基于SSR分子标记技术的长豇豆种子纯度快速鉴定技术图文百精.doc

浙江农业学报 A cta A gricult urae Zhejiangens is 22(6:727730, 2010基于 SSR 分子标记技术的长豇豆种子纯度快速鉴定技术鲁忠富 , 徐 沛 , 汪宝根 , 刘永华 , 吴晓花 , 胡婷婷 , 李国景*(浙江省农业科学院 蔬菜研究所 , 浙江 杭州 310021收稿日期 :2010-06-17基金项目 :浙江省科技厅重大优先主题项目 (2008C120031 作者简介 :鲁忠富 (1963-, 男 , 浙江杭州人 , 农艺师 , 主要从事蔬 菜育种 和栽 培 技术 研究 工作。 E m ai:l l u zf zaas . org ; T e:l 0571 86404223*通 讯 作 者 , 李 国 景 , E m a i :l Guoji ng _liyahoo . co m. cn; T el (摘 要 :当前生产上应用的长豇豆品种众多 , 且商业品种间的遗传相似性愈来愈高 , 种子质 量纠纷时 有发生。 本研究以 44份核 心长豇豆种质为试材 , 利用普通豇豆 DNA 序列 信息 , 通过 生物信息 学方法自主 设计开发适 用于长豇豆研究的 SS R 引物 , 从中筛选出 10对 诊断性引物 , 在此基础上 建立基于 SSR 分子 标记技 术的长豇 豆种子纯度快速检测方 法 , 可满足长豇豆种子产业化的需要。 关键词 :长豇豆 ; SSR; 纯度鉴定 ; 遗传指纹图谱 中图分类号 :S 643 4 文献标识码 :A文章编号 :1004-1524(2010 06-0727-04A rapid and precise SSR based procedure for seed quality surveying of Vigna un guiculata ssp . sesqui p edalis (L . Verd .L U Zhong f u , XU Pe, i WANG Bao geng , LI U Yong hua , WU X iao hua , Hu T i n g ti n g , LI Guo ji n g*(Instit ute of Vegetab les, Zhejiang A cade my of A gricult ural Sciences , H angzhou 310021, Chi naAbstrac t :Current applica tion of l a rge nu mber o f comm erc i a l asparagus bean culti va rs w it h v ery hi gh g enetic si m ilar i ty causedm ore andm o re d isputes on seed qua lity . In t h is research , a set of SS R ma rkers for asparagus bean w ere de ve l oped based on a b i o i n f o r m ati cs based approach . T en o f t hese ma rkersw ere defi ned as diagnosti c m arkers by geno typ i ng a core co llecti on o f asparagus bean consisti ng of 44li nes . Based on t h is , a rap i d and prec i se SSR based proce dure f o r asparagus bean seed qua lity survey i ng w as estab lished , w hich wou l d m eet t he de m and o f rap i d l y deve l op i ng asparagus bean i ndustry .K ey word s :asparagus bean ; SS R; purity s urvey i ng ; genetic fi ngerpri nt长豇 豆 (Vi g na unguiculata ssp . sesqui p edalis (L . V er d. 嫩荚供食 , 是 我国重要的夏季豆类 蔬菜之一。我国从事长豇豆育种、 种子生产和经 营的科研院所、 企业众多。当前生产上应用的长 豇豆品种众多 , 年用种量大 , 商业品种间的遗传 相似性愈来愈高 , 同种异名、 同名异种现象日益 严重 , 种子质量纠纷时有发生。目前我国蔬菜品 种真伪与纯度鉴定大多依靠田间表现型鉴定 , 鉴定所需时间长 (一般需 5060d, 并受季节的限 制 , 而且作物的表现型易随环境条件的变化而变 化 , 特别是对于一些形态差异较小的品种间鉴定 难度更 大。因此 , 很 有必要 研究 开发 一种 能早 期、 周年、 快速、 准确鉴定长豇豆品种真伪和纯度 的检测方法。DNA 分子标记技术在国内外已被用于鉴别 不同品种 之间在分子水平 上的差异1-3。由于在同一物种的各个品种间存 在有大量的多态性 标记 , 每一品种均存在有区别于其他品种的独特 标记 , 即一些特异性 DNA 片段 , 称为该品种的指 纹 , 各品种独 特的指纹 片段组合 构成该物 种的 DNA 指纹图谱。与传统的依据表型性状鉴定相 比 ,以在植株生长的 任何阶段进行 , 鉴定快速 , 并不 受基因表达和环境条件的影响等优点。SSR 分子标记技术利用 真核生物基 因组中 存在的大量微卫星重复序列设计引物 , 通过 PCR 扩增串联的重复序列 , 并依据微卫星的重复次数 在同一物种不同基因型间 的差异揭示长度多态 性 4。 SSR 由于分布广、 稳定性和多态率高 , 操 作简单、 重复性好、 对 DNA 质量要求较低 等 , 被 誉为第二代分子标 记的明星。 SSR 分 子标记技 术克服了 RAPD 稳定性和 重复性差 , AFLP 技术 费用昂贵、 操作复杂、 对 DNA 的纯度和内切酶的 质量要 求很 高等缺 点。为此 , 本 研究 建立 基于 SSR 分子标记技术的种子纯度快速检测方法 , 现 将结果报道如下。1 材料与方法1. 1 材料供试材料由浙江省农业科学院蔬 菜研究所 提供 , 共 44份 , 包括我国当前生 产上主栽品种、 代表不同地域分布和具有 植物学多态性的材料 37份 , 来自美国和非洲的材料 7份。 SSR 反应用 试剂 , T ris 、 硝酸银、 尿素等生化试剂购自北京鼎 国生物技术有限公司 , E co R , M se 内切酶购自 上海生物工程技术有限公司 , Taq 酶、 dNTP 等购 自 Pro m ega 公司。1. 2 方法1. 2 1 豇豆 DNA 数据库 的下载 、 序 列处 理和 SSR 引物设计从 CGKB 数 据 库 (http :/co w peageno m ics . m ed . v irg i n ia . edu /CGKB/下载豇豆基因组序列 , 从 H ar vEST 数据库 (http :/harves.t ucr . edu /下 载长豇 豆 EST 序 列 ; 运 行 V ecScreen 程 序 (ht tp :/www. ncb. i n l m . n i h . gov 去除下载序列上包 含的载体和接头序列。运 行 CAP3程 序 (http :/genom e . cs . m tu . edu /sas. ht m l 对所得 序列进行序列拼 接以去除 重复 , 获得无冗余的 DNA 序列 ; 运行 H ornb ill 程 序 (h ttp :/hornbil. l cspp . latrobe . edu . au /cg i bin pub /ssrpri m er/index ssr . pl 鉴定 DNA 序列上所包 含的 SSR 位点并设计出 SSR 引物 100对 ; 交由上 1. 2 2 基因组 DNA 的提取将豇豆种子散播于装有基质 (蛭石 泥炭 =1 2 的育苗穴盘中 , 置于 2530! 下育苗 , 待第一 对真叶 平展时 , 取叶 片 0 1g , 加液 氮研磨 成粉 末 , 参照 M urry 和 Thos m pon 等 5的 C TAB 法提取 DNA 。1. 2 3 SSR 引物扩增和电泳检测PCR 分析反应体积为 12 5 L , 各组分为 10 buffer 1 25 L , 25mm ol/LMgC l 20 75 L, 2 5 mm o l/Ld NTPs 1 L, Taq 酶 (5U / L 0 1 L , 模板 DNA 10ng , 加水至 12 5 L 。 SSR 反应程序 为 :94! 预变性 3m i n , 94! 变性 30s , 52! 退火 30s , 72! 延伸 50s , 循环 35次 , 最后 72! 延伸 5 m in 。在 PTC 225扩增仪上进行 PCR 扩增 , 扩增 产物在 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分 离 , 银染显色 6, 7。2 结果与分析2. 1 SSR 引物 多态性 信息 含量 计算 和诊 断性 SSR 引物筛选提 取 44份 有 代 表 性的 长 豇 豆 基 因 组 总 DNA, 经检测 其 DNA 质量符合 研究所需。用设 计合成的 100对 SSR 引物分 别扩增这些材料的 DNA, PCR 反 应 体 积 为 12 5 L , 退 火 温 度 为 52! 。经对每对引物的扩增情况进行统计 , 并对 扩增条带进行 0或 1赋值 , 计算各引物的多态性 信息含量。从这 100对 SSR 引物扩增条带的稳 定性、 引物多态性指数和多态性条带的易分辨程 度 3方 面 进 行 综 合 评 价 , 从 中 选 取 CPL031, CPL053, CPL078, CPL112, CPL114, CPL135, CPL333, CPL420, CPL840, CPL865共 10对引 物 作为诊断性引物组合 , 如表 1。2. 2 我国 5个长豇豆主栽品种标准指纹图谱的 构建用上述 10对诊断性 SSR 引物分别扩增 #之 豇 106 、 #扬早豇 1号 、 #之豇特早 30 、 #宁豇 3号 及 #黑眉 等 5个我国当前生产上长豇豆主栽 品种的 DNA, 将扩增产物在浓度为 8%的非变性 聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离 , 银染照相并记 录结果 , 经 Pho toshop 软件处理后获 得主栽品种%728%浙江农业学报 第 22卷 第 6期 (2010年 11月 由图 1可见 , 用以上 10对诊断性 SSR 引物 组合构建的 5个我国当前 生产上长豇豆主栽品种的 DNA 指纹图谱条带清晰 , 每对引物 组合扩 增 的条带数不同 , 在 112条 之间 ; 不 同品种扩表 1 十对长豇豆诊断性 SS R 引物组合Table 1 Ten d i agnosti c SSR prm i er comb i nati ons for as paragus bean序号 引物名称 正向序列 (5 -3 反向序列 (5 -3 1CPL031CGCTCTTCGTTGATGGTTATG GTGTTCTAGAGGGTGTGATGGTA 2CPL053ACAGGTTCCTTGTGAAGCAC GCCATACGCAACTCAGCTAT 3CPL078GAACAGCTTCCTGAACCTCA GCTTTCATCTGCTCCAGGTA 4CPL112AACCCAGCATACCTGCATAA CTCGCCAATGATTCTGAGAT 5CPL114AATGTTTGGACTGGTCAGGA GAGGACAAGTCAGGAAGCAA 6CPL135GGTGGAAATCAGGTTGTTTG AGCCAATTGTCAAGTTCAGC 7CPL333TCGATCAAATTTTCCTCTGC TGCCACCATCTTTCATTTCT 8CPL420CGCGTACAACATCTCTTCCT GTGCCAATGGATCAGGTAAC 9CPL840TAGCATAGAAGAAGCAATCGT CTGGAATCTGGAAGGAGAA 10CPL865CTCTCTCTCTCCACATCTCAA CATCATCAATCACACAACTTCM. DNA M aeker ; 1. CPL112; 2. CPL053; 3. CPL114; 4. CPL031; 5. CPL135; 6. CPL840; 7. CPL420; 8. CPL865; 9. CPL078; 10. CPL333; 箭头示各品种 DNA 指纹的主要差异之处图 1 我国 5个长豇豆主栽品种的标准 DNA 指纹 图谱F ig . 1The standard DNA fi ngerpr i nts o f 5m a i n cu lti vars o f asparagus bean i n China%729%鲁忠富等 :基于 SSR 分子标记技术的长豇豆种子纯度快速鉴定技术增出的条带数差异性大 , 特别是 #黑眉 与其他 4品种间差异大 ; 不同品种间差异 性条带数不同 , #之豇 106 与 #扬早豇 1号 之间差异条带数在13条以上 , 完全可满足区分不同品种的要求。2. 3 基于 SSR 分子标记技术的豇豆种子纯度快 速检测方法利用以上研究开发出的诊断性 SSR 引物进 行长豇豆种子纯度检测 , 其主要步骤包括 :&DNA 提取 :将待检种子散播于 装有基质 V (蛭石 V (泥炭 =12的育苗穴盘中 , 置于 25 30! 下育苗 , 待第一对真叶平展时 , 单株取叶 片 0 1g , 加液氮研磨成粉末 , 用常规 CTAB 法提 取 DNA 。 SSR 引物扩增 :用上述 10对诊断性 SSR 引物进行 PCR 分析 , 反应体 积为 12 5 L , PC R 反应程 序同上。 (电泳检 测 :将扩 增产物 在 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离 , 然后进行银染显 色 , 数码相机照相记录结 果 , 获 得待检材料的 DNA 指纹图谱。 DNA 指纹图 谱比对 :将待检材料的 DNA 指纹图谱 与该品种 标准 DNA 指纹图谱进行 比对 , 如两者 的指纹图 谱完全相吻合 , 则该待检材料为真种子 , 否则为 伪种子。对于没有标准图谱的品种 , 按同样方法 先建立标准图谱。 种子纯度计算 :种子纯度 =(检测所得真种子数 /检 测种子 总数 100%3 讨论本研究的特点 :(1 应用自主开发和筛选出的 10对诊断性 SSR 引物组合 , 增强了鉴别近似品种的能力。经 过理论计算、 近似品种扩增比较 (图 1 及大量检 测实践证明这套引物能有 效区分长豇豆不同基 因型 , 完全可以满足对当前生产上主要长豇豆品 种进行真伪检测的需要。(2 直接鉴定遗传物质 , 大大提高了鉴定的 准确性。本研究使种子纯度的鉴定在 DNA 水平 上进行 , 避免了表型鉴定、 生化 鉴定等间接鉴定 方法所可能带来的误差 , 有操作方便 , 重复性好 的特点 , 具有高度的可靠性和权威性。(3 提 高了检测的效率和标准化程度。利 用本技术进行种 子纯度检测 , 其结果稳 定可靠 , 易于实现标准化 , 检测时间仅需 45h , 一次可 对多达上百份样品同时进行检测。一般种子质 检室只需具备常规的分子生 物学设备就可按提 供的操作 程序进行 实际检测 , PCR 反应各 组分 (MgC l 2, Bu ffer , d NTP , Taq 酶 购置方便 , 检测成 本低廉 , 仅为传统表型鉴定的六分之一左右。认 为该技术完全可用于生产上 种子纯度快速鉴定 的需要。参考文献 :1 王玲平 , 戴丹丽 , 吴晓花 , 等 . AFLP 分子标记技术在浙蒲 2号种子纯度快速鉴定中的应用 J.浙江农业学报 , 2008, 20(2:84-87.2 翟文强 , 田清 震 , 贾继增 , 等 . 哈密瓜杂交 种纯度的 AFLP 指纹鉴定 J.园艺学报 , 2002, 29(6:587.3 李丽 , 郑晓鹰 . AFLP 分子标 记应用 于白菜 品种 鉴定 J .分子植物育种 , 2006, 4(5:685-689.4 K antet y RV, La RotaM, M att h e w s DE, et a. l Datam i n i ng f or si m p l e sequen ce repeats i n expressed sequen ce tags fro m bar ley , m ai ze , rice , sorghum and w heat J .P lant M ol ecular B iol ogy , 2002, 48:501-510.5 M u rry HG, Tho m pson W F . Rap i ds i solati on of h i gh m olecu l ar w eight p l an t DNA J .Nucle i c A ci d s R ese a rch , 1980, 8: 4321-4325.6 Bass a m BJ , Caetano Anoll G, G resshoff P M. Fast and sen si tive silver st a i n i ng ofDNA i n polyacry l a m i de gels J.Ana l yt ical B ioc h e m istry , 1991, 196:80-83.7 许绍斌 , 陶玉 芬 , 杨 昭庆 , 等 . 简单 快速的 DNA 银 染和 胶 保存方法 J.遗传 , 2002, 24(3:335-336.(责任编辑 张 韵 %730%浙江农业学报 第 22卷 第 6期 (2010年 11月