植物衰老生理.doc

装 订 线实验报告课程名称： 植物生理学及实验（甲） 实验类型： 实验名称： 植物衰老生理 姓名： 专业： 学号： 同组学生姓名： 指导老师： 实验地点： 实验日期： 一、实验目的和要求 二、实验内容和原理三、主要仪器设备 四、操作方法与实验步骤五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析七、讨论、心得 一、 实验目的和要求1、 熟悉提取植物组织中蛋白质的一般办法2、 掌握MDA、SOD测定的原理及方法3、 掌握离心机、分光光度计等仪器的使用方法4、 了解植物衰老过程中，物质含量的变化二、 实验内容和原理材料：新老青菜叶片内容：植物组织蛋白质、丙二醛含量测定原理：1、 蛋白质测定考马斯亮蓝 G-250 ( Coomassie brilliant blue ，G-250 )法是利用蛋白质-染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由 465 nm 变成 595 nm ，通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约 2 min 即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定 1 h，之后，蛋白质染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高(比 Lowry 法灵敏 4 倍)，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。 2、丙二醛含量测定MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成三甲基复合物。该复合物最大吸收峰在532nm处;最小吸收峰600nm处，消光系数为155 (mM)-1 cm-13、SOD活性测定SOD是含金属辅基的酶，它催化以下反应：02 - +02 - + 2H+ H2 02 +02四氮唑蓝(NBT)光照还原的分光光度法：核黄素受光照产生的O2.-能将NBT还原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm波长有最大吸收，而SOD能清除O2.-, 抑制甲腙的产生使吸收减小。通过分光光度检测SOD对O2.-的抑制率，可以表征出SOD含量。（但是,在水性条件下NBT还原法得到的甲腙是蓝色混悬液，做长时程分析时沉淀表现尤为突出,属分光光度法检测的极端条件，使得该法实验数据重现性差；同时，在560nm波长对此法产生的甲腙进行检测,即使加入过量的SOD，也无法获得100%的对O2.-抑制率。为此，人们在增加甲腙水溶性方面做了许多改良,如添加Met、SDS、BSA助溶以及采用水溶性更好的四唑类替代物等。）三、 主要仪器设备分光光度计、离心机、研钵、烧杯、移液枪、试管、离心管等四、 操作方法与实验步骤 蛋白含量的测定制备匀浆：称叶龄差异明显的叶片各0.5g，加入5.00ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8）于冰浴中研磨提取，匀浆液以10 000g 离心力作用下（4度）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。样品测定：取40ul 蛋白提取液+160ul 磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入4.8ml 考马斯蓝溶液，混匀后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm 波长下比色读取OD值。对照为空白的磷酸缓冲液加上4.8ml 考马斯蓝溶液。MDA含量的测定1、 取上清液1.0ml 于7ml 离心管中，加TBA与TCA混合液4.0ml ，然后在离心管盖上戳一小孔，92水浴保温30min 。2、 空白管：1ml Pi-butter +TBA与TCA混合液4.0ml （92水浴保温30min）。3、 冷却后平衡，离心5min ；10000rpm。4、 测定A532、A450和A600计算可溶性蛋白含量 (ug/g.FW)=标准曲线上查得的蛋白质量（g）*提取液体积/（测定加样量*鲜重）MDA（mM）=（A532-A600）/155/L （L为比色杯厚度（cm）蔗糖对MBA-TBA反应有干扰，可用下式消除：MDA（uM）=6.45*（A532-A600）-0.56*A450SOD活性测定：1、称叶龄差异明显的叶片各0.50g ，加入5.00ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以10000g 离心力作用下（4）离心10min，其上清液即为酶提取液。2、取四支试管，分别在暗光条件下加入4mLNBBT反应液，取其中两支加入100uL Pi-buffer，另两支加入100uL 酶粗提取液，摇匀。加Pi-buffer 的一支放在暗处做空白。其余三支在25光照（4000-10000lux）并计时，9min后取出观察颜色变化，9min 后测560nmOD值。3、根据SOD抑制NBT光化学还原的量计算SOD酶活性（unit/g.FW）。一个酶单位相当于引起4mLNBT反应液达到50抑制所需的酶量。测定时用空白调零。五、实验数据记录和处理：记录原始数据，相关计算公式及计算。可溶性蛋白：老叶新叶OD5950.0700.130蛋白含量与吸光度所呈线性关系：y=281.3x-2.907老叶可溶性蛋白含量 (ug/g.FW)=16.784*5/0.1=839.2ug/g.FW新叶可溶性蛋白含量 (ug/g.FW)=33.662*5/0.1=1683.1ug/g.FWMDA：老叶新叶OD4500.9960.519OD5320.2440.160OD6000.0380.042老叶：MDA（mM）=（0.244-0.038）/155=0.001329 mM=1.329 uMMDA（uM）=6.45*（0.244-0.038）-0.56*0.996=0.7709 uM新叶：MDA（mM）=（0.160-0.042）/155=0.0007613 mM=0.7613 uMMDA（uM）=6.45*（0.160-0.042）-0.56*0.519=0.4705 uM单位鲜重植物组织中的MDA含量（用消除干扰所得数据计算）老叶：单位鲜重植物组织中的MDA含量=0.7709*5*10-3/0.50=7.709*10-3 umol/g新叶：单位鲜重植物组织中的MDA含量=0.4705*5*10-3/0.50=4.705*10-3 umol/gSOD活性测定：含新叶提取液含老叶提取液光照处理的混合液OD5600.5760.5811.038老叶：SOD活性=（1.038-0.581）/1.038/0.5/16.784*103=52.46unit/g.FW新叶：SOD活性=（1.038-0.576）/1.038/0.5/33.662*103=26.44unit/g.FW六、 实验结果与分析：根据自己和邻组的结果及分析。1、 老叶较之新叶，可溶性蛋白量明显减少，几乎只有原来的一半左右。说明随着植物叶片的衰老，可溶性蛋白被降解，含量明显减少。2、 MDA（mM）明显高于MDA（uM），说明蔗糖对MBA-TBA反应有明显干扰。3、 老叶中MDA含量明显高于新叶。说明衰老过程中有MDA产生。4、 就实验测得的新老叶片SOD值活性相差较大，老叶明显大于新叶。这与现实不符。对比其他组数据，考虑是因为两次实验，即蛋白含量测定及SOD活性实验采用的不是同一组叶片，造成了一部分影响。七、 讨论、心得：结合理论和课外知识。1、 第二次离心的目的此时已经加入了TBA溶液，并经历了摇匀，且经过了沸水浴的加热，上清液中已混入不少杂质，再次离心，以免干扰显色反应的结果。2、植物组织中还有一些物质对丙二醛鉴定（TBA法）干扰较大；丙二醛是由植物器官衰老或在逆境条件下受伤后，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应产生，故而它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用TBA在酸性条件下加热与MDA反应，生成红棕色的三甲基复合物，其最大吸收波长在532nm。由于植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时，可溶性糖增加，而且糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收，因此测定植物组织中MDA与TBA反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。3、研磨、离心时为何可以不用冰浴和低温因为TBA与MDA的反应需要酸性和高温条件，这样才能在532nm处有最大吸收。 （注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）