生物芯片分类和应用省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

1一、一、概念、分类及应用概念、分类及应用第1页2（一）、（一）、两两 个个 概概 念念FF生生生生物物物物芯芯芯芯片片片片 主主要要指指经经过过平平面面微微细细加加工工技技术术在在固固体体芯芯片片表表面面构构建建微微流流体体分分析析单单元元和和系系统统，以以实实现现对对细细胞胞、蛋蛋白白质质、核核酸酸以以及及其其它它生生物物组组分分准准确确、快快速速、大信息量检测。大信息量检测。FF基基基基因因因因芯芯芯芯片片片片 技技术术是是经经过过微微阵阵列列技技术术,将将高高密密度度DNADNA片片段段阵阵列列经经过过高高速速机机器器人人以以一一定定次次序序或或排排列列方方式式使使其其附附着着在在如如玻玻璃璃片片等等固固相相表表面面，以以荧荧光光标标识识DNADNA探探针针，借借助助碱碱基基互互补补杂杂交交原原理理，进进行行大大量量基基因因表表示及监测等方面研究最新革命性技术示及监测等方面研究最新革命性技术。第2页3微阵列芯片（Microarray）微型试验室芯片(Lab-on-a-chip)液体芯片(Liquichip)（二）、生物芯片分类及应用（二）、生物芯片分类及应用第3页4Lab-on-a-chip 微型试验室芯片是经过在芯片上刻微型试验室芯片是经过在芯片上刻成微流路径从而将包括生物检测主要步成微流路径从而将包括生物检测主要步骤骤样品准备样品准备/生化反应生化反应/结果检测结果检测整整合在一张芯片上。合在一张芯片上。第4页5第5页6第6页7Liquichip Bead,Capture molecule,Analyte,Reporter molecule是组成liquichip 4个主要部分。Bead上带有两种荧光，依据这两种荧光百分比能够 将bead分为各种。当前已经有48种，正在开发中。Capture molecule:作用相当于探针，能特异性与被检测物结合。Analyte:样品中被检测成份。Reporter molecule:带有荧光汇报分子，能特异性与被检测物结合。第7页8Liquichip反应普通步骤：反应普通步骤：1.先将capture molecule 结合在bead 上，2.将这种标识了bead与样品反应。Capture molecule 能够与对应 analyte 特异性结合，3.此时再加入荧光标识，特异结合analytereporter molecule。4.检测：用liquichip workstation 进行检测。原理是同时对bead和reporter molecule 上荧光进行检测。从而确定被结合analyte种类和数量。第8页9Liquichip技术特点描述技术特点描述1基于bead这种固相反应技术，含有 灵敏度高、信号强度高、灵活性好、所需样品量少特点。2与传统蛋白芯片相比，有两大优势，反应速度更加快，灵活性更加好。3因为检测方法特点，在大部分试验过程中，都不需要洗脱步骤，省时，且不会破坏反应动态平衡。4有配套蛋白表示和纯化体系。（his-tag）第9页10Lquichip应应 用用 领领 域：域：蛋白质定量蛋白质定量蛋白质功效研究蛋白质功效研究蛋白表示谱分析。蛋白表示谱分析。蛋蛋白白质质与与蛋蛋白白质质、蛋蛋白白质质与与核核酸酸相相互互作作用用研研究究。包含：免疫分析、酶分析、受体-配基分析、蛋白质核酸相互作用分析分析。第10页11微阵列芯片蛋白芯片基因芯片 第11页12蛋白芯片蛋白芯片(Protein Chips)高通量微阵列蛋白分析方法高通量微阵列蛋白分析方法高通量微阵列蛋白分析方法高通量微阵列蛋白分析方法 利用抗体抗原结合原理，采取化学发光或荧利用抗体抗原结合原理，采取化学发光或荧光检测光检测 标识抗体或抗原，来检测抗原或抗体。标识抗体或抗原，来检测抗原或抗体。第12页13蛋白芯片应用蛋白芯片应用FF免疫学分析免疫学分析 FF蛋白与蛋白之间相互作用蛋白与蛋白之间相互作用 FFDNADNA与蛋白质分子相互作用与蛋白质分子相互作用第13页14基因芯片基因芯片是经过微阵列技术,将高密度DNA片段阵列经过高速机器人以一定次序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标识DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量基因表示及监测等方面研究最新革命性技术。微阵列技术巨大优势在于它能够并行地宏量获取生物信息，借助此技术发展生物芯片则提供了以核酸杂交为基础基因水平表示监控，多态性研究和基因分型。从而使我们对基因表示调控有更深入了解。第14页15基因芯片发展历史基因芯片发展历史Southern&Northern Southern&Northern BlotBlotDot Dot BlotBlotMacroarrayMacroarrayMicroarrayMicroarray第15页16基因芯片 按内涵划分：按内涵划分：cDNAcDNA芯片芯片 OligoOligo芯片芯片:25:25mer(affymetrix),mer(affymetrix),70mer(Operon)70mer(Operon)，80mer 80mer（ClontechClontech）,按功效划分：按功效划分：基因组芯片：基因组芯片：检测某一基因是否存在，若检测某一基因是否存在，若检测某一基因是否存在，若检测某一基因是否存在，若 存在，拷贝数是多少。探针是存在，拷贝数是多少。探针是存在，拷贝数是多少。探针是存在，拷贝数是多少。探针是DNA.DNA.DNA.DNA.表示谱芯片表示谱芯片：确定基因表示路径与表示产确定基因表示路径与表示产确定基因表示路径与表示产确定基因表示路径与表示产 物。探针是物。探针是物。探针是物。探针是RNARNARNARNA或或或或cDNAcDNAcDNAcDNA 测序芯片测序芯片：经过探针与微阵列配对分析获经过探针与微阵列配对分析获 得探针序列结果。得探针序列结果。第16页17基因芯片应用基因芯片应用H基因表示检测基因表示检测H多态性分析多态性分析H遗传图谱定位遗传图谱定位H基因分型基因分型H经过杂交反应测定序列经过杂交反应测定序列第17页18基因芯片应用领域基因芯片应用领域FF遗传疾病研究遗传疾病研究*癌症癌症癌症癌症*家系遗传疾病家系遗传疾病家系遗传疾病家系遗传疾病*普通基因突变疾病普通基因突变疾病普通基因突变疾病普通基因突变疾病FF感染性疾病感染性疾病FF药品筛选药品筛选FF动物植物遗传筛选育种动物植物遗传筛选育种 FF个人基因身份证个人基因身份证FF环境监测环境监测第18页19（三）、生物芯片应用优势（三）、生物芯片应用优势F高通量平行分析样品高通量平行分析样品F自动化程度高省时省力自动化程度高省时省力F所需样品试剂少保护环境所需样品试剂少保护环境F成本低成本低第19页20生物芯片应用优势生物芯片应用优势生物信息数据累积生物信息数据累积F为生物信息公共数据库添加更多数据为生物信息公共数据库添加更多数据F有利于研究基因序列与生物表型之间关系有利于研究基因序列与生物表型之间关系F有利于了解疾病发生机制有利于了解疾病发生机制第20页21二、二、生物芯片制作技术介绍生物芯片制作技术介绍第21页22生物芯片制作方法分类生物芯片制作方法分类第22页23 原位合成原位合成 (In Situ Synthesis)In Situ Synthesis)化学合成化学合成原子印章原子印章原位光刻合成原位光刻合成第23页24原位光刻合成原位光刻合成 美国著名Affymetrix企业率先开发寡聚核苷酸原位光刻专利技术，是生产高密度寡核苷酸基因芯片关键关键技术。第24页25 原位光刻合成原理Light directed oligonucleotide synthesis.A solid support is derivatized with a covalent linker molecule terminated with a photolabile protecting group.Light is directed through a mask to deprotect and activate selected sites,and protected nucleotides couple to the activated sites.The process is repeated,activating different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary DNA probes to be constructed at each site.第25页26预先合成后点样(off-chip synthesis)接触式点样非接触式点样第26页27基因芯片点样方式接触式点样-适合于DNA芯片制作 即点样针直接与固相支持物表面接触，将DNA样品留在固相支持物上第27页28接触式点样Best!Best!第28页29ArrayIt ChipMaker Pins带有细槽不锈钢针尖载样能力:200 to 600 nL点样体积:250 pL to 2.5 nL(pin size)点样直径:100 m to 500 m(pin size)1.Dippingofpinforsamplepickup2.Touchingofslidewithpintoleavespot3.Controlprintvolumewithpinsize第29页30Stealth and Chipmaker Pin(TeleChem)第30页31Chipmaker 点样技术第31页32Stealth Pins第32页33CatalogNumberSpot Diameter(m)Uptake volume (l)Delivery Volume(nl)Minimum spot spacing(m)Maximum subgrid per pin(spots)Density(spots/cm2)Maximum numberOf spots(18mm72mm)SMP390-1000.250.612036*366,35082,944SMP4120-1300.251.016028*283,84250,176SMP5150-1600.251.320022*222,37230,967SMP6180-1900.251.524018*181,58820,736SMP7200-2200.271.726016*161,25416,384SMP8210-2300.281.827516*161,25416,384SMP9260-2900.282.034012*127069,216SMP10300-3300.292.340010*104906,400第33页34TeleChem企业点样针技术企业点样针技术不停发展专利针技术不停发展专利针技术不停发展专利针技术不停发展专利针技术共有共有共有共有3030种针供选择种针供选择种针供选择种针供选择与斯坦福大学共同发展与斯坦福大学共同发展专利专利 pin,带样带样稳定，样品利用率高稳定，样品利用率高单次带样可连续点样达单次带样可连续点样达200-1500次次特殊不锈钢材料，适合用于各种溶液特殊不锈钢材料，适合用于各种溶液实际点样直径实际点样直径75-250um,可依据不一样品选择可依据不一样品选择对应对应pin相当轻易更换相当轻易更换pin和和pin head以以适应不一样需要适应不一样需要第34页35基因芯片点样方式非接触式点样-适合于蛋白芯片制作 它是以电磁阀或压电原理将样品直接喷至固相支持物表面第35页36非接触式喷点技术ThermalSolenoid螺线管螺线管PiezoelectricDP第36页37Synquad：经过高分辨率注射器泵和微螺线管阀门有机结合起来准确控经过高分辨率注射器泵和微螺线管阀门有机结合起来准确控制滴液制滴液 Piezoelectric：用压电晶体将液体从孔中喷出压电技术，用压电晶体将液体从孔中喷出压电技术，两个压电晶体两个压电晶体同时加脉冲通电触发这两个压电晶体往喷管中间变形挤压喷管侧壁，喷同时加脉冲通电触发这两个压电晶体往喷管中间变形挤压喷管侧壁，喷管出现收缩压迫液体从喷嘴喷出。管出现收缩压迫液体从喷嘴喷出。DP第37页38非接触式点样：synQUAD Technology第38页39Aspirate and Print for Making Arrays第39页40Characteristics of synQUAD TechnologyWide dispense rangeLow nanoliter to high microliterExcellent linearityPrecise and accurateCVs typically less than 10%Precision less than 5%Non-contact dispense mechanismEasier mechanical alignment(384,1536,)“On-the-fly”printing possibleCapable of dispensing onto membranes or slidesMultiple liquid handling modesAspirate/DispenseContinuous Reagent Dispensing第40页41synQUAD vs Piezoelectric PrintingsynQUAD/nQUADl Patented by Cartesian l Uses commercially available componentsl Robust and reliable delivery mechanisml Low nanoliter to low microliter dispense volume l maximum density:200 to 400 spots/cm2 Piezoelectric Abbott holds key patents on technology Dispense susceptible to air bubbles Mid-picoliter dispense volume 2500 spots/cm2第41页42三、三、生物芯片检测系统生物芯片检测系统CCD扫描仪 非共聚焦激光扫描仪激光共聚焦扫描仪第42页43数值孔径与采光效率NA 0.3 NA 0.8NA=sin(),where is the angle of the cone第43页44激光共聚焦（聚焦）激光共聚焦（聚焦）FThe fluorescence source is at the objective lens focusFLight goes through the pinhole to the detector第44页45激光共聚焦（非聚焦）激光共聚焦（非聚焦）FFluorescence source below focus(e.g.out of focus)FOut of focus light is mostly blocked at the pinhole第45页46Confocal Artifact RejectionNo Pinhole With PinholeDust artifacts reduced by at least a factor of 10第46页47CCD Camera SystemslAdvantages:lFew moving partslFast scanning of bright sampleslDisadvantages:lNA limited to about 0.40:Less appropriate for dim sampleslOptical scatter can limit performancelNeed to“stitch”together large imagesConfocal Laser ScannerslAdvantageslSmall depth of focus reduces artifactslhigh light collection efficiency.l PMT detectors have the highest sensitivity in the visible range第47页48DNAscope LM+激光共聚焦芯片扫描仪激光共聚焦芯片扫描仪第48页49xxyzxMACROscopeFilters第49页50How the Scan System WorksF-thetaTelecentricScanSystemSampleScanning MirrorLaser Scan LensBAC第50页51How to scan a whole sampleHome SensorScanning MirrorSampleLaser Scan Lens第51页52DNAscope LM+优点优点 共聚焦面积宽共聚焦面积宽:20mm 70mm能够扫描各种介质能够扫描各种介质(Images both Glass Slide Microarrays and CLONDIAG AT tubes)背景噪声低，信噪比高背景噪声低，信噪比高全自动成像，分析结果全自动成像，分析结果 Small footprint(W20cm x L30cm x H20cm)第52页53Imaging Arrays Both Dry&WetDryPBSbufferCy3 Cy5Cy3 and Cy5 labeled protein dotted on glass substrate and imaged at 5 micron resolution in both dry and wet formats第53页54Tube1Tube2Cy3 Images of two Clondiag Array Tubes 第54页55四、生物芯片技术思绪比较第55页56Comparison of DNA Chip Technologies Sensitivity of DNA chip based assays is a function of:*Probe and target DNA/RNA(Complexity)*Chip surface(autofluorescence&non-spec.bkg)*Attachment chemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)*Hybridization efficiency(lots of factors)*Detection technology(signal type,efficiency,noise)Oligo-ChipOligo-Chip cDNA-Chip cDNA-Chip Genomic Chip Genomic Chip 20n or 80 n 50,000 n 20n or 80 n 50,000 nsequencingsequencingexpressionexpressionexpressionexpressiongenomic analysisgenomic analysis第56页57cDNA芯片缺点因为不一样基因长短不一样，Tm值各异，成千上万基因在同一张芯片上杂交，使得杂交条件极难同一。同一个体中总是存在一些基因家族同源序列，加上有物种存在基因重合序列相互干扰，使得传统cDNA芯片分辨能力受到限制，结果准确性也受到影响。有些组织中在DNA双链中无意义链中存在重合基因；而且不一样RNA剪切方式等基因表示方式极难用cDNA芯片来区分。PCR产物是结合稳定DNA双链，加入探针后在杂交中必定存在竞争性抑制，影响探针和模板结合能力和稳定性，深入影响cDNA芯片分辨能力和结果可信度，这对于低丰度基因影响尤为显著。PCR产物浓度不均一也可能造成错误结论。第57页58寡核苷酸芯片比cDNA芯片优点 探针序列经过系统优化，降低非特异杂交，能有效区分有同源序列基因；降低二级结构 及其对杂交结果影响杂交温度均一，提升杂交效率；合成产物浓度均一，防止因样品浓度差异而造成点样量差异；能够设计检测不一样剪切方式基因；无需扩增，预防扩增失败影响试验。第58页59预合成后点样系统综合成本cDNA芯片方法/步骤 试剂/仪器（万）人员（人）耗时（月）构建或购置基因文库 1-31-2 3-6 PCR引物设计与合成 55-65万（个片段）1 3PCR产物纯化及定量 1.2/20（个片段1 2点样 点样仪60万 1 3天 杂交 0.3万试剂 1 2扫描 扫描仪60万 1 1-2累计197.5 209.56-7 11-15 第59页60预合成后点样系统综合成本自己合成寡聚核苷酸芯片方法方法/步骤步骤试剂试剂/仪器（万）仪器（万）人员（人）人员（人）耗时（月）耗时（月）寡聚核苷酸筛选及合成(个基因)200（每个基因用1个70碱基寡核苷酸片段代替，合成1个碱基14元人民币计）。1(寡核苷酸片段筛选，还需专业软件)3-4个月，如购置DNA合成仪，成本？，但时间较长点样 点样仪60万 1 1个月 杂交 0.3万试剂 1 2个月 扫描 扫描仪60万1 1-2个月 总计总计320.3万47-9第60页61预合成后点样系统综合成本应用Operon探针寡聚核苷酸芯片方法/步骤 试剂/仪器（万）人员（人）耗时（月）探针100点样 60（点样仪）1 1 杂交 0.3（试剂）1 2扫描 60（扫描仪）1 1-2总计220.334-5第61页62Affymetrix技术平台综合成本芯片万杂交小时洗涤小时扫描分钟累计220万小时第62页63总结采取Affymetrix企业生物芯片系统平台比较适合于实力雄厚科研试验室，能够在最短时间内尽快取得准确可靠而且可能是前人未曾取得试验结果，并可在国际权威杂志上获发表，尽快在相关研究领域在国际领域占领一席之地。第63页64总结采取合成后点样生物芯片平台比较适合于目标定位于研研发发、生生产产试试验验室室及及生生物物企企业业。即使购置芯片点样扫描系统经费看起来比购置Affymetrix系统费用要低，研发方向能够结合试验室研究特点，比比较较灵灵活活，但前期研究需要投入较大人力、物力和时间，综合成本并不低，而且取得芯芯片片信信息息量量小小，可可靠靠性性较较低低，使用该系统生产芯片为材料进行研究普通为验证性工作，且因为材料可靠性低，极难在国际权威杂志上取得认可。当前开发生产生物芯片尚无取得医疗许可产品。第64页65五、五、生物芯片制作所需耗材生物芯片制作所需耗材第65页66 Microarraying Accessories（芯片配件）（芯片配件）Pins and PrintheadsOmniGrid Slides and ReagentsOmniGrid Epoxy(环氧基修饰环氧基修饰)OmniGrid Amine(氨基修饰氨基修饰)OmniGrid Aldehyde(醛基修饰醛基修饰)Complete line of associated reagentsHybridization ChambersHybChamberHybChamber Mica第66页67Slides:EpoxyAldehydeAmineBuffers:SpottingBlockingHybridizationOmniGrid Slides&Reagents芯片研究片基和试剂芯片研究片基和试剂第67页68Substrates膜：膜：FS&S NC膜及膜及Supercharge尼龙膜尼龙膜玻璃片：玻璃片：FS&S FASTFCEL 醛基化、氨基化玻片醛基化、氨基化玻片FDAKO玻片玻片FTelechem SuperClean/SuperAmine/SuperAldehyde第68页69Hybridization Cassete1.Telechem2.Clontech Plastic Hybridization CassetePlastic Hybridization Cassete第69页70Wash Station第70页71基因企业芯片系统客户生物芯片北京国家工程研究中心生物芯片上海国家工程研究中心东南大学吴建雄试验室湖州数康科技企业复旦张江生物医药有限企业联合基因集团西北大学基因芯片中心中国疾病控制中心病毒所浙江大学生命科学院华大基因组学研究中心北京军事医学科学院二所成都百奥生物信息科技有限企业第一军医大学分子生物学研究所宁波瑞星生物科技有限企业山东省医科院生物医药技术室上海博道企业上海数康企业湖州数康科技企业江南科技企业南京市妇幼保健医院中科院上海冶金研究所中科院生化细胞所中科院微系统与信息技术研究院南京农业大学香港科技大学生物工程系香港汉字大学威尔斯亲王医院香港浸会大学生物系香港大学医学院玛丽医院香港汉字大学生物系第71页72完善售后服务体系基因企业在全国各主要地域设有7处维修站，其中直接为生物芯片设备提供维护、维修服务工程师有4人，主要集中在上海和北京。这些工程师都含有多年生物芯片相关设备安装、调试、维护、维修经验。上海晶泰生物技术有限企业作为基因有限企业全资子企业，该企业生物芯片试验室拥有当前国内领先生物芯片点样、扫描设备，以及相关如杂交炉、洗涤工作站等全套试验设备。同时，企业当前拥有生物芯片领域大量专业技术人才，当前，生物芯片试验室拥有本科以上20人，硕士5人、博士5人。该企业对外提供包括生物芯片领域各项商业服务：点样、扫描、芯片设计制作等全方位服务。第72页73谢谢各位老师谢谢各位老师！第73页