E1A激活基因阻遏子对抗TNF-α引起的血管内皮细胞炎性损伤.docx

E1A激活基因阻遏子对抗TNF-引起的血管内皮细胞炎性损伤 李梓楠张娜通讯作者（沈阳医学院；辽宁沈阳110000）摘要：目的：分析E1A激活基因阻遏子对抗TNF-引起的血管内皮细胞炎性损伤。方法：选取健康成年人的血管内皮细胞组织，建立生物实验，保持组织活性的情况下，通过肿瘤坏死因子-对组织进行刺激，破坏血管内皮细胞引发炎性损伤，测定组织白细胞介素-6的变化、肌动蛋白骨架变化、细胞膜通透性变化、核因子B蛋白变化。结果：E1A激活基因处于过表达状态下时，血管内皮组织的白细胞介素-6总量增加，肌动蛋白骨架应力纤维增加，细胞膜通透性降低，核因子B蛋白表达加强，可见入核转位。E1A激活基因处于非过表达状态下时，血管内皮组织的白细胞介素-6总量较少，肌动蛋白骨架应力纤维变化不明显，细胞膜通透性增加，核因子B蛋白表达无明显加强和入核转位。结论：E1A激活基因过表达，有助于对抗TNF-引起的血管内皮细胞炎性损伤。关键词：E1A激活基因；TNF-；血管内皮细胞；炎性损伤前言：血管内皮细胞损伤的原因多样，可导致患者血管功能异常、细胞膜通透性增加等问题，导致冠心病、高血压等患者病情加剧，亚健康人员的发病几率也会增高。分析认为E1A激活基因对于上述疾病具有调控效果，也能限制发病，这种作用与其在机体内的表达水平存在关联。我院就其作用进行研究，结果如下：1.资料与方法1.1一般资料获取健康成年人血管内皮细胞组织作为体外实验对象，并进行培育。获取具有病毒转录能力的肿瘤坏死因子-植株，以含有10%胎牛血清的培养基进行组织培育。实验器械、检查器械均满足应用标准。1.2方法对血管内皮细胞组织进行三天培育，之后应用磷酸缓冲盐溶液进行冲洗，溶液温度控制为37摄氏度，以多聚甲醛（浓度为4%）进行洗涤后的固定，固定后行二次冲洗，仍使用37摄氏度磷酸缓冲盐溶液。对组织进行通透处理，持续1小时，使用37摄氏度磷酸缓冲盐溶液进行第三次冲洗。取鬼笔环肽进行染色，用量为100g/L，以4摄氏度低温环境孵育8小时。以免疫荧光进行核因子-B信号表达的观察。利用肿瘤坏死因子-植株对孵育完成后的组织进行刺激，在无菌环境在，应用37摄氏度磷酸缓冲盐溶液进行3次冲洗，以多聚甲醛（浓度为4%）进行固定，取5%血清进行封闭，去除血清后行二次孵育，对细胞核进行4,6-二脒基-2-苯基吲哚染色，以30%甘油进行封片，利用显微镜观察组织变化。核因子-B蛋白表达方面，就其进行PVDF转化，以脱脂奶粉进行封闭处理，并进行显色、显影。白细胞介素-6的测定方面，要求在完成孵育后除去培养基，在无菌环境下进行磷酸缓冲盐溶液冲洗，反复3次。置入浓度5%的二氧化碳培养箱中，温度参数为37摄氏度，持续进行12小时培育，提取上层部分清液，以酶联免疫吸附实验法，测定组织中白细胞介素-6水平。测定需进行三次，取平均数作为基准、内皮细胞的通透性方面，要求以BIOTIN白蛋白检测，了解细胞膜的通透性，建立弥散分析模型，完成孵育后除去培养基，在无菌环境下进行磷酸缓冲盐溶液冲洗，反复2次。置入浓度5%的二氧化碳培养箱中，温度参数为37摄氏度，持续进行12小时培育。应用96孔板，进行样本的加入和封闭，观察抗原抗体反应等，根据酶标显示仪分析白蛋白吸光度。1.3观察指标测定组织白细胞介素-6的变化、肌动蛋白骨架变化、细胞膜通透性变化、核因子B蛋白变化。2.结果2.1E1A激活基因处于过表达状态下的指标结果E1A激活基因处于过表达状态下时，借助显微镜可发现肌动蛋白骨架变化规律为应力纤维数目、分步范围的显著增加，血管内皮组织内白细胞介素-6总量也出现增加。同时细胞膜的通透性受到E1A激活基因影响出现下降，核因子B蛋白明显增强，且入核转位情况频繁。2.2E1A激活基因处于非过表达状态下的指标结果E1A激活基因处于过表达状态下时，借助显微镜可发现肌动蛋白骨架变化规律为应力纤维数目、分步范围的小幅度增加，血管内皮组织内白细胞介素-6总量有所增加但总量变化不大。同时细胞膜的通透性受到E1A激活基因影响出现下降，但较E1A激活基因过表达状态存在差异，细胞膜通透性较高。核因子B蛋白表达的有所增强，可见入核转位情况，但不频繁。3.讨论血管内皮细胞对血管功能具有重要影响，已有研究表明，心血管疾病患者的血管内皮细胞功能普遍存在异常，包括通透性增加、蛋白表达弱化等，可导致患者病情的反复、恶化。此前学者分析发现，E1A激活基因阻遏子对抗肿瘤坏死因子-引起的血管内皮细胞炎性损伤，体现为细胞膜能力的改善1。也有学者发现，这种保护作用还表现为白细胞介素-6总量的增加2。我院研究结果与此类似，在E1A激活基因作用下，血管内皮细胞炎性损伤得到控制。肿瘤坏死因子-可能导致细胞骨架改变，增加通透性，并通过吸引物质、黏附等方式造成炎性反应或细胞凋亡。E1A激活基因可参与细胞增殖分化，当肿瘤坏死因子-作用于血管内皮细胞后，E1A激活基因表达加强，控制迁移和凋亡情况，这与其活性蛋白的作用直接相关，基本机制则为血管生理条件的稳定和优化，发挥保护作用。综上所述，E1A激活基因过表达，有助于对抗TNF-引起的血管内皮细胞炎性损伤。后续工作中应进一步加强研究，尝试在心血管疾病的治疗和预防过程中加强E1A激活基因表达作用的运用，提升疾病防治效果。参考文献：1梁男男.炎性因子TNF-和IL-1对胰岛细胞TXNIP表达的影响及其可能机制D.山西医科大学,2017.2王锰,古妮,黄新策,等.血红素加氧酶-1对TNF-引起内皮细胞炎症损伤的保护作用J.肝胆胰外科杂志,2015,27(02):120-124.项目基金：2018年沈阳医学院大学生课题 -全文完-