，合理地安本原理，学会严密地组织自己试验，合理地安排试验步骤和时间。排试验步骤和时间。l训练试验动手能力，学会熟练地使用各种生物训练试验动手能力，学会熟练地使用各种生物化学试验仪器。化学试验仪器。l学会准确翔实地统计试验现象和数据技能，提学会准确翔实地统计试验现象和数据技能，提升试验汇报写作能力，能够整齐清洁地进行全升试验汇报写作能力，能够整齐清洁地进行全部试验。部试验。l掌握生物化学各种基本试验方法和试验技术，掌握生物化学各种基本试验方法和试验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加，为今后参加科研工作打下坚实基础。科研工作打下坚实基础。第24页3.1 3.1 试验统计试验统计l试验前写好试验预习汇报试验前写好试验预习汇报(钢笔和园珠笔钢笔和园珠笔)。l试验中应及时准确地统计试验中应及时准确地统计(专用纸，事先在统计纸上专用纸，事先在统计纸上设计好各种统计格式和表格）所观察到现象和测量数设计好各种统计格式和表格）所观察到现象和测量数据。据。l试验统计要注意有效数字，试验统计要注意有效数字，如吸光度值应为如吸光度值应为“0.050”“0.050”，而不能记成，而不能记成“0.05”“0.05”。每个结果都要尽。每个结果都要尽可能重复观察二次以上，即使观察数据相同或偏差很可能重复观察二次以上，即使观察数据相同或偏差很大，也都应如实统计，不得涂改。大，也都应如实统计，不得涂改。l试验中要详细统计试验条件，如使用仪器型号、编试验中要详细统计试验条件，如使用仪器型号、编号、生产厂等；生物材料起源、试剂规格、试剂浓度号、生产厂等；生物材料起源、试剂规格、试剂浓度等。等。3 3 试验统计与试验汇报试验统计与试验汇报第25页3 3 试验统计与试验汇报试验统计与试验汇报3.2 3.2 试验汇报试验汇报试验汇报格式应为：试验汇报格式应为：试验目标；试验目标；试验原理；试验原理；仪器、材料和试剂；仪器、材料和试剂；试验步骤；试验步骤；结果讨论（含数理据处）；结果讨论（含数理据处）；注意事项注意事项;(7)(7)思索题思索题 注意：试验结果讨论要充分，尽可能多查阅一些相关注意：试验结果讨论要充分，尽可能多查阅一些相关文件和教科书，充分利用己学过知识和生物化学原理，文件和教科书，充分利用己学过知识和生物化学原理，进行深入探讨，勇于提出自己独到分析和看法，并欢进行深入探讨，勇于提出自己独到分析和看法，并欢迎对试验提出改进意见。迎对试验提出改进意见。第26页4 试验成绩评分方法试验成绩评分方法n试验预习情况（试验预习情况（10%10%）n试验操作情况（试验操作情况（20%20%）n试验汇报情况（试验汇报情况（70%70%）第27页生物化学试验技术理论生物化学试验技术理论层析技术第28页l19，俄国科学家M.C.Jber首创了一个从绿叶中分离各种不一样颜色色素成份方法，命名为色谱法(Chromatography)，因为翻译和习惯原因又常称为层析法。l80多年来，层析法不停发展，形式各种多样。50年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。l几乎每一个层析法都已发展成为一门独立生化高技术，在生化领域内得到了广泛应用。一、层析技术一、层析技术第29页一、层析技术一、层析技术l1、层析技术原理l2、层析技术分类l3、惯用层析技术原理第30页1、层析技术原理、层析技术原理l层析原理：是一个物理分离方法，利用混合物中各组分物理化学性质差异，使各组分以不一样程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相当作流动相，并使各组分以不一样速度移动，从而到达分离目标。l可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。第31页2、层析技术分类、层析技术分类名称名称操作方式操作方式固定相固定相流动相流动相分离依据分离依据分配层析分配层析纸层析纸层析薄层层析薄层层析液体液体液体液体溶解度溶解度离子交换层析离子交换层析离子交换柱层析离子交换柱层析固体固体液体液体带电性带电性静电引力静电引力吸附层析吸附层析吸附薄层层析吸附薄层层析气体吸附层析气体吸附层析固体固体固体固体液体液体气体气体吸附力吸附力亲合层析亲合层析酶与底物酶与底物抗原与抗体抗原与抗体固体固体液体液体配体专一性配体专一性凝胶层析凝胶层析 凝胶过滤凝胶过滤固体固体液体液体分子大小分子大小第32页3、惯用层析原理、惯用层析原理l（1）分配层析纸层析l原理：溶质在互不相溶两相中溶解度不一样，在终点时到达一个平衡，其比值为一个常数，即分配系数（）。l 固定相内溶质浓度 流动相内溶质浓度 固定相：滤纸上吸附水 流动相：有机溶剂（正丁醇）=第33页128646432643216484816 8324832 8 4204040 20 4 2123040 30 12 2第34页纸层析纸层析l纸层析是最简单液一液相分配层析。l滤纸是纸层析支持物。当支持物被水饱和时，大部分水分子被滤纸纤维素牢牢吸附，所以，纸及其饱和水为层析固定相，与固定相不相混溶有机溶剂为层析流动相。l对一些特定化合物，在特定展层系统，一定温度条件下，Rf是个常数。第35页（2）离子交换层析）离子交换层析l原理：将能与周围介质进行离子交换不稳定离子固定于惰性基质上，从而分离介质中组分。l惯用惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯）l阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基l阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 l可交换离子：阳离子：Na+、H+阴离子：Cl-、OH-第36页示意图（交换树脂表面）示意图（交换树脂表面）第37页示意图（离子交换过程）示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子）交换离子不交换离子第38页示意图示意图水分子B物质A物质第39页（3）吸附层析）吸附层析l原理：当气体或液体中某组分分子在运动中碰到一个固体表面时，原理：当气体或液体中某组分分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现象。象。l吸附现象形成原因：吸附现象形成原因：吸附作用可能由几个作用力形成，包含被吸吸附作用可能由几个作用力形成，包含被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间静电引力附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间静电引力(形成离子键形成离子键)、氢键及范德华引力等。、氢键及范德华引力等。l在不一样条件在不一样条件 下，占主要地位作用力可能不一样，也可能几个力下，占主要地位作用力可能不一样，也可能几个力同时起作用同时起作用l吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。陶土、粘土。第40页吸附层析示意图吸附层析示意图 吸附剂易吸附分子不易吸附分子第41页（4）亲和层析）亲和层析l原理：利用分子间含有专一亲和力而设计层析技利用分子间含有专一亲和力而设计层析技术。术。l专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与酶与底物、特异性抗原与抗体、抗体、DNA和和RNA、激素和其受体、激素和其受体l载体：使亲和物固相化水不溶性化合物。如：纤使亲和物固相化水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。乙烯、多孔玻璃。第42页第43页（5）凝胶过滤凝胶过滤l原理：被分离物质因分子大小不一样，在凝胶中向下移动被分离物质因分子大小不一样，在凝胶中向下移动速度不一样。速度不一样。l物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，所以向下移动慢。所以向下移动慢。l凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。胺凝胶、葡聚糖凝胶。第44页第45页电 泳 技 术一一.电泳概念电泳概念二二.电泳技术分类电泳技术分类三三.电泳技术基本原理电泳技术基本原理四四.几个常见电泳方法比较几个常见电泳方法比较五五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理第46页一.电泳概念l带电质点在电场中移动现象带电质点在电场中移动现象。第47页二.电泳技术分类第48页三.电泳技术基本原理1.基本原理基本原理 不一样带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所不一样带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状相关。带净电荷量，分子量及分子形状相关。pH pI 分子带负电荷分子带负电荷,在电场中向正极移动在电场中向正极移动;pH 蛋蛋 GlyGlylm mcl cl cl clmm蛋蛋 蛋蛋m m GlyGly GlyGlyl凝胶中凝胶中ClCl为快离子，为快离子，Gly Gly为慢离子，为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。蛋白质样品被夹在中间。缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶第58页缓冲液成份及pH不连续性造成蛋白质样品浓缩效应示意图l快离子l慢离子l蛋白质样品 第59页lE：每厘米电压降每厘米电压降 E EI(I(电流强度电流强度)/)/(电导率电导率)lE E与电泳速度成正比与电泳速度成正比l电泳开始后，因为快离子泳动电泳开始后，因为快离子泳动率最大，在快离子后面形成一率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低低电导区，产生个离子浓度低低电导区，产生较高电位梯度，使蛋白质和慢较高电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品被离子加速移动，蛋白质样品被深入浓缩。深入浓缩。电位梯度不连续性第60页lE：每厘米电压降每厘米电压降 E EI(I(电流强度电流强度)/)/(电导率电导率)lE E与电泳速度成正比与电泳速度成正比l电泳开始后，因为快离子泳动电泳开始后，因为快离子泳动率最大，在快离子后面形成一率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低低电导区，产生个离子浓度低低电导区，产生较高电位梯度，使蛋白质和慢较高电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品被离子加速移动，蛋白质样品被深入浓缩。深入浓缩。电位梯度不连续性第61页A.样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含理包含：l缓冲液成份及缓冲液成份及pHpH不连续性不连续性l电位梯度不连续性电位梯度不连续性 缓冲液缓冲液浓缩胶浓缩胶样品样品分离胶分离胶第62页A.样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含理包含：l凝胶层不连续性：凝胶层不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶第63页A.样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含理包含：l凝胶层不连续性：凝胶层不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶第64页A.样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含理包含：l凝胶层不连续性：凝胶层不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶第65页A.样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包含理包含：l凝胶层不连续性：凝胶层不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶第66页B.电荷效应l蛋白质样品进入分离胶后蛋白质样品进入分离胶后 pHpH增大增大(pH 8.9)(pH 8.9)，GlyGly解离度增解离度增大，不存在快、慢离子之分，大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和蛋白质样品在均一电场强度和pHpH条件下泳动。条件下泳动。l因为各种蛋白质因为各种蛋白质pI不一样，所载不一样，所载有效电荷不一样，所以质点有效电荷不一样，所以质点 有有效迁移率不一样，形成不一样效迁移率不一样，形成不一样区带。区带。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶第67页C.分子筛效应l分离胶孔径小，各分子因分离胶孔径小，各分子因为大小和形状不一样，所为大小和形状不一样，所受阻力不一样，表现出不受阻力不一样，表现出不一样一样 泳动速度，即分子筛泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为作用。分子量小，形状为球形泳动速度最快。球形泳动速度最快。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶第68页试验一试验一 氨基酸分离与判定氨基酸分离与判定 滤纸层析法滤纸层析法第69页一、实验目一、实验目1.1.经经过过氨氨基基酸酸分分离离，学学习习纸纸层层析析法法基基本本原原理理及及操操作作方法方法2.2.掌掌握握氨氨基基酸酸纸纸上上层层层层析析法法操操作作技技术术（点点样样、平平衡衡、展层、显色、判定）展层、显色、判定）.第70页二、试验原理1.1.是是分分配配层层析析一一个个。在在纸纸上上水水被被吸吸附附在在纤纤维维素素纤纤维维之之间间形形成成固固定定相相。当当有有机机相相沿沿纸纸流流动动经经过过层层析析点点时时，层层析析点点上上溶溶质质就就在在水水相相和和有有机机相相之之间间进进行行分分配配，溶溶质质中中各各组组分分分分配配系系数数不不一一样样，移移动动速速率率也也不不一一样样，因而能够彼此分开。因而能够彼此分开。2.2.氨基酸与茚三酮显色反应。氨基酸与茚三酮显色反应。3.3.物物质质被被分分离离后后在在纸纸层层析析图图谱谱上上位位置置是是用用R Rf f值值来来表表示示。在在一一定定条条件件下下某种物质某种物质R Rf f值是常数。值是常数。R Rf f 原点到溶剂前沿距离原点到溶剂前沿距离原点到层析点中心距离原点到层析点中心距离第71页4 4.R Rf f值值大大小小与与物物质质结结构构、性性质质、溶溶剂剂系系统统、P PH H层层析析滤滤纸纸质质量量和和层层析温度等原因相关。析温度等原因相关。5.5.上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。第72页三、仪器、材料和试剂试验仪器试验仪器1 1层析缸、培养皿、小烧杯、长颈漏斗层析缸、培养皿、小烧杯、长颈漏斗2 2毛细管、吹风机、电热鼓风干燥箱毛细管、吹风机、电热鼓风干燥箱3 3层析滤纸、手套层析滤纸、手套、透明胶带或针线、透明胶带或针线试验材料和试剂试验材料和试剂1 1氨氨基基酸酸溶溶液液分分别别配配制制0.5%Lys0.5%Lys、AluAlu、IleIle、MetMet溶溶液液及及它它们们混混合合液（各组份浓度均为液（各组份浓度均为0.5%0.5%）。）。2 2显色剂显色剂0.1%0.1%水合茚三酮丙酮溶液。水合茚三酮丙酮溶液。3 3扩展剂（展层剂）扩展剂（展层剂）酸酸溶溶剂剂系系统统：正正丁丁醇醇:80%:80%甲甲酸酸:水水15:3:215:3:2（体体积积比比），平平衡衡溶溶剂剂与扩展剂相同。每组配制与扩展剂相同。每组配制30ml30ml碱碱溶溶剂剂系系统统：正正丁丁醇醇:12%:12%氨氨水水:95%:95%乙乙醇醇13:3:313:3:3（体体积积比比），平平衡溶剂为衡溶剂为12%12%氨水。氨水。第73页四、操作步骤与方法 溶剂前沿层析点原点溶剂前沿亮苯丙缬脯赖第74页l1 1将盛有扩展剂将盛有扩展剂10ml10ml小烧杯和培养皿置于密闭层析缸中。小烧杯和培养皿置于密闭层析缸中。l2 2戴手套取层析滤纸一张作标识。戴手套取层析滤纸一张作标识。l3 3。点点样样：干干后后重重复复点点一一次次，直直径径最最大大不不超超出出3mm3mm。缝缝成成筒筒状状，两两边边不不能能接触。点样面朝外，点样端朝下，盖上层析缸盖，平衡约接触。点样面朝外，点样端朝下，盖上层析缸盖，平衡约2020 3030分钟。分钟。l4.4.展展层层用用长长颈颈漏漏斗斗，扩扩展展剂剂液液面面需需低低于于点点样样线线1cm1cm。上上沿沿约约1 1厘厘米米时时，取出滤纸，用铅笔标出溶剂前沿界限，干燥。取出滤纸，用铅笔标出溶剂前沿界限，干燥。l5 5显显色色用用0.1%0.1%茚茚三三酮酮丙丙酮酮溶溶液液均均匀匀浸浸透透，烘烘箱箱（6565）5 5分分钟钟或或用用热热风风吹吹干干。脯脯氨氨酸酸、羟羟脯脯氨氨酸酸产产生生黄黄色色物物质质外外，全全部部氨氨基基酸酸及及一一切切蛋蛋白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。第75页五、试验结果与讨论第76页六、注意事项1 1切勿用手直接接触滤纸和显色剂。切勿用手直接接触滤纸和显色剂。2.2.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。3 3使用溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。使用溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。第77页七、思索题：七、思索题：l1做好本试验关键是什么？l2试验操作过程，为何不能用手接触滤纸？l3影响Rf值原因有哪些？第78页试验二试验二血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 第79页l试验原理l试验材料与仪器l试验试剂l试验步骤第80页试验原理试验原理 醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物一个 区带电泳技术。醋酸纤维素薄膜是纤维素羟基乙酰化形成纤维素醋酸 酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮，氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂 抹成均匀薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜含有均一泡沫状结构，渗 透性强，对分子移动阻力小，厚度为120m。本试验以醋酸纤维素薄膜为电泳支持物，分离人血清蛋白。血清蛋白中含有清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质因为氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不一样，在电场中迁移速度不一样。分子量小、等电点低，在相同碱性PH缓冲体系中，带负电荷多蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。比如人血清蛋白在 PH8.6缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其 余依次是球蛋白。第81页试验材料与仪器试验材料与仪器（一）、材料：人血清（二）、仪器 醋酸纤维薄膜(8X2mm)；点样器；染色皿，漂洗器，镊子；玻璃板；常压电泳仪；直流电源整流器；水平电泳 槽；粗滤纸；直尺和铅笔第82页试验试剂试验试剂 巴比妥缓冲液(pH8.6 I=0.06)；氨基黑10B染色液；漂洗液；95乙醇45ml、冰醋酸5ml；蒸馏水50ml；洗脱液 0.4molLNaOH；透明液；无水乙醇；冰醋酸7：3第83页试验步骤试验步骤1浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜放在缓冲液中浸泡20分 钟。2点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干 多出液体，然后铺在玻璃板上(无光泽面朝 上)，将点样器在血清中沾一下（量薄薄一层为 好），再在膜条一端2-3厘米处轻轻水平地落下 并随时提起，这么即在膜条上点上了细条状血 清样品。第84页3电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内液面 等高，将膜条平悬于电泳槽支架滤纸桥上。膜 条点样一端放在负极上。通电，电流强度每条 膜1mA(注意强度),电泳时间约为50分钟。4染色：电泳完成后将膜条取下并放在染色液中浸泡5分 钟。5漂洗：将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液申漂洗数 次至无蛋白区底色脱净为止，可得到色带清楚 电泳图谱。6透明：将脱色后干燥电泳图谱膜条放入透明液中浸泡 23分钟后取出平铺在玻璃板上,用一直径0.5cm 玻璃棒将其间气泡赶出,二者之间不能有泡。干燥后此透明薄膜,区带着色清楚,可用于光吸收扫 描,长久保留不褪色。第85页思索题：思索题：l.为何将薄膜点样端放在滤纸桥负极端？l.用乙酸纤维素薄膜作为电泳支持物有何优点？第86页试验三 蛋白质性质试验蛋白质及氨基酸呈色反应 第87页一、实验目一、实验目l（1）了解蛋白质和一些氨基酸呈色反应原）了解蛋白质和一些氨基酸呈色反应原理。理。l（2）学习几个惯用判定蛋白质和氨基酸方）学习几个惯用判定蛋白质和氨基酸方法。法。第88页二、试验原理l双缩脲反应双缩脲反应l尿素加热至尿素加热至180左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相同，称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相同，也能发生此反应。可用于蛋白质定性或定量测定。也能发生此反应。可用于蛋白质定性或定量测定。l双缩脲反应不但为含有两个以上肽键物质全部。含有一个双缩脲反应不但为含有两个以上肽键物质全部。含有一个肽键和一个肽键和一个CSNH2，CH2NH2，CRHNH2，CH2NH2CHNH2CH2OH或或CHOHCH2NH2等基团物等基团物质也有此反应。质也有此反应。NH3干扰此反应，因为干扰此反应，因为NH3与与Cu2+可生成暗可生成暗蓝色络离子蓝色络离子Cu（NH3）42+。所以，一切蛋白质或二肽以上多。所以，一切蛋白质或二肽以上多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应物质不一定都是蛋白质或肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应物质不一定都是蛋白质或多肽。多肽。第89页茚三酮反应l除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，全除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，全部部氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏，质。该反应十分灵敏，1 1 500 000浓度氨基酸水溶液即能给浓度氨基酸水溶液即能给出反应，是一个惯用氨基酸定量测定方法。出反应，是一个惯用氨基酸定量测定方法。l茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有形成还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。色物质。l此反应适宜此反应适宜pH为为57，同一浓度蛋白质或氨基酸在不一，同一浓度蛋白质或氨基酸在不一样样pH条件下颜色深浅不一样，酸度过大时甚至不显色。条件下颜色深浅不一样，酸度过大时甚至不显色。第90页黄色反应l含有苯环结构氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中深入形成橙黄色硝醌酸钠。l多数蛋白质分子含有带苯环氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少许浓硫酸才有黄色反应。第91页乙醛酸反应l在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生成紫色物质，反应机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相同物质。含有色氨酸蛋白质也有此反应。第92页三、仪器、材料和试剂试验仪器试验仪器试管；试管架；漏斗；铁架台；滴管；试剂瓶；试管；试管架；漏斗；铁架台；滴管；试剂瓶；水浴锅。水浴锅。试验材料和试剂试验材料和试剂尿尿素素；10%氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液；1%硫硫酸酸铜铜溶溶液液；2%卵卵清清蛋蛋白白溶溶液液；0.5%甘甘氨氨酸酸溶溶液液；0.1%茚茚三三酮酮水水溶溶液液；大大豆豆提提取取液液；头头发发；指指甲甲；0.5%苯苯酚酚溶溶液液；浓浓硝硝酸酸；0.3%色色氨氨酸酸溶溶液；液；0.3%酪氨酸溶液；冰醋酸、浓硫酸。酪氨酸溶液；冰醋酸、浓硫酸。第93页四、操作步骤与方法 取少许尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿取少许尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化尿素开始硬化时，停顿加热，尿素放出氨，形素熔化。熔化尿素开始硬化时，停顿加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加成双缩脲。冷后，加10%10%氢氧化钠溶液约氢氧化钠溶液约1ml1ml，振荡混匀，再，振荡混匀，再加加1%1%硫酸铜溶液硫酸铜溶液1 1滴，再振荡。观察出现粉红颜色。要防止滴，再振荡。观察出现粉红颜色。要防止添加过量硫酸铜，不然，生成蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。添加过量硫酸铜，不然，生成蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。向另一试管加卵清蛋白溶液约向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml1ml和和10%10%氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液2ml2ml，摇匀，再加摇匀，再加1%1%硫酸铜溶液硫酸铜溶液2 2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色出滴，随加随摇。观察紫玫瑰色出现。现。双缩脲反应试验操作双缩脲反应试验操作第94页茚三酮反应试验操作l取取2 2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液液1ml1ml，再各加，再各加0.5ml0.1%0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热在沸水浴中加热1212分钟，观察颜色由粉色变分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。紫红色再变蓝。l在一小块滤纸上滴一滴在一小块滤纸上滴一滴0.5%0.5%甘氨酸溶液，风甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴干后，再在原处滴一滴0.1%0.1%茚三酮乙醇溶液，茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点出现。在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点出现。第95页黄色反应试验操作l向向7 7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现现象，有试管反应慢可略放置或用微火加热。现现象，有试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%10%氢氧氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色改变。化钠溶液至碱性，观察颜色改变。管 号1234567材 料（滴）鸡蛋清溶液4大豆提取液4指甲少许头发少许0.5%苯酚40.3%色氨酸40.3%酪氨酸4浓硝酸/（滴）244040444现象第96页乙醛酸反应试验操作乙醛酸反应试验操作l 取取3 3支试管。编号。分别按上表加入蛋白质溶支试管。编号。分别按上表加入蛋白质溶液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸2 2毫升，毫升，混匀后倾斜试管，沿管壁分别缓缓加入浓硫酸约混匀后倾斜试管，沿管壁分别缓缓加入浓硫酸约1 1毫升，静置。观察各管液面间紫色环出现。若不显毫升，静置。观察各管液面间紫色环出现。若不显著，可于水浴中微热。著，可于水浴中微热。试剂管号水滴0.03%色氨酸溶液（滴）蛋白质溶液（滴）冰醋酸（ml）浓硫酸（ml）现 象1-521241-2135-21第97页五、思索题：五、思索题：l1.1.茚三酮反应阳性结果是否经常是同一色调？茚三酮反应阳性结果是否经常是同一色调？并说明原因。并说明原因。l2.2.你能区分蛋白质茚三酮反应及其它氨基化合你能区分蛋白质茚三酮反应及其它氨基化合物茚三酮反应结果吗？试解释之。物茚三酮反应结果吗？试解释之。l3.3.能否利用茚三酮反应可靠地判定蛋白质存在能否利用茚三酮反应可靠地判定蛋白质存在？l4.4.哪些芳香基因（蛋白质中、非蛋白质中）能哪些芳香基因（蛋白质中、非蛋白质中）能够与浓硝酸作用展现黄色反应阳性结果？够与浓硝酸作用展现黄色反应阳性结果？第98页试验四 蛋白质变性、沉淀反应蛋白质变性、沉淀反应 第99页一、实验目一、实验目l（1）加深对蛋白质胶体溶液稳定原因认识。）加深对蛋白质胶体溶液稳定原因认识。l（2）了解沉淀蛋白质几个方法及其实用意）了解沉淀蛋白质几个方法及其实用意义。义。l（3）了解蛋白质变性与沉淀关系。）了解蛋白质变性与沉淀关系。第100页二、试验原理l 在水溶液中蛋白质分子因为表面生成水化层在水溶液中蛋白质分子因为表面生成水化层和双电层而成为稳定亲水胶体颗粒，在一定理化和双电层而成为稳定亲水胶体颗粒，在一定理化原因影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而原因影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质沉淀反应可分为两类。沉淀。蛋白质沉淀反应可分为两类。l（1 1）可逆沉淀反应）可逆沉淀反应 此时蛋白质分子结构还未发此时蛋白质分子结构还未发生显著改变，除去引发沉淀原因后，蛋白质沉淀生显著改变，除去引发沉淀原因后，蛋白质沉淀仍能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不仍能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质盐析作用或在低温下用乙变性。如大多数蛋白质盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用这类反应。时，常利用这类反应。第101页l（2 2）不可逆沉淀反应）不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引发蛋白质沉淀与凝固，蛋于原来溶剂中。加热引发蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或一些有机酸反应都属于这类。白质与重金属离子或一些有机酸反应都属于这类。l 蛋白质变性后，有时因为维持溶液稳定条件蛋白质变性后，有时因为维持溶液稳定条件依然存在（如电荷），并不析出。所以变性蛋白依然存在（如电荷），并不析出。所以变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀蛋白质也未必质并不一定都表现为沉淀，而沉淀蛋白质也未必都已变性。都已变性。第102页三、仪器、材料和试剂 试验材料和试剂试验材料和试剂0.2%0.2%鸡鸡蛋蛋清清溶溶液液；pH4.7 pH4.7 醋醋酸酸-醋醋酸酸钠钠缓缓冲冲溶溶液液；3%3%硝硝酸酸银银溶溶液液；5%5%三三氯氯乙乙酸酸溶溶液液；95%95%乙乙醇醇；饱饱和和硫硫酸酸铵铵溶溶液液；硫硫酸酸铵铵结结晶晶粉粉末末；0.1 0.1 molL-1molL-1盐盐酸酸溶溶液液；0.1 0.1 molL-1molL-1氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液；0.05 0.05 molL-1molL-1碳碳酸酸钠钠溶溶液液；0.1 0.1 molL-1molL-1醋醋酸酸溶溶液液；甲甲基基红红溶溶液液；2%2%氯氯化化钡钡溶溶液液；10%NaOH10%NaOH；饱和；饱和NaClNaCl；10%10%醋酸。醋酸。第103页四、操作步骤与方法 1 1盐析：加盐析：加5%5%卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液5 ml5 ml于试管中，再加等量饱和硫酸铵溶于试管中，再加等量饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白沉淀。倒出少许混浊沉淀，加少许液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白沉淀。倒出少许混浊沉淀，加少许水，观察是否溶解，为何？将管中内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉水，观察是否溶解，为何？将管中内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出沉淀为清蛋白。末到不再溶解为止，此时析出沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少许蒸馏水，观察沉淀再溶解。取出部分清蛋白，加少许蒸馏水，观察沉淀再溶解。2 2重金属离子沉淀蛋白质：重金属离子与蛋白质结合成不溶于水复重金属离子沉淀蛋白质：重金属离子与蛋白质结合成不溶于水复合物。合物。取取1 1支试管，加入蛋白质溶液支试管，加入蛋白质溶液2 ml2 ml，再加，再加3%3%硝酸银溶液硝酸银溶液1212滴，振滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少许水，荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少许水，沉淀是否溶解？为何？沉淀是否溶解？为何？3 3一些有机酸沉淀蛋白质：取一些有机酸沉淀蛋白质：取1 1支试管，加入蛋白质溶液支试管，加入蛋白质溶液2 ml2 ml，再加，再加1 ml5%1 ml5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀生成。放置片刻，倾出上清三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少许水，观察沉淀是否溶解。液，向沉淀中加入少许水，观察沉淀是否溶解。第104页l4加加热热沉沉淀淀蛋蛋白白质质：取取5支支试试管管，编编号号。依依下下表表次次序序加加入入试试剂剂：将将各各管管混混匀匀，观观察察统统计计各各管管情情况况，然然后后，放放沸沸水水浴浴中中加加热热10min，注注意意观观察察各各管管沉沉淀淀情情况况，最最终终将将第第3、4、5号号管管分分别用别用10%NaOH或或10%醋酸中和，观察并解释试验结果。醋酸中和，观察并解释试验结果。试剂管号蛋清蛋白质（滴）0.1mol/L醋酸（滴）10%醋酸（滴）l 饱和NaCl（滴）10%NaOH(滴）蒸馏水（滴）110-72105-5310-5-5410-52-510-25第105页5乙醇引发变性与沉淀：取3支试管，编号。依下表次序加入试剂：振摇混匀后，观察各管有何改变。放置片刻，向各管内加水8 ml，然后在第2、3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1 molL-1醋酸溶液及0.05 molL-1碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色改变和沉淀生成。每管再加0.1 molL-1盐酸溶液数滴，观察沉淀再溶解。解释各管发生全部现象。试剂（ml）管号5%卵清蛋白溶液0.1 molL-1氢氧化钠溶 液0.1 molL-1盐酸溶液95%乙醇pH4.7缓冲溶液123111111111第106页五、思索题：五、思索题：l1.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒解素剂？鸡蛋清为何可做铅、汞中毒解素剂