菌种复壮.doc

衰退（degeneration）：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某 些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。菌种衰退不是突然发生的，而是从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体细胞中仅有个别细胞发生自发突变（一般均为负变），不会使群体菌株性能发生改变。经过连续传代，群体中的负变个体达到一定数量，发展成为优势群体，从而使整个群体表现为严重的衰退。经分析发现，导致这一现象的原因有以下几方面。1. 基因突变（1）有关基因发生负突变导致菌种衰退菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。如果控制产量的基因发生负突变，则表现为产量下降；如果控制孢子生成的基因发生负突变，则产生孢子的能力下降。菌种在移种传代过程中会发生自发突变。虽然自发突变的几率很低(一般为10-610-9)，尤其是对于某一特定基因来说，突变频率更低。但是由于微生物具有极高的代谢繁殖能力，随着传代次数增加，衰退细胞的数目就会不断增加，在数量上逐渐占优势，最终成为一株衰退了的菌株。（2）表型延迟造成菌种衰退表型延迟现象也会造成菌种衰退。如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产量较高，进行复筛时产量却下降了。（3）质粒脱落导致菌种衰退质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。当菌株细胞由于自发突变或外界条件影响（如高温），致使控制产量的质粒脱落或者核内DNA和质粒复制不一致，即DNA复制速度超过质粒，经多次传代后，某些细胞中就不具有对产量起决定作用的质粒，这类细胞数量不断提高达到优势，则菌种表现为衰退。2. 连续传代连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突变）的几率越高；另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。3. 不适宜的培养和保藏条件不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。1.合理的育种 选育菌种时所处理的细胞应使用单核的，避免使用多核细胞； 合理选择诱变剂的种类和剂量或增加突变位点，以减少分离回复；在诱变处理后进行充分的后培养及分离纯化，以保证保藏菌种纯碎。这些可有效的防止菌种的退化。 2.选用合适的培养基 有人发现用老苜蓿根汁培养基培养“5406”抗生菌细黄链霉菌可以防止它的退化。在赤霉菌产生菌藤仓赤霉的培养基中，加入糖蜜、天门冬素、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等物质时，也有防止菌种退化的效果。也有选取营养相对贫乏的培养基做菌种保藏培养基，如培养基中适当限制容易利用的糖源葡萄糖等的添加，因为变异多半是通过菌株的生长繁殖而产生的，当培养基营养丰富时，菌株会处于旺盛的生长状态，代谢水平较高，为变异提供了良好的条件，大大提高了菌株的退化几率。 3.创造良好的培养条件 在生产实践中，创造和发现一个适合原种生长的条件可以防止菌种退化，如低温、干燥、缺氧等。在栖土曲霉3942 的培养中，有人曾用改变培养温度的措施(从20-30提高到33-34)来防止它产孢子能力的退化。 4.控制传代次数 由于微生物存在着自发突变，而突变都是在繁殖过程中发生而表现出来的。所以应尽量避免不必要的移种和传代，把必要的传代降低到最低水平，以降低自发突发的机率。菌种传代次数越多，产生突变的几率就越高，因而菌种发生退化的机会就越多。这要求不论在实验室还是在生产实践上，必须严格控制菌种的移种传代次数，并根据菌种保藏方法的不同，确立恰当的移种传代的时间间隔。如同时采用斜面保藏和其它的保藏方式（真空冻干保藏、砂土管、液氮保藏等），以延长菌种保藏时间。 5.利用不同类型的细胞进行移种传代 在有些微生物中，如放线菌和霉菌，由于其菌的细胞常含有几个核或甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，用它接种时，就没有这种现象发生。有人在实践中发现构巢曲霉如用分生孢子传代就容易退化，而改用子囊孢子移种传代则不易退化；还有人采用灭过菌的棉团轻巧地沾取“5406”孢子进行斜面移种，由于避免了菌丝的接入，因而达到了防止退化的效果。 6.采用有效的菌种保藏方法 用于工业生产的一些微生物菌种，其主要性状都属于数量性状，而这类性状恰是最容易退化的。因此，有必要研究和制定出更有效的菌种保藏方法以防止菌种退化。菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种 菌种的复壮措施：纯种分离 采用平板划线分离法、稀释平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型优良性状的单细胞分离出来，经扩大培养恢复原菌株的典型优良性状，若能进行性能测定则更好。还可用显微镜操纵器将生长良好的单细胞或单孢子分离出来，经培养恢复原菌株性状。 通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮） ；主要是对一些寄生性的菌株,可以将衰退的菌株接种到相应的宿主体内,提高其寄生性能及其它性能. 淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。可以采用各种外界不良理化条件,使发生衰退的个体死亡,从而留下群体中生长健壮的个体.如:对5406抗生菌的分生孢子进行-30-10度的低温处理5-7天,使80%死亡,在抗低温个体中可找到健壮的个体.采用有效的菌种保藏方法。 复壮的判断方法：1.生化指标:比如一些能够利用特殊物质作为生长必须物质的菌株，你可以通过其生活过程中某些中间代谢物的产量作为指标。或者是这个菌株产生的酶或者是这个菌株产生的次生代谢物。2.生理指标：菌株如果复壮，那么他的生长量就会恢复到原来的水平或者更高，适合用于群体研究。3.通过特殊的生化反应筛选出复壮的菌株：比如说你的菌株能够分解淀粉，那么你可以使用淀粉培养基进行培养，培养后通过碘液显色，粗略判断其是否复壮。复壮的技术措施在大生产中复壮菌种的理论根据所谓复壮, 就是通过一定技术措施将菌种退化了的原本具有的优良性状重新恢复起来。菌种退化的主要原因原则上分析: 一是一些菌株有关基因发生了负突变, 这样退化了的菌株随着群体的多次繁殖, 由量变到质变就会使群体明显表现出衰退现象; 二是培养条件的影响, 如培养基营养不良、缺乏氧气培育、接种时间掌握得不合适、培育时受杂菌感染等因素关系都能使菌种发生退化。