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现代分子生物学笔记朱玉贤版第一讲 序论 二、现代分子生物学中的重要里程碑 分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特性及其重要性、规律 性和互相关系的科学， 是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘， 由被动地适应自然界 转向积极地改造和重组自然界的基础学科。 当人们意识到同一生物不同世代之间的连续性是 由生物体自身所携带的遗传物质所决定的， 科学家为揭示这些遗传密码所进行的努力就成为 人类征服自然的一部分， 而以生物大分子为研究对像的分子生物学就迅速成为现代社会中最 具活力的科学。 从 1847 年 Schleiden 和 Schwann 提出细胞学说，证明动、植物都是由细胞组成的到 今天， 虽然但是短短一百数年时间， 我们对生物大分子-细胞的化学组成却有了深刻的结识。 孟德尔的遗传学规律最先使人们对性状遗传产生了理性结识，而 Morgan 的基因学说则进一 步将性状与基因相耦联，成为分子遗传学的奠基石。Watson 和 Crick 所提出的脱氧核 糖酸双螺旋模型，为充足揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。在蛋白质化学方面，继 Sumner 在 1936 年证实酶是蛋白质之后，Sanger 运用纸电泳及层析技术于 1953 年初次阐明 胰岛素的一级结构，开创了蛋白质序列分析的先河。而 Kendrew 和 Perutz 运用 X 射线衍射 技术解析了肌红蛋白（myoglobin）及血红蛋白（hemoglobin）的三维结构，论证了这些蛋 白质在输送分子氧过程中的特殊作用，成为研究生物大分子空间立体构型的先驱。 1910 年，德国科学家 Kossel 第一个分离了腺嘌呤，胸腺嘧啶和组氨酸。 1959 年，美国科学家 Uchoa 第一次合成了核糖核酸，实现了将基因内的遗传信息通过 RNA 翻译成蛋白质的过程。同年，Kornberg 实现了试管内细菌细胞中 DNA 的复制。 1962 年，Watson（美）和 Crick（英）由于在 1953 年提出 DNA 的反向平行双螺旋模型而与 Wilkins 共获 Noble 生理医学奖，后者通过 X 射线衍射证实了 Watson-Crick 模型。 1965 年，法国科学家 Jacob 和 Monod 提出并证实了操纵子（operon）作为调节细菌细胞代 谢的分子机制。此外，他们还初次推测存在一种与 DNA 序列互相补、能将它所编码的遗传信 息带到蛋白质合成场合（细胞质）并翻译产生蛋白质的 mRNA（信使核糖核酸）。 1972 年，Paul Berg（美）第一次进行了 DNA 重组。 1977 年，Sanger 和 Gilbert（英）第一次进行了 DNA 序列分析。 1988 年，McClintock 由于在 50 年代提出并发现了可移动遗传因子（jumping gene 或称 mobile element）而获得 Nobel 奖。 1993 年， 美国科学家 Roberts 和 Sharp 因发现断裂基因 （introns） 而获得 Nobel 奖。 Mullis 由于发明 PCR 仪而与加拿大学者 Smith（第一个设计基因定点突变）共享 Nobel 化学奖。 此外，Griffith（1928）及 Avery（1944）等人关于致病力强的光滑型（S 型）肺炎链球菌 DNA 导致致病力弱的粗糙型（R 型）细菌发生遗传转化的实验；Hershey 和 Chase（1952）关 于 DNA 是遗传物质的实验；Crick 于 1954 年所提出的遗传信息传递规律（即中心法 则） :Meselson 和 Stahl （1958） 关于 DNA 半保存复制的实验以及 Yanofsky 和 Brener （1961） 年关于遗传密码三联子的设想都为分子生物学的发展做出了重大奉献。 我国生物科学家吴宪 20 世纪 20 年代初回国后在协和医科大学生化系与汪猷、 张昌颖等人一 道完毕了蛋白质变性理论、 血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究， 成为我国 生物化学界的先驱。20 世纪 60 年代、70 年代和 80 年代，我国科学家相继实现了人工全合 成有生物学活性的结晶牛胰岛素， 解出了三方二锌猪胰岛素的晶体结构， 采用有机合成与酶 促相结合的方法完毕了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工全合成， 在酶学研究、 蛋白质结构及 生物膜结构与功能等方面都有世所瞩目的建树。 三、分子生物学的重要研究内容 所有生物体中的有机大分子都是以碳原子为核心，并以共价键的形式与氢、氧、氮及磷以不 同方式构成的。不仅如此，一切生物体中的各类有机大分子都是由完全相同的单体，如蛋白 质分子中的 20 种氨基酸、DNA 及 RNA 中的 8 种碱基所组合而成的，由此产生了分子生物学 的 3 条基本原理： 1 构成生物体有机大分子的单体在不同生物中都是相同的； 2 生物体内一切有机大分子的建成都遵循着各自特定的规则； 3 某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定了它的属性。 分子生物学研究内容: DNA 重组技术-基因工程 基因表达调控-核酸生物学 生物大分子结构功能-结构分子生物学 DNA 重组技术（又称基因工程） 这是 20 世纪 70 年代初兴起的技术科学， 目的是将不同 DNA 片段 （如某个基因或基因的 一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达， 产生影响受体细胞的新的遗传性状。严格地说，DNA 重组技术并不完全等于基因工程，由于 后者还涉及其他也许使生物细胞基因组结构得到改造的体系。DNA 重组技术是核酸化学、蛋 白质化学、酶工程及微生物学、遗传学、细胞学长期进一步研究的结晶，而限制性内切酶 DNA 连接酶及其他工具酶的发现与应用则是这一技术得以建立的关键。 DNA 重组技术有着广阔的应用前景:DNA 重组技术可用于定向改造某些生物基因组结构， 使它 们所具有的特殊经济价值或功能得以成百 上千倍的地提高。DNA 重组技术还被用来进行基 础研究。假如说，分子生物学研究的核心是遗传信息的传递和控制，那么根据中心法则，我 们要研究的就是从 DNA 到 RNA，再到蛋白质的全过程，也即基因的表达与调控。在这里，无 论是对启动子的研究（涉及调控元件或称顺式作用元件），还是对转录因子的 克隆及分析，都离不开重组 DNA 技术的应用。 基因表达调控研究 由于蛋白质分子参与并控制了细胞的一切代谢活动， 而决定蛋白质结构和合成时序的信 息都由核酸（重要是脱氧核糖核酸）分子编码，表现为特定的核苷酸序列，所以基因表达实 质上就是遗传信息的转录和翻译。 在个体生长发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序 发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）。 原核生物的基因组和染色体结构都比真核生物简朴， 转录和翻译在同一时间和空间内发 生，基因表达的调控重要发生在转录水平。真核生物有细胞核结构，转录和翻译过程在时间 和空间上都被分隔开， 且在转录和翻译后都有复杂的信息加工过程， 其基因表达的调控可以 发生在各种不同的水平上。基因表达调控重要表现在信号传导研究、转录因子研究及 RNA 剪辑 3 个方面。 转录因子是一群能与基因 5端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强 度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。 真核基因在结构上的不连续性是近 10 年来生物学上的重大发现之一。当基因转录成 pre-mRNA 后，除了在 5端加帽及 3端加多聚 ApolyA之外，还要将隔开各个相邻编码区 的内含子剪去，使外显子（编码区）相连后成为成熟 mRNA。研究发现，有许多基因不是将 它们的内含子所有剪去，而是在不同的细胞或不同的发育阶段有选择地剪接其中部分内含 子，因此生成不同的 mRNA 及蛋白质分子。 结构分子生物学 生物大分子的结构功能研究（又称结构分子生物学） 一个生物大分子，无论是核酸、 蛋白质或多糖， 在发挥生物学功能时， 必须具有两个前提:一方面， 它拥有特定的空间结构 （三 维结构）；另一方面，在它发挥生物学功能的过程中必然存在着结构和构象的变化。 结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功 能关系的科学。 它涉及结构的测定、 结构运动变化规律的探索及结构与功能互相关系的建立 3 个重要研究方向。最常见的研究三维结构及其运动规律的手段是 X 射线衍射的晶体学（又 称蛋白质晶体学），另一方面是用二维核磁共振和多维核磁研究液相结构，也有人用电镜三维重 组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法研究生物高分子的空间结构。 -第二讲 染色体与 DNA 一、 DNA 的组成与结构 Avery 在 1944 年的研究报告中写道：当溶液中酒精的体积达成 9/10 时，有纤维状物 质析出。如稍加搅拌，它就会象棉线在线轴上同样绕在硬棒上，溶液中的其它成份则呈颗粒 状沉淀。溶解纤维状物质并反复数次，可提高其纯度。这一物质具有很强的生物学活性，初 步实验证实，它很也许就是 DNA（谁能想到！）。对 DNA 分子的物理化学研究导致了现代 生物学翻天覆地的革命，这更是 Avery 所没有想到。 所谓 DNA 的一级结构， 就是指 4 种核苷酸的连接及其排列顺序， 表达了该 DNA 分子的化学构 成。核苷酸序列对 DNA 高级结构的形成有很大影响，如 B-DNA 中多聚（G-C）区易出现左手 螺旋 DNA（Z-DNA），而反向反复的 DNA 片段易出现发卡式结构等。DNA 不仅具有严格的化学 组成，还具有特殊的高级结构，它重要以有规则的双螺旋形式存在，其基本特点是： 1、DNA 分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。 2、DNA 分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧。 3、两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。这就是嘌呤与 嘧啶配对，并且腺嘌呤（A）只能与胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）只能与胞嘧啶（C）配 对。如一条链上某一碱基是 C，另一条链上与它配对的碱基必然是 G。碱基之间的这种一一 相应的关系叫碱基互补配对原则。 组成 DNA 分子的碱基虽然只有 4 种， 它们的配对方式也只 有 A 与 T，C 与 G 两种，但是，由于碱基可以任何顺序排列，构成了 DNA 分子的多样性。例 如，某 DNA 分子的一条多核苷酸链有 100 个不同的碱基组成，它们的也许排列方式就是 4100。 二、 DNA 聚合酶与 DNA 的合成 The accuracy of translation relies on the specificity of base pairing. The actu al rate in bacteria seems to be -10-8-10-10. This corresponds to -1 error per genome per 1000 bacterial replication cycles, or -10-6 per gene per generation. DNA polymerase might improve the specificity of complementary base selection at either (or both) of two stages: 1， It could scrutinize the incoming base for the proper complementarity with the t emplate base; for example, by specifically recongnizing matching chemical featu res. This would be a presynthetic error control. 2， Or it could scrutinize the base pair after the new base has been added to the c hain, and, in those cases in which a mistake has been made, remove the most rec ently added base. This would be a proofreading control. 三、DNA 的生理意义及成分分析 早在 1928 年英国科学家 Griffith 等人就发现肺炎链球菌使小鼠残废的因素是引起肺 炎。细菌的毒性（致病力）是由细胞表面荚膜中的多糖所决定的。具有光滑外表的 S 型肺炎 链球菌由于带有荚膜多糖而都能使小鼠发病， 而具有粗糙外表的 R 型由于没有荚膜多糖而失 去致病力（荚膜多糖能保护细菌免受运动白细胞袭击）。 一方面用实验证明基因就是 DNA 分子的是美国著名的微生物学家 Avery。Avery 等人将光 滑型致病菌（S 型）烧煮杀灭活性以后再侵染小鼠，发现这些死细菌自然丧失了致病能力。 再用活的粗糙型细菌（R 型）来侵染小鼠，也不能使之发病，由于粗糙型细菌天然无致病力。 当他们将经烧煮杀死的 S 型细菌和活的 R 型细菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死了。 解剖死鼠，发现有大量活的 S 型（而不是 R 型）细菌。他们推测，死细菌中的某一成分枣转 化源（transforming principle）将无致病力的细菌转化成病原细菌。 美国冷泉港卡内基遗传学实验室科学家 Hershey 和他的学生 Chase 在 1952 年从事噬菌体侵 染细菌的实验。噬菌体专门寄生在细菌体内。它的头、尾外部都有由蛋白质组成的外壳，头 内重要是 DNA。噬菌体侵染细菌的过程可以分为以下 5 个环节：噬菌体用尾部的末端（基 片、尾丝）吸附在细菌表面；噬菌体通过尾轴把 DNA 所有注入细菌细胞内，噬菌体的蛋白 质外壳则留在细胞外面； 噬菌体的 DNA 一旦进入细菌体内， 它就能运用细菌的生命过程合 成噬菌体自身的 DNA 和蛋白质； 新合成的 DNA 和蛋白质外壳， 能组装成许许多多与亲代完 全相同的子噬菌体；子代噬菌体由于细菌的解体而被释放出来，再去侵染其他细菌。他们 发现被感染的细菌中带有 70%的噬菌体 DNA，但只带有 20%的噬菌体蛋白质。子代噬菌体中 带有 50%标记的 DNA，却只有 1%的标记蛋白质。 四. C-value 和 Cot1/2 The total amount of DNA in the haploid genome is a characteristic of each livin g species known as C-value. Cot1/2 is the product of concentration and time required for 50% reassociation given in nucleotide-moles second/liter. 五、 染色体结构 DNA molecules are the largest macromolecules in the cell and are commonly packa ged into structures called “chromosomes”, most bacteria & viruses have a sing le chromosome where as Eukaryotic cells usually contain many. 任何一条染色体上都带有许多基因，一条高等生物的染色体上也许带有成千上万个基 因，一个细胞中的所有基因序列及其间隔序列统称为 genomes（基因组）。 假如设想将人 体细胞中的 DNA 分子绕地球一周，那么，每个碱基大约只占 15 厘米，而一个 23kb 的基 因只相称于地球上一条数十米长，数厘米宽的线段！ Genotype (基因型)： The genetic constitution of a given organism (指某个特定 生物体细胞内的所有遗传物质)。 Phenotype (表现型)： Visible property of any given organism (某个特定生物体 中可观测到的物理或生理现象)。 Mutations： 染色体 DNA 中可遗传的核苷酸序列变化。 六、 染色体的组成 1染色质和核小体 染色质 DNA 的 Tm 值比自由 DNA 高， 说明在染色质中 DNA 极也许与蛋白质分子互相作用； 在染色质状态下，由 DNA 聚合酶和 RNA 聚合酶催化的 DNA 复制和转录活性大大低于在自由 DNA 中的反映；DNA 酶 I（DNaseI）对染色质 DNA 的消化远远慢于对纯 DNA 的作用。染色质 的电子显微镜图显示出由核小体组成的念珠状结构， 可以看到由一条细丝连接着的一连串直 径为 10nm 的球状体。 核小体是由 H2A、H2B、H3、H4 各两个分子生成的八聚体和由大约 200bpDNA 组成的。八 聚体在中间，DNA 分子盘绕在外，而 H1 则在核小体的外面。每个核小体只有一个 H1。 在核小体中 DNA 盘绕组蛋白八聚体核心， 从而使分子收缩成 1/7， 200bpDNA 的长度约为 68nm，却被压缩在 10nm 的核小体中。但是，人中期染色体中含 3.3109 碱基对，其理论长 度应是 180cm，这么长的 DNA 被包含在 46 个 51m 长的圆柱体（染色体）中，其压缩比约 为 104。 2染色体中的核酸组成 不反复序列 在单倍体基因组里，这些序列一般只有一个或几个拷贝，它占 DNA 总量 的 40%80%。不反复序列长约 7502023dp，相称于一个结构基因的长度。单拷贝基因通过 基因扩增仍可合成大量的蛋白质，如一个蚕丝心蛋白基因可作为模板合成 104 个丝心蛋白 mRNA，每个 mRNA 可存活 4d，共合成 105 个丝心蛋白，这样，在几天之内，一个单拷贝丝心 蛋白基因就可以合成 109 个丝心蛋白分子 。 中度反复序列 这类反复序列的反复次数在 10104 之间，占总 DNA 的 10%40%。各 种 rRNA、tRNA 及组蛋白基因等都属这一类。 非洲爪蟾的 18S、5.8S 及 28SrRNA 基因是连在一起的，中间隔着不转录的间隔区，这些 单位在 DNA 链上串联反复约 5000 次。在卵细胞形成过程中这些基因可进行几千次不同比例 的复制，产生 2106 个拷贝，使 rDNA 占卵细胞 DNA 的 75%，从而使该细胞能积累 1012 个 核糖体。 高度反复序列卫星 DNA 这类 DNA 只在真核生物中发现，占基因组的 10%60%， 由 6100 个碱基组成，在 DNA 链上串联反复几百万次。由于碱基的组成不同，在 CsCl 密度 梯度离心中易与其他 DNA 分开， 形成含量较大的主峰及高度反复序列小峰， 后者又称卫星区 带（峰）。 高等真核生物 DNA 无论从结构还是功能看都极为复杂，以小鼠为例： 1.小鼠总 DNA 的 10是小于 10bp 的高度反复序列，反复数十万到上百万次/genome。 2.总 DNA 的 20是反复数千次、长约数百 bp 的中档反复序列。 3.总 DNA 的 70是不反复或低反复序列,绝大部分功能基因都位于这类序列中。 Centromere：是细胞有丝分裂期间纺锤体蛋白质与染色体的结合位点 （attachment point），这种结合对于染色体对在子细胞中的有序和平均分派至关重要。在 酵母中，centromere 的功能单位长约 130 bp，富含 AT 碱基对。在高等真核细胞中， centromere 都是由长约 510 bp、方向相同的高度反复序列所组成。 Telomeres are sequences at the ends of eukaryotic Chromosomes that help stabili ze them。 酵母 Telomeres 一般以 100 bp 左右不精确反复序列所组成。 5(TxGy)n 3(AxCy)n 其中 X、Y 一般为 14，单细胞真核生物中 n 常为 20100，高等真核生物中1500。 染色体末端的线性反复序列不能被 DNA polymarase 所准确复制， 它们一般在 DNA 复制完毕 以后由 telomarase 合成后加到染色体末端。 Alu（长约 300bp）是人类高度反复序列,由于该序列中带有 AluI 的辨认序列而得名。数 十万个 Alu 反复序列散布于整个人类基因组中， 达成总序列的 13。 Alu 与其它高度反复 序列共占人类 DNA 的 10以上。 3染色体中的蛋白质 染色体上的蛋白质涉及组蛋白和非组蛋白。 组蛋白是染色体的结构蛋白， 它与 DNA 组成 核小体。 通常可以用 2mol/L NaCl 或 0.25mol/L 的 HCl/H2SO4 解决使组蛋白与 DNA 分开。 组 蛋白分为 H1、H2A、H2B、H3 及 H4。这些组蛋白都具有大量的赖氨酸和精氨酸，其中 H3、H4 富含精氨酸，H1 富含赖氨酸；H2A、H2B 介于两者之间。 组蛋白的一般特性 进化上的极端保守性。牛、猪、大鼠的 H4 氨基酸序列完全相同。牛的 H4 序列与豌豆序 列相比只有两个氨基酸的差异 （豌豆 H4 中的异亮氨基酸 60缬氨酸 60， 精氨酸赖氨酸） 。 H3 的保守性也很大，鲤鱼与小牛胸腺的 H3 只差一个氨基酸，小牛胸腺与豌豆 H3 只差 4 个 氨基酸。 无组织特异性。到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色体不含 H1 而带有 H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白。 肽链上氨基酸分布的不对称性。碱性氨基酸集中分布在 N 端的半条链上。例如，N 端的 半条链上净电荷为+16，C 端只有+3，大部分疏水基团都分布在 C 端。 组蛋白的修饰作用。涉及甲基化、乙基化、磷酸化及 ADP 核糖基化等。 非组蛋白的一般特性 染色体上除了存在大约与 DNA 等量的组蛋白以外， 还存在大量的非组蛋白。 非组蛋白的多样 性。非组蛋白的量大约是组蛋白的 60%70%，但它的种类却很多，约在 20-100 种之间，其 中常见的有 15-20 种。 非组蛋白的组织专一性和种属专一性。 (3)几类常见的非组蛋白 a.HMG 蛋白（high mobility group protein）。这是一类能用低盐（0.35mol/L NaCl）溶 液抽提、 能溶于 2%的三氯乙酸、 相对分子质量较低的非组蛋白， 相对分子质量都在 3.0104 以下。 b. DNA 结合蛋白。 2mol/L NaCl 除去所有组蛋白和 70%非组蛋白后， 用 尚有一部分蛋白必须 用 2mol/L NaCl 和 5mol/L 尿素才干与 DNA 解离。 这些蛋白分子量较低， 约占非组蛋白的 20%， 染色质的 8%。 七. 原核与真核染色体 DNA 比较 原核生物中一般只有一条染色体且大都带有单拷贝基因，只有很少数基因如 rRNA 基因 是以多拷贝形式存在； 整个染色体 DNA 几乎所有由功能基因与调控序列所组成； 几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性相应状态。 Viral DNA molecules are relatively small HIV = 9000 nt RNA Q = 4200 nt Bactaria DNA is 100 times than viral E. coli 4639221 bp double-stranded Contour length = 1.7mm, 850 倍细菌自身长度。细菌中经常带有质粒 DNA。 Eucaryotic cells 果蝇带有 25 倍于 E. Coli 的 DNA,人类带有 600 倍于 E. Coli 的 DNA. Eucaryotic DNA 中 基因密度明显低于原核和病毒。 如人 DNA 中平均每毫米只带有 50 个基因,而 E. Coli 中基因 密度每毫米 DNA 带有 2400 个基因！ 一个人细胞中所带有的 DNA 约有 2m/1.7mm 细菌。 成人带 有 1X1014 个细胞，成人体内所有 DNA 的总长度（Contour Length） 2X1011Km -第三讲 蛋白质合成 一.基因与基因表达的一般概念 基因作为唯一可以自主复制、永久存在的单位，其生理学功能以蛋白质形式得到表达。DNA 序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成 mRNA，翻译生成蛋 白质的过程控制所有生命现象。 编码链（coding strand）又称 sense strand，是指与 mRNA 序列相同的那条链。非编码链 （anticoding strand），又称 antisense strand，是指那条根据碱基互补原则指导 mRNA 生物合成的 DNA 链。 Genetic information is perpetuated by replication（复制） in which a double- stranded nucleic acid is duplicated to give identical copies. 基因表达涉及转录（transcription）和翻译（translation）两个阶段。转录是指拷贝出一 条与 DNA 链序列完全相同（除了 TU 之外）的 RNA 单链的过程，是基因表达的核心环节。 翻译是指以新生的 mRNA 为模板，把核苷酸三联子遗传密码翻译成氨基酸序列、合成蛋白质 多肽链的过程，是基因表达的最终目的。 只有 mRNA 所携带的遗传信息才被用来指导蛋白质生物合成，所以人们一般用 U、C、A、G 这 4 种核苷酸而不是 T、C、A、G 的组合来表达遗传性状。所谓翻译是指将 mRNA 链上的核苷 酸从一个特定的起始位点开始， 按每 3 个核苷酸代表一个氨基酸的原则， 依次合成一条多肽 链的过程。 二. 遗传密码三联子 mRNA 上每 3 个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸， 3 个核苷酸就称为一个密码， 这 也叫三联子密码。翻译时从起始密码子 AUG 开始，沿 mRNA53的方向连续阅读直到终 止密码子，生成一条具有特定序列的多肽链。 mRNA 中只有 4 种核苷酸，而蛋白质中有 20 种氨基酸，若以一种核苷酸代表一种氨基酸，只 能代表 4 种(41=4)。若以两种核苷酸作为一个密码（二联子），能代表 42=16 种氨基酸。而 假定以 3 个核苷酸代表一个氨基酸，则可以有 43=64 种密码，满足了编码 20 种氨基酸的需 要。 50-60 年代破译遗传密码方面的三项重要成果： （1）Paul Zamecnik 等人证实细胞中蛋白质合成的场合。他们把放射性标记的氨基酸注射 到大鼠体内， 通过一段时间后收获其肝脏， 进行蔗糖梯度沉淀并分析各种细胞成份中的放射 性蛋白质。 假如注射后经数小时（或数天）收获肝脏，所有细胞成份中都带有放射性标记的蛋白质; 假如注射后几分钟内即收获肝脏， 那么， 放射性标记只存在于具有核糖体颗粒的细胞质成份 中。 （2）Francis Crick 等人第一次证实只有用三联子密码的形式才干把包含在由 AUGC 四个字 母组成遗传信息（核酸）准确无误地翻译成由 20 种不同氨基酸组成的蛋白质序列，实现遗 传信息的表达。 实验 1: 用吖啶类试剂（诱导核苷酸插入或丢失）解决 T4 噬菌体 rII 位点上的两个基因，使之发生 移码突变（frame-shift），就生成完全不同的、没有功能的蛋白质。 实验 2: 研究烟草坏死卫星病毒发现， 其外壳蛋白亚基由 400 个氨基酸组成， 相应的 RNA 片段长 1200 个核苷酸，与密码三联子体系正好相吻合。 实验 3: 以均聚物为模板指导多肽的合成。 在具有 tRNA、核糖体、AA-tRNA 合成酶及其它蛋白质因 子的细胞抽提物中加入 mRNA 或人工合成的均聚物作为模板以及 ATP、GTP、氨基酸等成分时 又能合成新的肽链，新生肽链的氨基酸顺序由外加的模板来决定。 1961 年，Nirenberg 等以 poly（U）作模板时发现合成了多聚苯丙氨酸，从而推出 UUU 代表 苯丙氨酸（Phe）。以 poly（C）及 poly（A）做模板分别得到多聚脯氨酸和多聚赖氨酸。 实验 4: 以特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成。 以多聚二核苷酸作模板可合成由 2 个氨基酸组 成的多肽， 5 UGU GUG UGU GUG UGU GUG3 ,不管读码从 U 开始还是从 G 开始， 都只能有 UGU （Cys） 及 GUG（Val）两种密码子。 实验 5: 以共聚三核苷酸作为模板可得到有 3 种氨基酸组成的多肽。如以多聚（UUC）为模板，也许 有 3 种起读方式： 5UUC UUC UUC UUC UUC3或 5UCU UCU UCU UCU UCU3或 5 CUU CUU CUU CUU CUU3分别产生 UUC（Phe）、UCU（Ser）或 CUU（Leu）. 多聚三核苷酸为模板时也也许只合成 2 种多肽：5GUA GUA GUA GUA GUA3或 5 UAG UAG UAG UAG UAG3 或 5AGU AGU AGU AGU AGU3由第二种读码方式产生的密码子 UAG 是终止密码，不编 码任何氨基酸，因此，只产生 GUA（Val）或 AGU（Ser）。 实验 6: 以随机多聚物指导多肽合成。 Nirenberg 等及 Ochoa 等又用各种随机的多聚物作模板合成多 肽。例如，以只含 A、C 的多聚核苷酸作模板，任意排列时可出现 8 种三联子，即 CCC、CCA、 CAC、ACC、CAA、ACA、AAC、AAA，获得由 Asn、His、Pro、Gln、Thr、Lys 等 6 种氨基酸组 成的多肽。 （3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技术。 假如把氨基酸与 ATP 和肝脏细胞质共培养，氨基酸就会被固定在某些热稳定且可溶性 RNA 分子（transfer RNA，tRNA）上。现将氨基酸活化后的产物称为氨基酰-tRNA （aminoacyl-tRNA），并把催化该过程的酶称为氨基酰合成酶 （aminoacyl-tRNA Synthetase）。 以人工合成的三核苷酸如 UUU、UCU、UGU 等为模板，在含核糖体、AA-tRNA 的反映液中保温 后通过硝酸纤维素滤膜， 只有游离的 AA-tRNA 因相对分子质量小而通过滤膜， 而核糖体或与 核糖体结合的 AA-tRNA 则留在滤膜上，这样可把已结合与未结合的 AA-tRNA 分开。 当体系中带有多聚核苷酸模板时， 从大肠杆菌中提取的核糖体经常与特异性氨基酰-tRNA 相 结合。假如把核糖体与 poly（U）和 Phe-tRNAPhe 共温育，核糖体就能同时与 poly（U）和 Phe-tRNAPhe 相结合。 4 种核苷酸组成 61 个编码氨基酸的密码子和 3 个终止密码子，它们不能与 tRNA 的反密码子 配对，但能被终止因子或释放因子辨认，终止肽链的合成。由一种以上密码子编码同一个氨 基酸的现象称为简并（degeneracy），相应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子 （synonymous codon）。 密码子和反密码子的互相作用 三密码子和反密码子的互相作用 蛋白质生物合成过程中，tRNA 的反密码子通过碱基的反向配对与 mRNA 的密码子互相作用。 1966 年，Crick 根据立体化学原理提出摆动假说（wobble hypothesis），解释了反密码子 中某些稀有成分如 I 以及许多有 2 个以上同源密码子的配对问题。 Wobble hypothesis 任意一个密码子的前两位碱基都与 tRNA anticodon 中的相应碱基形成 Watson-Crick 碱 基配对。 反密码子第一位是 A 或 C 时，只能辨认一个密码子。当反密码子第一位是 U 或 G 时，能 辨认两个密码子。当 Inosine（I）作为反密码子第一位时，能辨认三个密码子。 假如数个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、二位碱基不相同的密码子都相应于各 自的 tRNA。 根据上述规则，至少需要 32 种不同的 tRNA 才干翻译 61 个密码子。 四tRNA tRNA 在蛋白质合成中处在关键地位，被称为第二遗传密码。它不仅为将每个三联子密码翻 译成氨基酸提供了接合体， 还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了载体。 所有 的 tRNA 都可以与核糖体的 P 位点和 A 位点结合，此时，tRNA 分子三叶草型顶端突起部位通 过密码子：反密码子的配对与 mRNA 相结合，而其 3末端恰好将所转运的氨基酸送到正在 延伸的多肽上。代表相同氨基酸的 tRNA 称为同工 tRNA。在一个同工 tRNA 组内，所有 tRNA 均专一于相同的氨基酰- tRNA 合成酶。 1、tRNA 的三叶草型二级结构 受体臂（acceptor arm）重要由链两端序列碱基配对形成的杆状结构和 3端末配对的 3-4 个碱基所组成，其 3端的最后 3 个碱基序列永远是 CCA，最后一个碱基的 3或 2自由羟 基（OH）可以被氨酰化。 TC 臂是根据 3 个核苷酸命名的，其中表达拟尿嘧啶， tRNA 是 分子所拥有的不常见核苷酸。反密码子臂是根据位于套索中央的三联反密码子命名的。D 臂 是根据它具有二氢尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。 最常见的 tRNA 分子有 76 个碱基， 相对分子质量约为 2.5104。 不同的 tRNA 分子可有 74-95 个核苷酸不等，tRNA 分子长度的不同重要是由其中的两条手臂引起的。tRNA 的稀有碱基含 量非常丰富，约有 70 余种。每个 tRNA 分子至少具有 2 个稀有碱基，最多有 19 个，多数分 布在非配对区，特别是在反密码子 3端邻近部位出现的频率最高，且大多为嘌呤核苷酸。 这对于维持反密码子环的稳定性及密码子、反密码子之间的配对是很重要的。 2tRNA 的 L 形三级结构 酵母和大肠杆菌 tRNA 的三级结构都呈 L 形折叠式。这种结构是靠氢键来维持的，tRNA 的三 级结构与 AA- tRNA 合成酶的辨认有关。受体臂和 TC 臂的杆状区域构成了第一个双螺旋， D 臂和反密码子臂的杆状区域形成了第二个双螺旋。 tRNA 的 L 形高级结构反映了其生物学功能，由于它上所运载的氨基酸必须靠近位于核糖体 大亚基上的多肽合成位点，而它的反密码子必须与小亚基上的 mRNA 相配对，所以两个不同 的功能基团最大限度分离。 3tRNA 的功能 转录过程是信息从一种核酸分子（DNA）转移至另一种结构上极为相似的核酸分子（RNA）的 过程，信息转移靠的是碱基配对。翻译阶段遗传信息从 mRNA 分子转移到结构极不相同的蛋 白质分子， 信息是以能被翻译成单个氨基酸的三联子密码形式存在的， 在这里起作用的是解 码机制。 4tRNA 的种类 （1）起始 tRNA 和延伸 tR