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ICS 07.080 CCS A 40 32 江苏省地方标准 DB 32/T 39792021 实验用 斑马鱼 饲育技术条件 Technical requirements for breeding laboratory zebrafish 2021-02-03 发布 2021-03-03 实施 江苏省市场监督管理局 发 布 DB32/T 3979-2021 I 目次 前言.III 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 饲育鱼房工艺布局.1 4.1 饲育鱼房总体要求.1 4.2 饲育鱼房功能分区.2 5 饲育设施.2 5.1 流水饲育系统.2 5.2 静水饲育系统.3 6 饲育环境条件.3 6.1 温度.3 6.2 湿度.3 6.3 空气.3 6.4 环境噪音.3 6.5 光照.3 6.6 饲育用水.4 6.7 流水循环速度.4 6.8 日换水量.4 7 饲育密度与饵料及饲喂.4 7.1 饲育密度.5 7.2 饲育饵料.5 7.3 饲喂.5 8 繁育和遗传资源保存.5 8.1 繁育安排.5 8.2 新创制遗传资源保存.5 9 伦理维护.6 9.1 福利保障.6 9.2 饲育人员技能.6 9.3 生长记录.6 9.4 标识.6 9.5 安乐死.6 10 质量规范.6 10.1 实验用斑马鱼来源.6 10.2 胚胎的质量.6 10.3 仔鱼的质量.6 10.4 幼鱼与成鱼的质量.6 DB 32/T 39792021 II 附录 A（资料性）草履虫培育.8 附录 B（资料性）丰年虫幼虫孵化及脱盐处理.9 参考文献.10 DB32/T 3979-2021 III 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省实验动物标准化专业技术委员会提出并归口。本文件起草单位：南京尧顺禹生物科技有限公司。本文件主要起草人：赵庆顺、池军、王明开、张琼。DB32/T 3979-2021 1 实验用 斑马鱼 饲育技术条件 1 范围 本文件规定了实验用 斑马鱼 饲育技术条件的饲育鱼房工艺布局、饲育设施、饲育环境条件、饲育密度与饵料及饲喂、繁育和遗传资源保存、伦理维护以及质量规范。本文件适用于实验用斑马鱼的饲育。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 18883 室内空气质量标准 GB/T 31962 污水排入城镇下水道水质标准 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 斑马鱼胚胎 zebrafish embryo 未出壳膜的斑马鱼胚胎，一般指0 dpf3 dpf（days post fertilization；受精后天数）的斑马鱼胚胎。3.2 斑马鱼仔鱼 zebrafish larva 出壳膜后至发育到未成为幼鱼之前的斑马鱼，一般指4 dpf28 dpf的斑马鱼。3.3 斑马鱼幼鱼 juvenile zebrafish 外部形态与成鱼相似但未性成熟的斑马鱼，一般指 29 dpf84 dpf的斑马鱼。3.4 成年斑马鱼 adult zebrafish 性成熟、具备繁殖能力的斑马鱼。一般指年龄大于84 dpf的斑马鱼。4 饲育鱼房工艺布局 4.1 饲育鱼房总体要求 独立空间，净高度不宜低于250 cm；地面防潮、防水、防滑、耐冲击、平整；墙壁光滑、耐潮、不吸水、抗击碰性损坏、无缝隙。DB 32/T 39792021 2 4.2 饲育鱼房功能分区 包括去离子水制备区、循环系统流水处理区、饲育区、饵料生产区、储存区、清洁区、隔离区和实验区。4.2.1 去离子水制备区 将符合GB 5749生活饮用水卫生标准要求的水进行反渗处理制备成去离子水的区域，可位于饲育鱼房外独立空间。4.2.2 循环系统流水处理区 对饲育用水进行过滤、紫外消毒、充气、pH调节和电导率调节等集中区，可独立于饲育鱼房外。4.2.3 饲育区 日常繁育斑马鱼的饲育区应配备流水饲育设施饲育仔鱼、幼鱼与成年鱼；配备静水饲育设施饲育胚胎、仔鱼以及用于亲鱼繁育。4.2.4 饵料生产区 包括培育开口饵料草履虫的草履虫生产区和孵化丰年虫幼虫的丰年虫卵孵化区。分别配置供培育草履虫的容器和供孵化丰年虫卵的专用孵化设备。4.2.5 储存区 配备冰箱存放斑马鱼饵料。4.2.6 清洁区 设有清洁用水池以及鱼捞等渔具存放区。4.2.7 隔离区 外来的斑马鱼应饲养在独立于日常繁育饲育区之外的隔离区，胚胎经消毒处理后方可进入日常繁育饲育区。4.2.8 实验区 4.2.8.1 进行实验处理的斑马鱼应饲育在独立于斑马鱼日常繁育饲育区外的实验区，可位于饲育鱼房外的实验室内。4.2.8.2 仅为完成遗传改造而实施过显微注射的斑马鱼胚胎或仅用于简单显微形态学观测以评估质量的斑马鱼可回到日常繁育饲育区。4.2.8.3 所有经实验处理的斑马鱼（包括胚胎、仔鱼、幼鱼和成鱼）不应回到日常繁育饲育区。完成实验后通常需要进行安乐死。5 饲育设施 5.1 流水饲育系统 5.1.1 饲育架 DB32/T 3979-2021 3 应由不锈钢或其它防水防锈等无毒材料制成，层距不低于35 cm。5.1.2 饲育缸 5.1.2.1 材质要求无毒、无害、无放射性、耐腐蚀、耐高温、耐高压、耐冲击、易清洗、易消毒灭菌。5.1.2.2 饲育缸由饲育盖板、饲育缸体以及饲育后插板组成。5.1.2.3 饲育盖板设饵料投喂孔、流水单管孔和备用孔。5.1.2.4 饲育缸体配有双卡槽，可同时插入防仔鱼和幼鱼逃逸后插板以及导污后插板。5.1.3 循环净化设备 包括过滤处理单元、水体循环设备、消毒单元、充气补氧单元、PLC自动化控制集成单元、给排水分配单元、生物净化水槽、系统流量监控单元、pH控制单元和电导率控制单元。5.2 静水饲育系统 5.2.1 饲育架 同5.1.1。5.2.2 交配缸 内外胆结构，材料要求与饲育缸（5.1.2）一致；内胆底部高于外盒底部2 cm，并配有分离隔板和盖板。5.2.3 饲育缸 同5.2.2，但无内胆和分离隔板。6 饲育环境条件 6.1 温度 室温23 30，24 h内变动不超过2.5。水温25 29，24 h内变动不超过1.0。6.2 湿度 相对湿度为45%70%。6.3 空气 空气质量符合GB/T 18883室内空气质量标准。另需有新风输入，至少每4 h5 h 输入1次，每次空气交换量是整体空间的2倍体积。6.4 环境噪音 低于70 dB。6.5 光照 DB 32/T 39792021 4 采用14 h光照10 h黑暗的方式饲养。光照时间内，饲育鱼房内和鱼缸水面光照强度均为54 lx 324 lx。6.6 饲育用水 6.6.1 电导率 450 S/cm550 S/cm。6.6.2 pH pH 6.5pH 8.0。6.6.3 氨氮 含量0.02 mg/l。6.6.4 盐度 含量为0.30.5。6.6.5 亚硝酸盐 含量0.2 mg/l。6.6.6 硝酸盐 含量5 mg/l。6.6.7 溶解氧 含量为5 mg/l8 mg/l。6.6.8 二氧化碳 含量为5 mg/l。6.6.9 硬度 50 mg/l100 mg/l。6.7 流水循环速度 小于10 dpf的仔鱼所在鱼缸的水流速度应小于10 ml/min，10 dpf至28 dpf仔鱼所在鱼缸的水流速度为50 ml/min80 ml/min，幼鱼和成鱼鱼缸水流速度100 ml/min150 ml/min。6.8 日换水量 6.8.1 日排水量为系统总水量的 2%10%，根据系统中所负荷鱼量适当增加。6.8.2 日常繁育斑马鱼的饲育用水符合 GB/T 31962污水排入城镇下水道水质标准，可直接排入城镇下水道。6.8.3 实验区内用于斑马鱼实验处理的饲育用水应按照生物类实验室的要求处理，不应直接排入城镇下水道。7 饲育密度与饵料及饲喂 DB32/T 3979-2021 5 7.1 饲育密度 7.1.1 胚胎饲育密度 10 ml饲育用水饲育的胚胎数不超过50 枚。7.1.2 仔鱼饲育密度 4 dpf17 dpf仔鱼的饲育密度不超过40 尾/l、大于18 dpf的仔鱼饲育密度不超过20 尾/l。7.1.3 幼鱼饲育密度 不超过6 尾/l。7.1.4 成鱼饲育密度 5 尾/l。7.2 饲育饵料 7.2.1 斑马鱼饵料包括草履虫活体和丰年虫幼虫活体，可自行培育或购买。7.2.2 草履虫培育方法见附录 A。培育出的草履虫活体直接用于斑马鱼仔鱼的饲喂。7.2.3 丰年虫幼虫孵化方法见附录 B。孵化出的幼虫经脱盐处理后用于斑马鱼的饲喂。7.3 饲喂 7.3.1 饲喂总则 斑马鱼的每日饲喂次数为2次4次。7.3.2 饲喂量 7.3.2.1 发育时期为 4 dpf6 dpf 仔鱼，每次按草履虫 1105 个/l3105 个/l 投喂。发育时期为 7 dpf10 dpf 仔鱼，以草履虫和丰年虫幼虫混合喂饲，草履虫每次投喂密度为 3105 个/l 5105 个/l，丰年虫为 1104 个/l4104 个/l，依发育时间逐步提高丰年虫比例。发鱼时期为 11 dpf28 dpf 仔鱼，以丰年虫幼虫饲喂，饲喂量为约 3104 个/l4104 个/l。7.3.2.2 幼鱼每次投喂丰年虫幼虫 5 104 个/l9 104 个/l。7.3.2.3 成鱼每次投喂丰年虫幼虫 1 105 个/l3 105 个/l。8 繁育和遗传资源保存 8.1 繁育安排 使用交配缸进行斑马鱼交配繁育。亲本的雌雄比例为雌2尾雄1尾2尾，一个交配缸内最多不超过 7尾鱼。8.2 新创制遗传资源保存 根据国家斑马鱼资源中心的要求填写相关表格，向国家斑马鱼资源中心递交新创制的基因组改造的详细遗传信息；同时递交新创制的基因型和遗传背景明确的斑马鱼成鱼，用于国家斑马鱼资源中心保存。DB 32/T 39792021 6 9 伦理维护 9.1 福利保障 应制定斑马鱼使用与管理的具体规章制度；不应执行任何不符合动物伦理学规范的斑马鱼使用与管理方案。9.2 饲育人员技能 斑马鱼生产与使用人员应在上岗前接受专业培训，了解斑马鱼繁殖生物学的基本知识、饲育规范以及使用与管理规范等。9.3 生长记录 记录每日的水温、室温、湿度、饲喂、清洁、整理、鱼缸清洗、受精卵收集、草履虫饲育和丰年虫幼虫孵化情况等。9.4 标识 黏贴在饲育缸或交配缸外的斑马鱼标签的信息应包括：动物的受精日期、基因型和传代代数等内容。9.5 安乐死 将斑马鱼置于冰水混合物中快速预冷2 min后，放入-20 冰箱冻存。斑马鱼安乐死后应及时转移至饲育鱼房外的专用斑马鱼尸体存放冰箱的冷冻室中冻存，集中进行无害化处理。10 质量规范 10.1 实验用斑马鱼来源 实验用斑马鱼的遗传背景应该明确。不应饲育遗传背景不明的斑马鱼；不应使用来源于宠物市场的斑马鱼。10.2 胚胎的质量 应具备与发育时期一致的正常的显微形态学特征。10.3 仔鱼的质量 10.3.1 应从壳膜中孵出，具正常的显微形态学特征，可在水中自由游泳。10.3.2 4 dpf 仔鱼鱼鳔的后部腔室开始充气。约 20 dpf，仔鱼鱼鳔的前部腔室开始充气。约 21 dpf 时，鱼鳔前后两个腔室的充气完成。10.4 幼鱼与成鱼的质量 10.4.1 健康的斑马鱼应保持充分放松的姿态以与水面平行的方式在水中游泳。10.4.2 斑马鱼的正常行为包括均匀的呼吸（通过活动鳃盖）、以及保持对游泳和捕食运动的兴趣。10.4.3 斑马鱼生病的特征包括体重与体长的比例下降、急促的呼吸、明显的身体组织的损伤（溃DB32/T 3979-2021 7 疡、外伤）、以及体色、体型和运动方式等的改变。当斑马鱼急速翻身、向一侧倾斜、或者与水面垂直也可以作为生病的特征。10.4.4 表现出异于正常斑马鱼行为的基因组改造斑马鱼突变体，不应视作病鱼。10.4.5 生病的斑马鱼通常要进行及时的安乐死。10.4.6 如果病鱼十分珍贵，可将病鱼转移至隔离区隔离治疗。DB 32/T 39792021 8 A A 附录A （资料性）草履虫培育 在3 l缸中加入0.1 g 氯化钠（分析纯）和约5粒大麦粒，倒入1.5 l2 l 煮沸去离子水后混匀，放置室温待用，待溶液降至室温后加入0.1 g酵母粉摇匀备用，吸取母液10%作为种子液，加入混合好的新鲜培养液中，室温下培养1周，于体视显微镜下检测培养效果，一般可达到2,000 个/ml的草履虫，此时可直接使用。3周4周后需利用种子液，再行培养新鲜草履虫。DB32/T 3979-2021 9 B B 附录B （资料性）丰年虫幼虫孵化及脱盐处理 丰年虫幼虫是通过购买市售的丰年虫休眠卵孵化而来。孵化使用符合GB 5749生活饮用水卫生标准要求的市政自来水配制的溶液完成。孵化溶液含盐量（使用50目以下的细海盐或孵化专用海盐）为1.5%2.5%；pH 8.0pH 8.2（使用NaHCO3调节pH）；虫卵密度为3 g/l；孵化温度为25 30；孵化时间为24 h30 h。孵化时，位于溶液底部设有充气装置，保证丰年虫休眠卵处于悬浮状态。孵化完成后，拔去充气管，静置沉降10 min15 min，此时丰年虫幼虫会沉至孵化器下部，打开孵化器下部阀门即可收集孵化出的丰年虫幼虫。但此时因为盐度太高还不能直接投喂，需要通过同样的静置沉降的方法再将收集到的丰年虫幼虫用去离子水或流水系统饲育用水洗涤4 次后，方可投喂斑马鱼。DB 32/T 39792021 10 参考文献 1 广东实验动物监测所、中国科学院水生生物研究所、中国水产科学院珠江水产研究所、上海实验动物研究中心、中国医学科学院医学实验动物研究所联合编制，2017。国家标准实验动物鱼类环境与质量控制（征求意见稿）（含实验用鱼 第1部分：遗传质量控制；第二部分：病原学等级及监测；第3部分：饲料；第4部分：环境条件）。2017年7月4日公示。2 北京市质量技术监督局，2014。北京市地方标准 DB11/T 1053.1-2013实验用鱼 第1部分：微生物学等级及监测、DB11/T 1053.2-2013实验用鱼 第2部分：寄生虫学等级及监测微生物学等级及监测、DB11/T 1053.3-2013实验用鱼 第3部分：遗传质量控制、DB11/T 1053.4-2013实验用鱼 第4部分：病理学诊断规范遗传质量控制、DB11/T 1053.5-2013实验用鱼 第5部分：配合饲料技术要求、DB11/T 1053.6-2013实验用鱼 第6部分：环境条件。北京市质量技术监督局2013-12-20发布，2014-04-01实施。3 农业部，2017。病死及病害动物无害化处理技术规范。2017年7月3日发布。4 Jolaine,M.W.,Ralph,M.B.,Carty A.J.,2009.Evaluation of rapid cooling and tricaine methanesulfonate(MS222)as methods of euthanasia in zebrafish(Danio rerio).Journal of the American Association for Laboratory Animal Science.48:785789.5 Kimmel,C.B.,Ballard,W.W.,Kimmel,S.R.,Ullmann,B.,Schilling,T.F.,1995.Stages of embryonic development of the zebrafish.Developmental Dynamics.203:253310.6 Koerber1,A.S.,and Kalishman,J.,2009.Preparing for a semiannual IACUC inspection of a satellite zebrafish(Danio rerio)facility.Journal of the American Association for Laboratory Animal Science.48:65-75.7 National Research Council 2011.Guide for the care and use of laboratory animals:Eighth Edition.Washington,DC:The National Academies Press.https:/doi.org/10.17226/12910.8 Parichy,D.M.,Elizondo,M.R.,Mills M.G.,Gordon,T.N.,Engeszer,R.E.,2009.Normal table of postembryonic zebrafish development:staging by externally visible anatomy of the living fish.Developmental Dynamics.238:2975-3015.9 Winata,C.L.,Korzh,S.,Kondrychyn I.,Zheng,W.,Korzh,V.,Gong Z.,2009.Development of zebrafish swimbladder:The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers.Developmental Biology.331:222-36.