61食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验.pdf

中中华华人人民民?和和?家家标标准准GB 4789.102010 食品安全?家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验National food safety standard Food microbiological examination:Staphylococcus aureus 中中 华华 人人 民民?和和?卫卫 生生 部部 发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施GB 4789.102010 I 前 言 本标准代?GB/T 4789.10-2008?食品卫生微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验?和 GB/T 4789.37-2008?食品卫生微生物学检验 金黄色葡萄球菌计数?本标准?GB/T 4789.10-2008 和 GB/T 4789.37-2008 相比，?要修改如?修改了标准的中英文?修改了范围?规范了样品制备过程?增加了计算公式中系数 1.1 的解释?修改了附录 A 中胰酪胨大豆肉汤的?，规范?10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤?增加了第二法金黄色葡萄球菌 Baird-Parker?板计数和第?法金黄色葡萄球菌 MPN 计数?本标准的附录 A?附录 B?附录 C 是规范性附录?本标准所代?标准的历次?本发布情况?GB 4789.10-84?GB 4789.10-1994?GB/T 4789.10-2003?GB/T 4789.10-2008?GB/T 4789.37-2008?GB 4789.102010 1 食品安全?家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验 1 范围 本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌?Staphylococcus aureus?的检验方法?本标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验?第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数?第?法适用于金黄色葡萄球菌含量较?而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数?2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及?养设备外，?他设备和材料如?2.1 恒温?养箱?36 1?2.2 冰箱?2 5?2.3 恒温水浴箱?37 65?2.4 天?感量 0.1 g?2.5 均质器?2.6 振荡器?2.7 无菌吸管?1 mL?0.01 mL 刻度?10 mL?0.1 mL 刻度?或微量移液器及吸头?2.8 无菌锥形瓶?容量 100 mL?500 mL?2.9 无菌?养皿?直?90 mm?2.10 注射器?0.5 mL?2.11 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸?3?养?和试剂 3.1 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤?附录 A 中 A.1?3.2 7.5%氯化钠肉汤?附录 A 中 A.2?3.3 血琼脂?板?附录 A 中 A.3?3.4 Baird-Parker 琼脂?板?附录 A 中 A.4?GB 4789.102010 2 3.5 脑心浸?液肉汤(BHI)?附录 A 中 A.5?3.6 兔血浆?附录 A 中 A.6?3.7 稀释液?磷酸盐缓冲液?附录 A 中 A.7?3.8 营养琼脂小斜面?附录 A 中 A.8?3.9 革?氏染色液?附录 A 中 A.9?3.10 无菌生理盐水?附录 A 中 A.10?GB 4789.102010 3 36 1 18 h24 h 36 1 18 h24 h 第一法 金黄色葡萄球菌定性检验 4 检验程序 金黄色葡萄球菌定性检验程序?1?1 金黄色葡萄球菌检验程序 5 操作步骤 5.1 样品的处理?取 25 g 样品?盛有 225 mL 7.5%氯化钠肉汤或 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000 r/min10000 r/min 均质 1 min2 min，或放入盛有 225 mL 7.5%氯化钠肉汤或 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用?式均质器?打 1 min2 min?若样品?液态，吸取 25 mL 样品?盛有225 mL 7.5%氯化钠肉汤或 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀?5.2 增菌和分离?养 36 1 血?板 18 h24 h Baird-Parker?板 18 h24 h 或 45 h48 h Baird-Parker?板主血?板 检样 25 g(mL)样品+225 mL 7.5%氯化钠肉汤或 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤，均质 血浆凝固?试验 BHI 肉汤和营养琼脂小斜面?察溶血涂?染色 报 告 GB 4789.102010 4 5.2.1 将?述样品匀液于 36 1?养 18 h24 h?金黄色葡萄球菌在 7.5%氯化钠肉汤中呈混?生长，污染?时在 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混?生长?5.2.2 将?述?养物，分别划线接种到 Baird-Parker?板和血?板，血?板 36 1?养 18 h24 h?Baird-Parker?板 36 1?养 18 h24 h 或 45 h48 h?5.2.3 金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker?板?，菌落直?2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘?淡色，周围?一混?带，在?外层有一透明圈?用接种针接触菌落有似奶?树胶样的?度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落?但无混?带及透明圈?长期保?的冷冻或?燥食品中所分离的菌落比?型菌落所产生的黑色较淡?，外?可能?糙并?燥?在血?板?，形成菌落较大，圆形?滑凸起?湿润?金黄色?有时?白色?，菌落周围可?完全透明溶血圈?挑取?述菌落进行革?氏染色镜检及血浆凝固?试验?5.3 鉴定 5.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌?革?氏?性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直?0.5 m1 m?5.3.2 血浆凝固酶试验：挑取?Baird-Parker?板或血?板?可疑菌落1个或以?，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面，36 1?养 18 h24 h?取新鲜?置兔血浆 0.5 mL，放入小试管中，再加入 BHI?养物 0.2 mL0.3 mL，振荡摇匀，置 36 1 温箱或水浴箱内，每半小时?察一次，?察 6 h，如呈?凝固?将试管倾斜或倒置时，呈?凝块?或凝固体?大于原体?的一半，被判定?性结果?时以血浆凝固?试验?性和?性葡萄球菌菌株的肉汤?养物作?对照?也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固?试验?结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36 1?养 18 h48 h，?复试验?5.4 葡萄球菌肠毒素的检验 可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，?按附录B检?葡萄球菌肠毒素?6 结果?报告 6.1 结果判定：符合 5.2.3?5.3，可判定?金黄色葡萄球菌?6.2 结果报告：在 25 g?mL?样品中检?或未检?金黄色葡萄球菌?GB 4789.102010 5 36 1 第二法 金黄色葡萄球菌 Baird-Parker平板计数 7 检验程序 金黄色葡萄球菌?板计数程序?2?2 金黄色葡萄球菌 Baird-Parker 平板法检验程序 8 操作步骤 8.1 样品的稀释 8.1.1 固体和半固体样品：?取25 g样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min10000 r/min均质1 min2 min，或置盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用?式均质器?打1 min2 min，制成1:10的样品匀液?8.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液?8.1.3 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无菌试管中?注意吸管或吸头尖端?要触及稀释液面?，振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌吸管反复吹打使?混合均匀，制成 1:100 的样品匀液?8.1.4 按 8.1.3 操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液?每递增稀释一次，换用 1 次 1 mL 无菌吸管或吸头?8.2 样品的接种 根据对样品污染状况的估计，选择 2 个3 个适宜稀释度的样品匀液?液体样品可包括原液?，在进行 10 倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液以 0.3 mL?0.3 mL?0.4 mL 接种量分别加10 倍系列稀释 选择 2 个3 个连续的适宜稀释度的样品匀液，接种 Baird-Parker?板 计数及血浆凝固?试验报 告 检 样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质 45 h48 h GB 4789.102010 6 入?块Baird-Parker?板，然?用无菌L棒涂布整个?板，注意?要触及?板边缘?使用前，如Baird-Parker?板表面有水珠，可放在 25 50 的?养箱?燥，直到?板表面的水珠消失?8.3?养 8.3.1.1 在通常情况?，涂布?，将?板静置 10 min，如样液?易吸收，可将?板放在?养箱 36 1?养 1 h?等样品匀液吸收?翻转?皿，倒置于?养箱，36 1?养，45 h48 h?8.4 典型菌落计数和确认 8.4.1 金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker?板?，菌落直?2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘?淡色，周围?一混?带，在?外层有一透明圈?用接种针接触菌落有似奶?树胶样的?度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落?但无混?带及透明圈?长期保?的冷冻或?燥食品中所分离的菌落比?型菌落所产生的黑色较淡?，外?可能?糙并?燥?8.4.2 选择有?型的金黄色葡萄球菌菌落的?板，且?一稀释度 3 个?板所有菌落数合计在 20 CFU200 CFU 之间的?板，计数?型菌落数?如果?a?只有一个稀释度?板的菌落数在20 CFU200 CFU之间且有?型菌落，计数该稀释度?板?的?型菌落?b?稀释度?板的菌落数小于 20 CFU 且有?型菌落，计数该稀释度?板?的?型菌落?c?某一稀释度?板的菌落数大于 200 CFU 且有?型菌落，但?一稀释度?板?没有?型菌落，?计数该稀释度?板?的?型菌落?d?某一稀释度?板的菌落数大于 200 CFU 且有?型菌落，且?一稀释度?板?有?型菌落，但?板?的菌落数?在 20 CFU200 CFU 之间，?计数该稀释度?板?的?型菌落?以?按公式?1?计算?e?2 个连续稀释度的?板菌落数均在 20 CFU200 CFU 之间，按公式?2?计算?8.4.3 从?型菌落中任选 5 个菌落?小于 5 个全选?，分别按 5.3.2 做血浆凝固?试验?9 结果计算：公式?1?CdABT=?1?式中?T样品中金黄色葡萄球菌菌落数?A某一稀释度?型菌落的总数?B某一稀释度血浆凝固?性的菌落数?C某一稀释度用于血浆凝固?试验的菌落数?d稀释因子?公式?2?2?式中?T 样品中金黄色葡萄球菌菌落数?A1第一稀释度?稀释倍数?型菌落的总数?A2第二稀释度?高稀释倍数?型菌落的总数?B1第一稀释度?稀释倍数?血浆凝固?性的菌落数?dCBACBAT1.1222111+=GB 4789.102010 7 B2第二稀释度?高稀释倍数?血浆凝固?性的菌落数?C1第一稀释度?稀释倍数?用于血浆凝固?试验的菌落数?C2第二稀释度?高稀释倍数?用于血浆凝固?试验的菌落数?1.1计算系数?d 稀释因子?第一稀释度?10 结果?报告 根据Baird-Parker?板?金黄色葡萄球菌的?型菌落数，按9中公式计算，报告每g?mL?样品中金黄色葡萄球菌数，以CFU/g(mL)表示?如T值?0，则以小于1?以?稀释倍数报告?GB 4789.102010 8 第三法 金黄色葡萄球菌MPN计数 11 检验程序 金黄色葡萄球菌MPN计数程序?3?3 金黄色葡萄球菌MPN法检验程序 12 操作步骤 12.1 样品的稀释 按8.1进行?12.2 接种和?养 12.2.1 根据对样品污染状况的估计，选择 3 个适宜稀释度的样品匀液?液体样品可包括原液?，在进行 10 倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液接种到 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤管，每个稀释度接种 3 管，将?述接种物于 36 1?养 45 h48 h?10 倍系列稀释 选择 3 个适宜稀释度的样品匀液，各吸取 1 mL，分别接种于 3 管 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤?接种 Baird-Parker?板血浆凝固?试验 检 样 25 g(mL)样品为225 mL 稀释液，均质 查 MPN 表报告结果 45 h48 h 36 1 36 1 45 h48 hGB 4789.102010 9 12.2.2 用接种?从有细菌生长的各管中，移取 1?，分别接种 Baird-Parker?板，36 1?养 45 h48 h?12.3 典型菌落确认 12.3.1?8.4.1?12.3.2 从?型菌落中?少挑取 1 个菌落接种到 BHI 肉汤和营养琼脂斜面，36 1?养 18 h24 h?进行血浆凝固?试验，?5.3.2?13 结果?报告 计算血浆凝固?试验?性菌落对?的管数，查 MPN 检索表?附录 C?，报告每 g(mL)样品中金黄色葡萄球菌的?可能数，以 MPN/g?mL?表示?GB 4789.102010 10 附录 A?规范性附录?养?和试剂 A.1 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤 A.1.1 成分 胰酪胨?或胰蛋白胨?17.0 g 植物蛋白胨?或大豆蛋白胨?3.0 g 氯化钠 100.0 g 磷酸氢二钾 2.5 g 丙酮酸钠 10.0 g 葡萄糖 2.5 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.30.2 A.1.2 制法 将?述成分混合，加热，轻轻搅?并溶解，调节 pH，分装，每瓶 225 mL，121 高压灭菌 15 min?A.2 7.5%氯化钠肉汤 A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 氯化钠 75 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.4 A.2.2 制法 将?述成分加热溶解，调节 pH，分装，每瓶 225 mL，121 高压灭菌 15 min?A.3 血琼脂平板 A.3.1 成分 豆粉琼脂?pH7.47.6?100 mL 脱纤维羊血?或兔血?5 mL10 mL A.3.2 制法 加热溶化琼脂，冷?50，以无菌操作加入脱纤维羊血，摇匀，倾注?板?A.4 BairdParker琼脂平板 A.4.1 成分 胰蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g?母膏 1.0 g 丙酮酸钠 10.0 g 甘?酸 12.0 g 氯化锂?LiCl6H2O?5.0 g GB 4789.102010 11 琼脂 20.0 g 蒸馏水 950 mL pH 7.00.2 A.4.2 增菌剂的?法 30%?黄盐水 50 mL?经过除菌过滤的 1%?碲酸钾溶液 10 mL 混合，保?于冰箱内?A.4.3 制法 将各成分加到蒸馏水中，加热煮?完全溶解，调节 pH?分装每瓶 95 mL，121 高压灭菌 15 min?临用时加热溶化琼脂，冷?50，每 95 mL 加入预热?50 的?黄?碲酸钾增菌剂 5 mL 摇匀?倾注?板?养?是?密?透明的?使用前在冰箱储?得超过 48 h?A.5 脑心浸出液肉汤(BHI)A.5.1 成分 胰蛋白质胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钠?Na2HPO412H2O?2.5 g 葡萄糖 2.0 g 牛心浸?液 500 mL pH 7.40.2 A.5.2 制法 加热溶解，调节 pH，分装 16 mm160 mm 试管，每管 5 mL 置 121，15 min 灭菌?A.6 兔血浆 取柠檬酸钠 3.8 g，加蒸馏水 100 mL,溶解?过滤，装瓶，121 高压灭菌 15 min?兔血浆制备?取 3.8%柠檬酸钠溶液一份，加兔全血四份，混好静置(或以 3000 r/min 离心 30 min)，使血液细胞?降，?可得血浆?A.7 磷酸盐缓冲液 A.7.1 成分?磷酸二氢钾?KH2PO4?34.0 g 蒸馏水 500 mL pH 7.2 A.7.2 制法?贮?液?取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大?175 mL的1 mol/L氢?化钠溶液调节pH?7.2，用蒸馏水稀释?1 000 mL?贮?于冰箱?稀释液?取贮?液1.25 mL，用蒸馏水稀释?1 000 mL，分装于适宜容器中，121 高压灭菌15 min?A.8 营养琼脂小斜面 A.8.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 3.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g20.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.27.4 GB 4789.102010 12 A.8.2 制法 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢?化钠溶液?2 mL调节pH?7.27.4?加入琼脂，加热煮?，使琼脂溶化，分装13 mm130 mm管，121 高压灭菌15 min?A.9 革兰氏染色液 A.9.1 结晶紫染色液 A.9.1.1 成分 结晶紫 1.0 g 95?醇 20.0 mL 1草酸铵水溶液 80.0 mL A.9.1.2 制法 将结晶紫完全溶解于?醇中，然?草酸铵溶液混合?A.9.2 革?氏碘液 A.9.2.1 成分 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 mL A.9.2.2 制法 将碘?碘化钾?行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，?完全溶解?，再加蒸馏水?300 mL?A.9.3 沙黄复染液 A.9.3.1 成分 沙黄 0.25 g 95?醇 10.0 mL 蒸馏水 90.0 mL A.9.3.2 制法 将沙黄溶解于?醇中，然?用蒸馏水稀释?A.9.4 染色法 a)涂?在火焰?固定，滴加结晶紫染液，染 1 min，水洗?b)滴加革?氏碘液，作用 1 min，水洗?c)滴加 95?醇脱色?15 s30 s，直?染色液被洗掉，?要过分脱色，水洗?d)滴加复染液，复染 1 min，水洗?镜检?A.10 无菌生理盐水 A.10.1 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1 000 mL A.10.2 制法?取8.5氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 高压灭菌15 min?GB 4789.102010 13 附录 B(规范性附录)葡萄球菌肠毒素检验 B.1 试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均?分析纯，试验用水?符合GB/T 6682对一?水的规定?B.1.1 A?B?C?D?E 型金黄色葡萄球菌肠毒素分型 ELISA 检?试剂盒?B.1.2 pH 试纸，范围在 3.58.0，精度 0.1?B.1.3 0.25 mol/L?pH8.0 的 Tris 缓冲液?将 121.1g 的 Tris 溶解到 800mL 的去离子水中，?温度冷?室温?，加 42 mL 浓 HCl，调 pH 值?8.0?B.1.4 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液?取 NaH2PO4H2O 0.55g?或 NaH2PO4 2H2O 0.62g?Na2HPO42H2O 2.85g?或 Na2HPO412H2O 5.73g?NaCl 8.7g 溶于 1 000 mL 蒸馏水中，充分混匀?可?B.1.5 庚烷?B.1.6 10%次氯酸钠溶液?B.1.7 肠毒素产毒?养?B.1.7.1 成分 蛋白胨 20.0 g 胰消化酪蛋白 200 mg(?酸)氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾 1.0 g 磷酸二氢钾 1.0 g 氯化钙 0.1 g?酸镁 0.2 g 菸酸 0.01 g 蒸馏水 1 000 mL pH7.27.4 B.1.7.2 制法 将所有成分混于水中，溶解?调节 pH，121高压灭菌 30min?B.1.8 营养琼脂 B.1.8.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 3.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g20.0 g 蒸馏水 1 000 mL B.1.8.2 制法 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内主加入 15%氢?化钠溶液?2mL，校?pH?7.27.4?加入琼脂,加热煮?主使琼脂溶化?分装烧瓶主121高压灭菌 15min?B.2 仪器和设备 B.2.1 电子天?感量 0.01g?GB 4789.102010 14 B.2.2 均质器?B.2.3 离心机?转速 3000 g5000 g?B.2.4 离心管?50 mL?B.2.5 滤器?滤膜孔?0.2 m?B.2.6 微量加样器:20 L200 L?200 L1000 L?B.2.7 微量多通道加样器:50 L300 L?B.2.8 自动洗板机(可选择使用)?B.2.9?标仪?长 450 nm?B.3 原理 本方法可用 A?B?C?D?E 型金黄色葡萄球菌肠毒素分型?联免疫吸附试剂盒完成?本方法?定的?础是?联免疫吸附反?ELISA?96 孔?标板的每一个微孔条的 AE 孔分别包被了 A?B?C?D?E 型葡萄球菌肠毒素抗体，H 孔?性质?，已包被混合型葡萄球菌肠毒素抗体，F 和 G 孔?性质?，包被了非免疫动物的抗体?样品中如果有葡萄球菌肠毒素，游离的葡萄球菌肠毒素则?各微孔中包被的特定抗体结合，形成抗原抗体复合物，?余未结合的成分在洗板过程中被洗掉?抗原抗体复合物再?过?化物?标记物?二抗?结合，未结合?的?标记物在洗板过程中被洗掉?加入?物和显色剂并孵育，?标记物?的?催化?物分解，使无色的显色剂变?蓝色?加入反?终?液可使颜色由蓝变黄，并终?了?反?以 450 nm?长的?标仪?量微孔溶液的吸?度值，样品中的葡萄球菌肠毒素?吸?度值成?比?B.4 检测步骤 B.4.1 从分离菌株?养物中检测葡萄球菌肠毒素方法?菌株接种营养琼脂斜面?试管18 mm应180 mm?37?养24 h，用5 mL生理盐水洗?菌落，倾入60 mL产毒?养?中，每个菌种种一瓶，37 振荡?养48 h，振速?100 次/min，吸?菌液离心，8000 r/min 20 min，加热100，10 min，取?清液主取100 L稀释?的样液进行试验?B.4.2 从食品中提取和检测葡萄球菌毒素方法 B.4.2.1 乳和乳粉 将 25 g 乳粉溶解到 125 mL?0.25 mol/L?pH8.0 的 Tris 缓冲液中，混匀?液体乳一样按以?步骤制备?将乳于 15，3500 g 离心 10 min?将表面形成的一层脂肪层移走，变成脱脂乳?用蒸馏水对?进行稀释?1?20?取 100L 稀释?的样液进行试验?B.4.2.2 脂肪含量?超过 40%的食品?取 10 g 样品绞碎，加入 pH7.4 的 PBS 液 15 mL 进行均质?振摇 15 min?于 15，3500g 离心 10 min?必要时，移去?面脂肪层?取?清液进行过滤除菌?取 100 L 的滤?液进行试验?B.4.2.3 脂肪含量超过 40%的食品?取 10 g 样品绞碎，加入 pH7.4 的 PBS 液 15 mL 进行均质?振摇 15 min?于 15，3500 g 离心10 min?吸取 5 mL?层悬浮液，转移到另外一个离心管中，再加入 5 mL 的庚烷，充分混匀 5 min?于15，3500 g 离心 5 min?将?部有机相?庚烷层?全部弃去，注意该过程中?要残留庚烷?将?部水相层进行过滤除菌?取 100 L 的滤?液进行试验?B.4.2.4?它食品可?情参考?述食品处理方法?B.4.3 检测 B.4.3.1 所有操作均?在室温?20 25?进行，A?B?C?D?E 型金黄色葡萄球菌肠毒素分型 ELISA 检?试剂盒中所有试剂的温度均?回升?室温方可使用?定中吸取?的试剂和样品溶液时?更换吸头，用过的吸头以及废液要浸?到 10%次氯酸钠溶液中过夜?GB 4789.102010 15 B.4.3.2 将所需数量的微孔条插入框架中?一个样品需要一个微孔条?将样品液加入微孔条的 AG孔，每孔 100 L?H 孔加 100 L 的?性对照，用手轻?微孔板充分混匀，用?胶纸封?微孔以?溶液挥发，置室温?孵育 1 h?B.4.3.3 将孔中液体倾倒?含 10%次氯酸钠溶液的容器中，并在吸水纸?打几次以确保孔内?残留液体?每孔用多通道加样器注入 250 L 的洗液，再倾倒掉并在吸水纸?复以?洗板操作 4 次?本步骤也可由自动洗板机完成?B.4.3.4 每孔加入 100L 的?标抗体，用手轻?微孔板充分混匀，置室温?孵育 1 h?B.4.3.5?复 B.4.3.3 的洗板程序?B.4.3.6 加50L的TMB?物和50L的发色剂?每个微孔中，轻?混匀，室温黑暗避?处孵育30 min?B.4.3.7 加入 100L 的 2 mol/L?酸终?液，轻?混匀，30 min 内用?标仪在 450 nm?长条件?量每个微孔溶液的 OD 值?B.4.4 结果的计算和表述 B.4.4.1 质量控制?试结果?性质?的 OD 值要大于 0.5，?性质?的 OD 值要小于 0.3，如果?能?时满足以?要求，?试的结果?被认可?对?性结果要排除内源性过?化物?的?扰?B.4.4.2 临界值的计算 每一个微孔条的 F 孔和 G 孔?性质?，?个?性质?OD 值的?均值加?0.15?临界值?示例?性质?1=0.08?性质?2=0.10?均值=0.09 临界值=0.09+0.15=0.24 B.4.4.3 结果表述 OD 值小于临界值的样品孔判?性，表述?样品中未检?某型金黄色葡萄球菌肠毒素?OD 值大于或等于临界值的样品孔判?性，表述?样品中检?某型金黄色葡萄球菌肠毒素?B.5 生物安全 因样品中?排除有?它潜在的传染性物质?在，所以要?格按照 GB19489 对废弃物进行处理?GB 4789.102010 16 附录C?规范性附录?金黄色葡萄球菌最可能数?MPN?检索表 C.1 金黄色葡萄球菌最可能数?MPN?的检索见表 每g(mL)检样中金黄色葡萄球菌?可能数?MPN?的检索?表C.1?表C.1 金黄色葡萄球菌最可能数?MPN?检索表?性管数 95%置信区间?性管数 95%置信区间 0.10 0.01 0.001MPN?限?限0.100.010.001MPN?限?限 0 0 0 1100 420-注 1?本表采用 3 个稀释度0.1 g(mL)?0.01 g(mL)和 0.001 g(mL)?每个稀释度接种 3 管?注2?表内所列检样量如改用l g(mL)?0.1 g(mL)和0.01 g(mL)时，表内数?相?降?10倍?如改用0.01 g(mL)?0.001 g(mL)?0.0001 g(mL)时，则表内数?相?增高 10 倍，?余类?