DB32_T 3367-2018水稻细菌性条斑病监测与检测技术规程.pdf

ICS 65.020B16备案号：58103-2018DB32江苏省地方标准DB 32/T 33672018水稻细菌性条斑病监测与检测技术规程Technical specification for monitoring and detection for bacterial leaf streak of rice2018-2-10 发布2018-3-10 实施江苏省质量技术监督局发 布DB32/T 33672018I目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14监测与检测条件.14.1主要试剂.24.2用具及仪器.25监测技术.25.1监测范围.25.2监测方法.26检测技术.36.1样品处理.36.2检测方法.37结果判定和报告.37.1结果判定.47.2结果报告.48样品处理和样品、菌种保存.49疫情处治.4附录 A（资料性附录）试剂及培养基的配制方法.5附录 B（资料性附录）水稻细菌性条斑病基本信息.8附录 C（资料性附录）Padlock 探针结合斑点杂交检测程序.9附录 D（资料性附录）水稻细菌性条斑病疫情监测记录表.11附录 E（规范性附录）植物有害生物样本鉴定报告.12DB32/T 33672018II前言本标准按GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构及编写给出的规则起草。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准主要起草人：刘凤权、赵延存、徐会永、赵杨扬、龚伟荣、田子华。DB32/T 336720181水稻细菌性条斑病监测与检测技术规程1范围本标准规定了水稻细菌性条斑病的监测与检测技术方法。本标准适用于水稻细菌性条斑病发生区及杂交水稻制种区。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.2-1995农作物种子检验规程 扦样GB 8371-2009水稻种子产地检疫规程GB/T 28078-2011水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌检疫鉴定方法NY/T 2287-2012水稻细菌性条斑病菌检疫检测与鉴定方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1检疫性有害生物 quarantine pest对受其威胁的地区具有潜在的经济重要性，但未在该地区发生，或虽已发生但分布不广并进行官方防治的有害生物。3.2疫区 epidemic area由官方划定已发现有检疫性有害生物危害并由官方控制的地区。3.3监测 surveillance对某种疫病的发生、流行、分布及相关因素进行系统的长时间的调查与检测，以掌握该疫病的发生发展趋势。3.4检测 test为确定是否存在有害生物或为鉴定有害生物种类而进行的，除目测以外的检查。4监测与检测条件DB32/T 3367201824.1主要试剂磷酸氢二钠（Na2HPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、碘化钾（KI）、碘（I2）、氯化钾（KCl）、氢氧化钠（NaOH）、碳酸氢二钠（Na2HCO3）、氯化钠（NaCl）、叠氮化钠（NaN3）、氯化镁（MgCl2）、七水硫酸镁（MgSO47H2O）、对硝基苯磷酸二钠（PNPP）、草酸铵(NH4)2C2O4、顺丁烯二酸（C4H4O4）、十二烷基硫酸钠（SDS）、柠檬酸三钠、吐温-20、Tris碱、Tris-HCl、硼酸、结晶紫、番红、EDTA、无水乙醇、琼脂糖、DIG DNA Labeling Kit(Roche)、市售抗体、市售酶标抗体、脱脂奶粉、PCR试剂。监测和检测过程中所需溶液及培养基配方，参见附录A。除另有规定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂。4.2用具及仪器采集夹、采集袋、标本夹、标本纸、剪刀、纸袋、放大镜、镊子、刀片、标签纸、超净工作台、高压灭菌锅、培养箱、显微镜、低温冷冻高速离心机、酶标仪、电泳仪、常规PCR仪、凝胶成像系统、超纯水仪、移液器、GPS等。5监测技术5.1监测范围重点监测杂交水稻制种基地、病害发生区、水稻种子调运过程。5.2监测方法5.2.1种子监测5.2.1.1调运种子的监测对调运种子，特别是从疫情发生区调往非疫区的杂交水稻种子，查阅调运种子的品种、产地、发病史、检疫等信息，按照GB/T 3543.2-1995中5的要求进行抽样，对疑似带菌种子进行室内检测。5.2.1.2市场销售种子的监测对市场销售种子，特别是疫区市场销售种子，查阅种子生产流通信息及品种发病历史等信息，观察种子的外观，按照GB/T 3543.2-1995中5的要求进行抽样，将样品进行室内检测。5.2.2田间监测5.2.2.1杂交水稻制种基地田间监测秧田期踏查1次，拔节至抽穗期至少踏查2次，乳熟期踏查一次，特别是在台风暴雨前后要及时进行踏查。每个品种均要踏查，踏查面积占总面积的50%以上，踏查方法参照GB 8371-2009中8.1的要求执行。调查过程中，发现具有水稻细菌性条斑病典型症状（见附录B），即可认定为水稻细菌性条斑病；对疑似症状的叶片，直接采样进行室内检验。5.2.2.2疫区田间监测根据种植地发病史和栽培品种发病史，选择有代表性的田块进行定期踏查。秧田期踏查1次，拔节至抽穗期至少踏查2次，特别是在台风暴雨前后要及时进行踏查。发现初始发病点后，要对该发明点附近田块和该区域（以县、区为单位）内感病品种进行普查。在调查过程中，发现具有水稻细菌性条斑病典型症状（见附录B），即可判定为水稻细菌性条斑病；对疑似症状的叶片，直接采样进行室内检验。DB32/T 3367201835.2.2.3非疫区田间监测选择区域内具有代表性的杂交水稻田块，秧田期踏查1次，拔节至抽穗期踏查2次。在调查过程中，发现具有水稻细菌性条斑病疑似症状叶片（见附录B），直接采样进行室内检验。对疑似发病地点周边田块和该区域（以县、区为单位）内种植该品种田块进行踏查，踏查面积占总面积的30%以上。6检测技术6.1样品处理6.1.1种子样品处理水稻种子样品的处理参照GB/T 28078-2011中8.1的要求执行。6.1.2叶片样品处理水稻叶片样品的处理参照GB/T 28078-2011中8.2的要求执行。6.2检测方法6.2.1常规检测6.2.1.1菌溢检查切取田间采回的植株叶片病健交界处约20 mm2，平放在载玻片的水滴中，加盖玻片后，在低倍显微镜下观察并记录有无喷菌现象。6.2.1.2形态特征检测将样品提取液分别划线于NA和NBY培养基上，28培养2 d3 d，参照附录B.3的标准执行。6.2.1.3革兰氏染色检测按照NY/T 2287-2012中7.2.3的要求执行。6.2.1.4致病性测定参照GB/T 28078-2011中12的要求执行。6.2.2Padlock 探针结合斑点杂交检测水稻细菌性条斑病Padlock探针结合斑点杂交检测程序参见附录C。6.2.3PCR 检测参照NY/T 2287-2012中7.4的要求执行。6.2.4ELISA 检测参照GB/T 2287-2012中7.3的要求执行。如采用市售的试剂盒，按说明操作。7结果判定和报告DB32/T 3367201847.1结果判定7.1.1症状识别判定田间植株发病症状符合附录B描述的水稻细菌性条斑病典型症状，判定为水稻细菌性条斑病。7.1.2常规检测结果判定镜检有菌溢现象，分离培养物形态特征和培养特性符合水稻细菌性条斑病菌的形态特征（参见附录B），革兰氏染色阴性，致病性测定产生典型症状，并再次从接种病斑成功分离病原菌，确定病原菌为水稻细菌性条斑病菌。7.1.3Padlock 探针结合斑点杂交检测结果判定观察斑点杂交尼龙膜显色结果，阳性对照显色，且阴性对照不显色的前提下，待测样品显色，即可判定样品携带水稻细菌性条斑病菌；否则为阴性反应，即样品不携带水稻细菌性条斑病菌。7.1.4PCR 检测结果判定观察电泳结果，阳性对照在338 bp处有条带出现，且阴性对照无条带出现的前提下，待测样品在338bp处有条带出现，即可判定样品携带水稻细菌性条斑病菌；否则为阴性反应，即样品不携带水稻细菌性条斑病菌。7.1.5ELISA 检测结果判定在阴性对照OD值0.1，且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下，样品孔OD值大于阴性对照OD值2倍时，判定为阳性反应，即样品携带水稻细菌性条斑病菌；否则判定为阴性反应，即样品不携带水稻细菌性条斑病菌。7.2结果报告7.2.1监测报告记录监测结果并填写疫情监测记录表（见附录D）。对监测结果进行整理汇总，形成监测报告。7.2.2鉴定报告将实验室检测鉴定结果填入植物有害生物样本鉴定报告（见附录E）。8样品处理和样品、菌种保存监测与检测过程中使用的有关材料和用具，在使用完毕后应进行消毒和除害处理。经检测鉴定后的种子样品应在4 下保存三个月；保存期满后，进行灭活处理。分离鉴定的水稻细菌性条斑病菌利用25%甘油保存于-80。9疫情处治经监测或室内检测发现水稻细菌性条斑病，应指导生产、销售和个人实施检疫处治及病害防治。DB32/T 336720185AA附录A（资料性附录）试剂及培养基的配制方法A.1革兰氏染色液A.1.1结晶紫液A液：结晶紫 2 g，95%乙醇 20 mL；B液：(NH4)2C2O40.8 g，蒸馏水80 mL。使用前将A、B液相混，静置48 h后使用。A.1.2碘液I21 g，KI 2 g，蒸馏水 300 mL，将KI溶于少量蒸馏水中，然后加入I2，待I2全部溶解后，加水稀释至300 mL。A.1.3番红花红液2.5%番红花红乙醇溶液10 mL，蒸馏水100 mL。A.2样品提取液取1.15 g Na2HPO4、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4、8 g NaCl、0.2 g NaN3，用1 000 mL蒸馏水溶解，并调整pH值到7.4。A.3Padlock探针结合斑点杂交检测A.3.1中和缓冲液取87.66 g NaCl、78.8 g Tris-HCl，用蒸馏水溶解并定容至1 000 mL，并调整pH值到7.2。A.3.2碱性转移液取16 g NaOH、58.44 g NaCl，用蒸馏水溶解并定容至1 000 mL。A.3.3Maleic acid Buffer取11.61 g 顺丁烯二酸、8.77 g NaCl，用蒸馏水溶解并定容至1 000 mL，并调整pH值到7.5。A.3.4Detection Buffer取15.76 g Tris-HCl、5.84 g NaCl，用蒸馏水溶解并定容至1 000 mL，调整pH值到9.5，然后121湿热灭菌20 min。A.3.520SSC取175.32 g NaCl、88.23 g 柠檬酸三钠，用蒸馏水溶解并定容至1 000 mL，调整pH值到7.0，然后121湿热灭菌20 min。DB32/T 336720186A.3.6预杂交液Roche DIG杂交试剂盒中的7号液。A.3.7杂交液标记探针按照25 ng/mL终浓度加入到预杂交液（现配现用）。A.3.8洗脱液A取100 mL 20SSC、5 g 十二烷基硫酸钠，用蒸馏水定容至1 000 mL（现配现用）。A.3.9洗脱液B取10 mL 20SSC、5 g 十二烷基硫酸钠，用蒸馏水定容至1 000 mL（现配现用）。A.3.10Washing Buffer取11.61 g 顺丁烯二酸、8.77 g NaCl、3 mL Tween-20，用蒸馏水溶解并定容至1 000 mL，调整pH值到7.5（现配现用）。A.3.111Blocking solution用Maleic acid buffer 10倍稀释Roche DIG杂交试剂盒中的6号液（现配现用）。A.3.12Antibody solution按1:5000比例用Blocking solution 稀释Roche DIG杂交试剂盒中的4号液（现配现用）。A.3.13Clor-substrate solution取Roche DIG杂交试剂盒中的5号液200 L，用Detection Buffer 补足至10 mL（现配现用）。A.4PCRA.4.1PBS缓冲液在930 mL蒸馏水中按次序慢慢加入1.15 g Na2HPO4、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4、8.0 g NaCl、0.2 gNaN3、调节pH至7.4，加蒸馏水定容至1 000 mL。A.4.2电泳缓冲液TBE在1 000 mL去离子水中加入Tris碱 54 g、硼酸27.5 g、20 mL 0.5 M EDTA（pH8.0），使用时利用去离子水10倍稀释，即为0.5TBE。A.4.3琼脂糖凝胶在0.5TBE工作液中加入1%(w/v)的琼脂糖，融化，冷却至60倒入插入梳子的制胶槽中，冷却凝固后点样电泳。A.4.4样品缓冲液取溴百里酚蓝0.025 g，乙二醇3 g，加10 mL蒸馏水。DB32/T 336720187A.5ELISAA.5.1洗涤液取1.15 g Na2HPO4、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4、8 g NaCl、0.5 g吐温-20，用蒸馏水溶解并定容至1 000 mL，调整pH值到7.4。A.5.2封闭液取5 g脱脂奶粉，用100 mL样品提取液溶解。A.5.3包被液取2.93 g Na2HCO3、1.59 g NaCl、0.2 g NaN3，用1 000 mL蒸馏水溶解，并调pH值到9.6。A.5.4抗体稀释液取2.5 g 脱脂奶粉、加100 mL洗涤液溶解。A.5.5底物缓冲液用80 mL灭菌蒸馏水将0.01 g MgCl2、0.02 g NaN3、9.7 mL CH2CH2OH溶解后，调整pH值到9.8，用灭菌水定容至100 mL。A.5.6底物溶液取5 mg PNPP 溶解于5 mL底物缓冲液中。底物溶液制备需在孵育结束前10 min制备，避光保存。A.5.7终止液取12 g NaOH，用100 mL蒸馏水溶解。A.6NBY培养基取牛肉浸膏8.0 g，酵母提取物2.0 g，K2HPO42.0g，KH2PO40.5g，葡萄糖2.5g，琼脂15g，加水定容至1 000 mL，121 湿热灭菌20 min，灭菌后加1 mL过滤除菌的1 M MgSO47H2O溶液。A.7NA培养基取聚蛋白胨5 g，蔗糖10 g，酵母提取物1 g，牛肉浸膏3 g,琼脂15 g，加水定容至1 000 mL，调pH至7.0，121 湿热灭菌20 min。DB32/T 336720188BB附录B（资料性附录）水稻细菌性条斑病基本信息B.1分类地位水稻细菌性条斑病菌Xanthomonas oryzaepv.oryzicola(Fang et al.)Swings et al.,1990 属于原核生物界（Procaryotae），薄壁菌门（Gracilicutes），假单胞菌科（Pseudomonadaceae），黄单胞菌属（Xanthomonas），水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）的一个致病变种（稻黄单胞菌稻生致病变种），在水稻（Oryza sativa）上引起细菌性条斑病（Bacterial leaf streak），属国内植物检疫性有害生物（B类）。B.2形态特征菌体短杆状，大小(0.40.6)m(1.12.0)m；无芽孢和荚膜，菌体外具粘质的胞外多糖包围；单生，很少成对，不呈链状；极生鞭毛一根；革兰氏染色阴性，好气。B.3生物学特性病菌最适生长温度25 28，生长温限8 38。在选择性培养基上开始生长或3 d后观察菌落形态特征。在NA培养基上，菌落平滑，不透明，有光泽，圆形，凸起，边缘完整；初始为白色，后变为浅黄色，培养3 d后直径达到1 mm2 mm。在NBY培养基上的菌落形态为：浅黄色，圆形，凸起，粘液状。B.4田间症状特征整个水稻生育期的叶片均可受害。病菌从水稻叶片气孔或伤口侵入，初期显症为暗绿色水渍状半透明小斑点，后沿叶脉扩展形成暗绿色或黄褐色纤细条斑，宽0.5 mm1 mm，长3 mm5 mm，单个病斑可扩大到宽1 mm、长10 mm以上。湿度大时，病斑上生出许多细小的露珠状深蜜黄色菌脓，干燥后呈鱼籽状。病斑通常被局限在叶脉之间，对光观察呈半透明状。病情严重时，多个条斑融合、连接在一起，形成不规则的黄褐色至枯黄色斑块，田间远看一片火红色。叶片典型症状参见图B.1。图 B.1水稻细菌性条斑病的典型症状DB32/T 336720189CC附录C（资料性附录）Padlock 探针结合斑点杂交检测程序C.1制样C.1.1种子样品取样品种子20 g，首先用蒸馏水冲洗以去除残片和表面的污染杂菌；将清洗后的种子用小型粉碎机粉碎10 s，使谷壳破裂，然后用25 mL样品提取液4 浸泡2 h；将侵泡液10 000 r/min离心10 min，弃上清，重复离心1次，沉淀用蒸馏水悬浮定容至1 mL，作为待检测模板。C.1.2叶片样品将田间采回的植株叶片先用无菌水洗2次，再用75%乙醇表面消毒15 s。将样品剪成20 mm2小片，装入烧杯中，按照供试样品质量（g）:样品提取液体积（mL）=1:20的比例加入样品提取液，4 浸泡20 min；取10 mL侵泡液10 000 rpm离心10 min，弃上清，重复离心1次，沉淀用蒸馏水定容至1 mL，作为检测模板。C.2探针的链接与外切酶处理C.2.1Padlock探针（田艳丽，2009）5-CCACACAACACGGCATATCGCTCCAAGGCTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGATGTACCGCTATCGTGCGGCATACGTTGCGGCATACGTTCGTCAAATCGTCAAATGGTGGCTTTGTACC-3C.2.2探针的链接采用三种外切酶EcoR、Hind和BamH消化待连接的DNA检测模板，连接采用10 L体系：1 L经内切酶消化的检测模板，1 L padlock探针（100 pm/L），0.2 L TaqDNA连接酶（20 U/L），1 L鲑鱼精DNA（20 ng/L），6.8 L灭菌超纯水。连接反应程序为：95 预变性5 min；然后进入循环，95 变性30 s，65 连接5 min，共20个循环；然后95 灭活15 min。C.2.3链接产物的外切酶处理采用核酸外切酶切除自连和错连的探针：在连接后的产物中加入2个单位的核酸外切酶和2个单位的核酸外切酶，37 反应2 h，然后将反应后的产物95 灭活3 h。C.2.4探针的扩增采 用 经 地 高 辛 标 记 的 通 用 引 物 P1-F（5-CTCGACCGTTAGCAGCATGA-3）和 P2-R（5-CCGAGATGTACCGCTATCGT-3）对连接产物进行PCR扩增，25 L反应液体系：0.5 M P1-F和P2-R，4种dNTP各50 M，2.5 L 10PCR反应缓冲液，2 mM Mg2+，2.5 L 1%BSA，1.25 U Tag酶（TaKaRa），3 L经核酸外切酶处理后的连接产物，灭菌超纯水补足。反应程序为：94 预变性5 min；然后进入循环，94 变性30 s，60 退火30 s，72 延伸30 s，共35个循环；最后72 延伸7 min。反应结束后取5 L扩增产物于2.5%琼脂糖凝胶、100 V条件下电泳30 min，在凝胶成像系统上检测并拍照。DB32/T 3367201810C.3斑点杂交检测C.3.1点样根据待检测样品量，剪取一块适合的尼龙膜，剪下一角作为标记；取4 L（50 ng/L）cZipCode探针（CGCCGTATGCAAGCAGTTTA）点到尼龙膜上，每一个样品设4个重复，以不能与padlock探针ZipCode序列互补的核酸序列作为阴性对照，以已知水稻细菌性条斑病菌菌株（例如Rs105）DNA为阳性对照。C.3.2紫外交联固定在干净的玻璃平板上放置一张比尼龙膜稍大的Whatman滤纸，用中和缓冲液充分润湿滤纸，将点样后尼龙膜置于上面放置4 min；然后将尼龙膜放在干净的滤纸上自然干燥（至少30 min），再将尼龙膜放在杂交炉中（点样的一面朝上）紫外交联5 min。C.3.3预杂交将尼龙膜放在杂交管中，迅速加入5 mL预热到72 的预杂交液，72 预杂交（4060）min。C.3.4杂交将PCR扩增产物沸水浴5 min后迅速置于冰水混合液中；将预杂交液5 mL预热到72，迅速加入20L变性后的PCR扩增产物，混匀后快速加到杂交管中，42 杂交过夜。C.3.5洗膜将洗脱液A和洗脱液B预热到68，首先用洗脱液A在室温下轻摇洗膜2次，每次5 min；然后用洗脱液B 68 洗膜2次，每次15 min；最后将膜在室温下置于Washing Buffer中轻摇洗涤2 min。C.3.6显色将膜转移到盛有30 mL封闭液（1Blocking solution）的培养皿室温静置30 min；接着转移到盛有20 mL含抗体的封闭液（Antibody solution）中室温静置30 min；用Washing Buffer洗两次，每次15min，缓慢摇动；在20 mL Detection Buffer中平衡5 min，缓慢摇动；用新配制的显色底物溶液（Clor-substrate solution）15 mL温浴膜，黑暗显色处理（26）h；待观察到理想的显色后，用灭菌超纯水浸泡10 min终止反应，并进行拍照。通过膜上的地高辛标记信号来判断样品中是否携带水稻细菌性条斑病菌。DB32/T 3367201811DD附录D（资料性附录）水稻细菌性条斑病疫情监测记录表调查单位：调查时间：编号水稻品种调查地点调查样方疑似症状表现样方监测（检测）结果调查人（签字）：DB32/T 3367201812EE附录E（规范性附录）植物有害生物样本鉴定报告植物名称品种名称植物生育期样品数量取样部位样品来源送检日期送检人送检单位联系电话检测鉴定方法：检测鉴定结果：备注：鉴定人（签名）：审核人（签名）：鉴定单位盖章：年月日注：本单一式三份，检测单位、受检单位和检疫机构各一份。_