资源描述
力气提升
与基因工程相关的酶
种类
项目
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
解旋酶
作用底物
DNA分子
DNA分子片段
脱氧核苷酸
DNA分子
作用部位
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对间的氢键
作用特点
切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上
将DNA两条链之间的氢键打开
作用结果
形成黏性末端或平末端
形成重组DNA分子
形成新的DNA分子
形成单链DNA分子
(1) 基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。限制酶是一类酶，不是一种酶。限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。
(2) 在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。
(3) 限制酶不切割自身DNA的缘由是:原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(4) 限制酶和DNA连接酶之间的关系:
典例1 (2022·兴化模拟)基因工程利用某目的基因(图甲)和Pl噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是( )
A. 构建重组DNA时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和Pl噬菌体载体
B. 构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和Pl噬菌体载体
C. 图乙中的Pl噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团
D. 用EcoRⅠ切割目的基因和Pl噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA
利用PCR技术扩增目的基因
1. 原理
利用DNA双链复制的原理，在体外将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。
2. 条件
条件
作用
在确定的缓冲液中进行
供应相对稳定的pH环境
四种脱氧核苷酸
作为合成DNA子链的原料
DNA母链
作为DNA复制的模板
TaqDNA聚合酶
催化合成DNA子链(耐高温)
引物
使DNA聚合酶能够从引物的3'端开头连接脱氧核苷酸
温度
把握
90~95 ℃
变性:使DNA片段双链解开
55~60 ℃
复性:使解链的两条DNA单链分别与相应的引物结合(退火)
70~75 ℃
延长:Taq DNA聚合酶催化子链合成
3. 解题规律总结
DNA分子数
2
4
8
2n
含引物的DNA分子数
2
4
8
2n
含引物A(或B)的DNA分子
1=21-1
3=22-1
7=23-1
2n-1
同时含引物A、B的DNA分子数
0=21-2
2=22-2
6=23-2
2n-2
共消耗的引物数量
2=22-2
6=23-2
14=24-2
2n+1-2
含与脱氧核苷酸链等长的DNA分子数
0=21-2
0=22-4
2=23-6
2n-2n
DNA分子种类
2
4
5
5
PCR扩增技术与DNA复制的比较:
PCR技术
DNA复制
原理
半保留复制
场所
生物体外
生物体内
过程
变性→退火→延长
边解旋边复制
模板
含目的基因的DNA片段
整个DNA分子
原料
四种脱氧核苷酸
能量
热能、四种脱氧核苷三磷酸含有的能量
ATP
酶
热稳定DNA聚合酶(Taq酶)
解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等
引物
2种特定的单链DNA片段
RNA片段
温度
90~95 ℃→55~60 ℃→70~75 ℃
生物体内温度
其他条件
缓冲液、Mg2+、无菌条件等
生物体内环境
结果
复制目的DNA
复制DNA
典例2 (2022·通州中学)下列关于用PCR技术扩增DNA分子中的目的基因的叙述，正确的是( )
A. PCR扩增时只需要一种引物
B. 获得2个目的基因共需要6个引物
C. 在PCR扩增时需要解旋酶和DNA聚合酶
D. 要获得目的基因至少经过了1个PCR循环
基因工程中涉及的几种方法
1. 提取目的基因的常用方法
制备方法
比较项目
直接提取法
人工合成法
鸟枪法
反转录法
已知氨基酸序列→DNA
制备过程
供体细胞中DNA→很多DNA片段→载体→受体细胞→产生特定性状→目的基因
目的基因的mRNA单链DNA双链DNA(目的基因)
蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列合成目的基因
优点
操作简便，广泛接受
专一性较强，目的基因不含内含子
专一性强，可产生自然界不存在的基因，目的基因不含内含子
缺点
专一性差，工作量大
mRNA不稳定，技术要求高
仅限于核苷酸数较少且已知序列的基因
适用范围
原核细胞基因
真核细胞基因
2. 目的基因导入受体细胞的方法
细胞类型
常用方法
受体细胞
转化过程
转化实质
植物细胞
农杆菌转化法(基因枪法、花粉管通道法)
体细胞
将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上
目的基因整合到受体细胞染色体基因组中，并在受体细胞内维持稳定和表达
动物细胞
显微注射技术
受精卵
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵→获得受精卵→显微注射→早期胚胎培育→胚胎移植→发育成为具有新性状的动物
微生物细胞
Ca2+处理增大
细胞壁通透性
原核细胞或酵母菌
用Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸取
3. 目的基因的检测与鉴定方法
类型
步骤
检测内容
方法
结果显示
分子
检测
导入
检测
目的基因是否插入受体细胞染色体的DNA上
DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间)
是否成功显示出杂交带
表达
检测
目的基因是否转录出mRNA
核酸分子杂交技术(DNA和mRNA之间)
同上
目的基因是否翻译出蛋白质
蛋白质分子杂交技术(抗原和抗体之间)
同上
个体生物学
水平的鉴定
① 确定是否具有抗性及抗性程度，
② 基因工程产品与自然产品的活性是否相同
① 抗虫或抗病的接种试验，
② 基因工程产品与自然产品活性的比较
是否赐予了预期抗性或蛋白质活性
过程图示
(1) 基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。
(2) 目的基因的插入位点不是任凭的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。
(3) 一般状况下，用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的片段，但有时可用两种限制酶分别切割质粒和目的基因，这样可避开质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。
(4) 植物细胞的全能性较高，可经植物组织培育过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞;动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。
(5) 基因表达载体中，启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA);终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。
(6) 基因表达载体的构建是最核心的一步，在体外进行。个体水平上的检测和鉴定是最简洁最有效的方法。
典例3 (2022·海安中学)很多大肠杆菌的质粒上含有lacZ基因，其编码的产物β-半乳糖苷酶在X-gal和IPTG存在时，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。基因工程中常利用该原理从导入质粒的受体细胞中筛选出真正导入重组质粒的细胞，过程如下图所示。下列说法错误的是( )
A. 基因工程中，构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，能遗传给后代，并表达和发挥作用
B. 转化过程中，大肠杆菌应先用Ca2+处理，使其处于能吸取四周DNA的状态
C. 菌落颜色为白色的是菌落②
D. 菌落③中的目的基因是否表达，可接受的检测方法是抗原—抗体杂交
转基因生物平安性的理解?
关注焦点
正方观点
反方观点
食物平安
有平安性评价、科学家负责的态度，转基因食品影响健康，无实例无证据
反对“实质性等同”、毁灭滞后效应、毁灭新的过敏原、养分成分转变
生物平安(对生物多样性的影响)
生命力有限、存在生殖隔离、花粉传播距离有限、花粉存活时间有限
集中到种植区之外变成野生种类、成为入侵外来物种、重组出有害的病原体、成为超级杂草、有可能造成“基因污染”
环境平安(对生态系统稳定性的影响)
不转变生物原有的分类地位、削减农药使用、疼惜农田土壤环境
打破物种界限、二次污染、重组出有害的病原微生物、毒蛋白等可能通过食物链进入人体
实质性等同原则是指转基因生物与自然存在的传统生物在相同条件下进行性状表现的比较。保证转基因食品平安的监控和预防措施:立法、多环节监控、平安评价内容具体而严格。
典例4 (2022·丹阳中学)下列关于转基因生物与环境平安的叙述，错误的是( )
A. 重组的微生物在降解污染物的过程中可能产生二次污染
B. 种植抗虫棉可以削减农药的使用量，对环境没有任何负面影响
C. 假如转基因植物的花粉中有毒蛋白或过敏蛋白，可能会通过食物链传递到人体内
D. 转基因生物所带来的环境平安问题在今后有可能得到解决
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