布鲁氏菌侵染抑制剂的合成改造及活性研究.pdf

基金项目：国家自然科学基金资助项目（）；内蒙古自治区自然科学基金（项目号：）通讯作者：郭叶【基础医学】布鲁氏菌侵染抑制剂的合成改造及活性研究吕雅楠，多奕仑，赵嘉玮，董志强，郭叶（内蒙古科技大学包头医学院药学院，内蒙古 包头 ；内蒙古科技大学包头医学院 级研究生；内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院）摘要 目的：研究一种新型抗布鲁氏菌的药物，以求布鲁氏菌病的功能性治愈。方法：通过多肽固相合成法（，）和在液相中进行化学反应等操作，根据布鲁氏菌侵染抑制剂 线性肽结构合成改造了三个环肽，即环 肽、三氮唑丁肽和三氮唑戊肽。通过二硫苏糖醇（，）测试了目标多肽的稳定性，并使用绵羊布鲁氏菌测定多肽的抗菌活性。结果：使用绵羊布鲁氏菌测试了目标肽的最低抑菌浓度（，），测试结果显示，线性 肽、环 肽、三氮唑丁肽和三氮唑戊肽的 值分别为 、。在 存在下，环 肽中的二硫键可发生还原反应，其半衰期为 ，而三氮唑丁肽和三氮唑戊肽对 稳定。结论：经改造得到的环 肽对绵羊布鲁氏菌抑制作用最强，含三氮唑环的丁肽和戊肽的抗菌活性仅次于含有二硫键的环 肽。此外，含有三氮唑环的多肽较含有二硫键的多肽化学性质更为稳定。关键词 布鲁氏菌；多肽固相合成；二硫苏糖醇；活性研究 ：，（，；，；，）：，：，（），（）：（），年第 卷第 期 ：，；布鲁氏菌病是由感染布鲁氏杆菌病原体引起，这是一种人畜共患传染病，它不仅阻碍畜牧业的发展而且还会导致巨大的经济损失 。人类感染布鲁氏菌病可导致关节炎、睾丸炎、肝炎、脑脊髓炎和心内膜炎的发生 ，对重要器官的正常运转产生威胁。通过抗菌药物治疗布鲁氏菌病时间普遍很长，这会导致患者依从性较差，并且可能还会导致一系列的继发感染。因此，临床上迫切地需要一种新型抗布鲁氏菌的药物，以求布鲁氏菌病的功能性治愈。近年来，人们对布鲁氏菌侵染抑制剂的发现和开发给予了极大的关注。年，等 利用噬菌体技术筛选了名为 的线性抗菌肽。肽虽然在小鼠体内外均能抑制布鲁氏菌 株的感染，但遗憾的是 肽活性较差，并不能作为抑制布鲁氏菌感染的良好候选药物。在这一背景下，发展具有更高抗布鲁氏菌活性的新型药物成为当前布鲁氏菌侵染抑制剂研究的重要问题之一。多肽药物是由 个氨基酸残基组成的天然生物活性肽或人工合成生物活性肽 ，其具有特异性强、生物活性高、免疫原性低和在体内不易产生蓄积等优势。随着多肽固相合成技术不断发展成熟和多肽药物在医药领域的广泛应用，使得本研究提升多肽药物的活性成为可能。本研究通过在线性 肽序列氮端和碳端引入二硫键或三氮唑基团合成了一系列具有抗菌活性的多肽药物，并对其抗布鲁氏菌活性和多肽结构稳定性进行测试，活性测试结果表明环 肽对绵羊布鲁氏菌抑制活性最为显著，而含有三氮唑基团的多肽稳定性最强。本文介绍改造多肽药物的方法，希望为今后多肽药物研发提供可靠方向，同时也为其他药物进行抑制布鲁氏菌生物活性的研究提供参考。材料与方法 实验试剂与仪器 保护的氨基酸（上海吉尔生化生物科技公司），树脂（天津南开合成），其余试剂均为市售分析纯。不同规格的合成管和抽滤瓶（探索平台），恒温振荡器（常州国华电器有限公司），型磁力搅拌控温电热套（山东鄄城华鲁电热仪器有限公司），真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司），岛津高效液相 （株式会社岛津制作所），高效液相色谱仪自动进样器 、制备分析色谱仪（），月旭科技（上海）股份有限公司，制备柱（，）。布鲁氏菌侵染抑制剂的合成 线性 肽的合成线性 肽序列为：。使用 树脂（取代度为 ），通过 固相合成技术合成线性 肽。氨基酸的投量为 ，缩合剂 （），的投量为 ，（，）的投量为 。待多肽在树脂上组装完毕后，脱去最后一个氨基酸的 保护基，洗涤树脂并加入 切割试剂（）反应。处理切割试剂后，加入冰甲基叔丁基醚得到白色粗肽。使用 和 对其进行分析鉴定和纯化，设置 内以乙腈 浓度梯度进行制备纯化。线性 肽 计算值：（），（），实测值：（），（）。环 肽的合成环 肽序列为：，其中含有一对二硫键。使用与 年第 卷第 期 合成线性 肽相同投量的树脂，氨基酸和缩合剂通过 固相合成技术合成环 肽。待多肽在树脂上组装完毕后，脱去最后一个氨基酸的 保护基，洗涤树脂并切割，加入冰甲基叔丁基醚得到淡黄色粗肽。称取 环 还原型粗肽于 管中，先加入 磷酸盐缓冲液（，）溶解后再加入 二甲基亚砜（，），将 管置于磁力搅拌机上室温反应 。环 还原肽中的半胱氨酸残基经氧化反应后，折叠形成一对二硫键。使用 和 对其进行分析鉴定和纯化，设置 内以乙腈 浓度梯度进行制备纯化。环 肽 计 算 值：（），（），实测值：（），（）。三氮唑丁肽的合成三氮唑丁肽的序列为：叠氮丁酸 ，其中含有一个三氮唑环。使用与合成线性 肽相同投量的树脂，通过 固相合成技术合成三氮唑丁肽。缩合天然氨基酸时所用投量和缩合剂与合成线性 肽相同。当缩合（）（芴 基）甲氧基）羰基氨基）叠氮丁酸和 时，氨基酸的投量为 ，（），的投量为 ，反应时间为。待所有氨基酸组装完毕后，脱去最后一个氨基酸的 保护基，洗涤树脂并切割，加入冰甲基叔丁基醚得到白色粗肽。称取 （）三氮唑丁肽线性粗肽，（）无水硫酸铜（，）和（）抗坏血酸钠于 管中，加入 溶液溶解后，在室温下反应 后使用 和 对其进行分析鉴定和纯化，设置 内以乙腈 浓度梯度进行制备纯化。三氮唑丁肽 计算值：（），（），实测值：（），（）。三氮唑戊肽的合成三氮唑戊肽的序列为：叠氮戊酸 ，其中含有一个三氮唑环。使用与合成三氮唑丁肽相同投量的树脂，氨基酸和缩合剂通过 固相合成技术合成三氮唑戊肽。待（）叠氮 （芴甲氧羰基 氨基）戊酸缩合完毕后，脱去其 保护基，洗涤树脂并切割，加入冰甲基叔丁基醚得到白色粗肽。称取 （）三氮唑戊肽线性粗肽，（）和 （）抗坏血酸钠于 管中，加入 溶液溶解后，在室温下反应 后使用 和 对其进行分析鉴定和纯化，设置 内以乙腈 浓度梯度进行制备纯化。三氮唑戊肽 计算值：（），（），实 测 值：（），（）。布鲁氏菌侵染抑制剂的抗菌实验通过观察多肽在不同浓度下对细菌菌落生长情况的影响，进一步确定最低抑菌浓度（），从而考察多肽的抗布鲁氏菌活性。绵羊布鲁氏菌株由飞凡生物科技（江苏）有限公司提供。取 代绵羊布鲁氏菌，置于无菌 缓冲液中溶解，使其形成均匀菌悬液。吸取 的 菌悬液，并滴加到制备好的线性 肽、环 肽、三氮唑丁肽和戊肽的梯度药物平板中央，使菌悬液均匀平铺在平板上。同时，分别吸取 的 菌液并接种涂布至四个不加多肽的对照平板上。将接种好的每个平板放入含有 气体环境中培养 ，重复 次实验，读取 值并记录菌落数。布鲁氏菌侵染抑制剂的稳定性实验使用二硫苏糖醇（，）与 配制成的溶液对环 肽以及含有三氮唑基团的丁肽和戊肽进行稳定性测试。将 溶于 溶液中配制成 的储备液，将环 肽以及含有三氮唑基团的丁肽和戊肽分别溶于 溶液中配制成 的储备液。然后将上述多肽储备液分别与 储备液按照 的比例混合均匀，于 水浴条件下孵育。使用 仪器监测各时间段反应液，重复 年第 卷第 期 次实验，计算每个时间点多肽残余比例，并绘制稳定性曲线。结果 布鲁氏菌侵染抑制剂的合成由于线性 肽是通过环七肽库筛选得到的，本研究设想在线性 肽氮端和碳端引入半胱氨酸残基从而形成含有一对二硫键的环 肽，合成路线及质谱信息见图 。图 含一对二硫键的环 肽合成路线及质谱信息本研究构建的含有三氮唑环的丁肽和戊肽（图），旨在探究三氮唑替代二硫键后多肽药物的抗菌活性和稳定性变化情况。选用不同长度的叠氮基，以考察碳链长度是否会对多肽抗菌活性产生影响。图 为含三氮唑环的丁肽和戊肽合成路线，其中（）代表烷基个数，当 时烷基个数为 ，为三氮唑丁肽；当 时烷基个数为 ，即三氮唑戊肽。图 ，分别为三氮唑丁肽和三氮唑戊肽的质谱信息 布鲁氏菌侵染抑制剂的抗菌活性评价通过测定 个多肽在各浓度梯度下对绵羊布鲁氏菌菌落的抑制情况，得到 个多肽药物的 值。如表 所示，含有一对二硫键的环 肽对绵羊布鲁氏菌表现出最高的抗菌活性，值为 ，较线性 肽抗菌活性提高 倍。由此可见，当在线性 肽氮端和碳端分别引入一个半胱氨酸残基并进行氧化反应，所折叠形成的二硫键可以使多肽的抗菌活性显著提高。这对本研究以后开发更多含二硫键的布鲁氏菌侵染抑制剂是富有指导意义 年第 卷第 期 的。此外，含有三氮唑环的丁肽和戊肽同样对绵羊布鲁氏菌表现出较高的抗菌活性，值分别为 和 。本研究发现，当使用三氮唑基团替代肽链中的二硫键之后，肽链的抗菌活性不仅保持下来，且与含有二硫键的目标多肽抗菌活性相近。另外，把两个含有三氮唑环的目标肽 值进行比较，惊喜的发现三氮唑戊肽的抗菌效果要略强于三氮唑丁肽。表 个多肽抑制绵羊布鲁氏菌的 值目标肽名称 （）线性 肽 环 肽 三氮唑丁肽 三氮唑戊肽 布鲁氏菌侵染抑制剂的稳定性结果分析 作为一种高效的硫醇还原剂，常被用于裂解多肽或者蛋白质药物中的二硫键 。可以将多肽中的巯基保持在还原状态，还可用于防止半胱氨酸残基形成分子内或分子间二硫键 。在各时间段下环 肽，三氮唑丁肽和三氮唑戊肽在 中的残余量变化曲线如图 所示。当 的 与 的环 肽反应 后，环 肽峰面积的残余率约为 ，即环 肽的半衰期为 。反应 后二硫键从氧化状态全部转化为还原型半胱氨酸。与三氮唑丁肽和戊肽反应 后，三氮唑丁肽和戊肽的峰面积残余率仍为 。综上所述，不会对含有三氮唑结构的多肽产生影响，且三氮唑结构比含有二硫键的多肽结构更加稳定。图 不同时间点下各目标肽在 中的稳定性图 讨论多肽的环化策略可以降低线性多肽分子的构象自由性，从而使多肽与受体产生更高的亲和力 。环化策略还可以稳定多肽的构象，有效阻止蛋白酶的水解作用 ，使其成为多肽药物开发中的重要化学修饰策略。综上所述，本实验通过化学反应在肽链内部形成二硫键或三氮唑基团，使直链多肽形成环肽。含二硫键多肽多数是从自然界动物毒素中提取得到，代谢产物仍是氨基酸，降解后很少产生毒副作用。二硫键可以稳定肽链避免酶解 ，因此其成为了很有前景的候选药物 。不仅如此，含二硫键多肽还可与某些化合物进行特异性结合，从而调节蛋白质功能 ，达到治疗疾病的目的。目前，有很多含二硫键多肽药物被广泛应用于糖尿病、癌症及贫血的诊断和治疗 。然而，在还原环境、异构酶和亲核试剂的存在下，二硫键并不稳定容易发生还原反应，这会导致整条肽链结构重排，并完全丧失生物活性 。因此，使用更加稳定、非还原性的基团取代二硫键是非常有意义的。近年来，研究人员把目光投向了三氮唑基团，它在维持肽链结构的同时也保证了多肽药物的生物活性。三氮唑基团不仅具有化学正交性，而且对蛋白酶和异构酶都表现出良好的稳定性 。此外，三氮唑可以通过双组分的方法形成，通过用烷基和侧链有叠氮基的氨基酸取代多肽中的两个或多个半胱氨酸残基来定向形成二硫键模拟物 。点击化学反应是炔烃和叠氮化物通过加成反应生成三氮唑，该反应可在温和条件下进行，且向体系中引入铜离子可加快反应速率 。结论本课题以线性 肽 为基础，通过引入二硫键或三氮唑基团，设计合成了 个环肽。对四个所合成肽进行抗菌活性测试，环 肽对绵羊布鲁氏菌抑制作用最为强大，线性 肽抗绵羊布鲁氏菌效果最弱。而含三氮唑环的丁肽和戊肽的抗菌活性仅次于含有二硫键的环 肽，其中三氮唑戊肽连接臂长度较长，抗菌效果优于三氮唑丁肽。此外，通过多肽稳定性测试发现含有三氮唑结构的多肽比含二硫键多肽结构更加稳定。（下转第 页）年第 卷第 期 ，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：（收稿日期：櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂）（上接第 页）总之，本课题研究达到了预期的效果，在二硫键氧化折叠步骤中还可以继续选取更多的工艺参数进行优化，以期得到更优的环 肽合成路线。参考文献 ，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（），：，（）：，（）：，（）：，：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：）年第 卷第 期