DB15_T 2770-2022玉米秸秆低温高效降解菌筛选技术规程.pdf

ICS 65.020.01 CCS B 20 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 27702022 玉米秸秆低温高效降解菌筛选技术规程 Technical code of practice for screening of low temperature tolerance and high effective corn straw degradation microorganism 2022-08-30 发布 2022-09-30 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC 20）归口。本文件起草单位：内蒙古农业大学。本文件主要起草人：高聚林、韩升才、于晓芳、青格尔、闹干朝鲁、胡树平、王富贵、包海柱、王志刚、孙继颖、马达灵、屈佳伟、苏治军、李懿璞、刘剑、张赛楠、张鑫、欧阳一、吴胜。玉米秸秆低温高效降解菌筛选技术规程 1 范围 本文件规定了农田低温高效秸秆降解菌的样本采集，菌株分离纯化，菌株性能测定。本文件适用于在4 15 条件下玉米秸秆降解微生物的筛选。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 23874 饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法 GB/T 35808 林业生物质原料分析方法 纤维素酶活性测定 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。纤维素酶 cellulase 催化纤维素水解生成葡萄糖和低聚合度纤维的一组酶的总称，包括葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和纤维二糖酶3个主要组分。木聚糖酶 xylanase 木聚糖水解酶系是一类降解木聚糖的酶系，包括-1,4-内切木聚糖酶、-木糖苷酶、-L-阿拉伯糖苷酶、-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶，可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素。木质素过氧化物酶 lignin peroxidase 木质素的生物降解过程中的主要木质素降解酶类。可在木素聚合物内形成自由基。导致键稳定变差从而破坏木质素大分子。锰过氧化物酶 manganese peroxidase 一种含亚铁血红素的过氧化物酶，属于木质素降解酶类，能有效的降解木质素。漆酶 laccase 一种含四个铜离子的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶，以单体糖蛋白的形式存在。吸光值 optical density 光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词，检测单位用OD值表示，1OD=log10（1/trans），其中trans为检测物的透光率T值。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。ABTS：2,2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）CMC：羧甲基纤维素（carboxy methyl cellulose）5 筛选流程 样本采集 5.1.1 来源土壤样本采集 选取玉米成熟后收获前的根际土和玉米秸秆，将根际土浸泡在无菌水中进行系列梯度稀释，震荡悬浮后静置5小时以上，取上清。5.1.2 来源玉米秸秆样本采集 将玉米秸秆磨碎过60目筛子，将筛下的粉末用无菌水进行梯度稀释。震荡后静止2小时以上取上清。菌株分离纯化 5.2.1 唯一碳源筛选培养 选取5.1.1和5.1.2制备的108CFU/mL的上清液100 L，分别涂布到以碱性木质素和羧甲基纤维素为唯一碳源的选择培养基上见附录A，25培养一周。挑取不同菌落颜色和形态的单菌落进行培养。所用相关的仪器设备参照附录A，实验材料参照附录A。5.2.2 菌株纯化 选择获得单菌落之后，转移到新的LB培养基中进行纯培养，之后在25%的甘油中-80条件下保存备用。菌株性能测定 5.3.1 菌株秸秆室内效果的测定 将选取的单菌落采用LB培养基培养至OD600=0.8，离心去上清，用蒸馏水将菌体清洗3次，获得菌悬液。取烘干的2g秸秆放入50mL经0.22m的滤膜进行过滤的土壤悬浮液中，然后加入上述调整好的菌液108CFU/mL 100L。将秸秆和菌的混合物放置在15条件下放置2周，然后将降解后的秸秆取出放置在80中48h烘干，之后测定秸秆的失重率。5.3.2 酶活性测定 选取秸秆降解能力最强的菌株进行木质纤维素酶酶活的测定。测定方法按附录B执行。按照表1的筛选指标选取具的酶活和降解率高的指标。表1 玉米秸秆降解菌筛选指标 项目 数值范围 CMC 酶活性（U/L）90 木聚糖酶活性（U/L）80 木质素过氧化物酶活性（U/L）80 锰过氧化物酶活性（U/L）390 漆酶活性（U/L）100 秸秆失重率（14 天）30%5.3.3 耐低温性测定 将5.3.2筛选出的候选菌株培养液108CFU/mL按照千分之一体积接种到LB培养基中，分别放置到4 150rpm 培养7天，选取OD6000.1（4）。田间促腐效果测定 将上述步骤选出的低温高效秸秆降解菌发酵后等比例混合，组成复合菌制成菌剂。玉米收获后，田间开沟30cm深，放入装有50g长度为5cm的秸秆块的网袋，然后按照秸秆：菌剂=1000:2（w:w）的比例将制备好的菌剂(活菌数为108 CFU/g)均匀撒施到秸秆块的表面，然后覆土期间保持土壤含水量（20-30%）。每隔30天取出5袋秸秆测量其失重率，木质纤维素的组成以及秸秆的破碎率和硬度，参照附录A的测定方法。A A 附录A （资料性）低温高效秸秆降解菌的分离及其田间效果分析方法 A.1 仪器设备 洁净工作台、高速冷冻台式离心机、紫外可见分光光度计、电热恒温水浴锅、恒温震荡培养箱、移液器、磁力搅拌器、恒温干燥箱。A.2 试剂和材料 刚果红、甘油、NaCl、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、蛋白胨、羧甲基纤维素钠、木素、酵母粉、3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS 试剂)：称取 182.0 g 酒石酸钾钠,溶解于 500 mL 蒸馏水中,加热(不超过 50),于热溶液中依次加入 6.3 g 3,5-二硝基水杨酸、21.0 g 氢氧化钠、5.0 g 苯酚、5.0 g 无水硫酸钠,搅拌均匀至溶解,冷却后用蒸馏水定容至 1000mL,储存于棕色瓶中,室温保存,7 d10 d 后使用。柠檬酸缓冲液：由 0.1 mol/L 的柠檬酸溶液与 0.1mol/L 的柠檬酸三钠溶液混合配置。A 液：称取 4.2 g 柠檬酸,用少量蒸馏水溶解并定容至 200 mL；B 液：称取 5.88 g 柠檬酸三钠,用少量蒸馏水溶解并定容至 200 mL。将 A 液与 B 液混合，调节 pH 为 4.5，4 冰箱保存备用；乙酸-乙酸钠缓冲液：A 液：量取 6 mL 冰醋酸,定容至 1000 mL；B 液：称取 8.2 g 醋酸钠,蒸馏水溶解并定容至 1000 mL。将 A、B 液混合,调节 pH 为 4.8，低温冷藏备用；iv 1mg/mL 葡萄糖标准溶液配置。v 1mg/mL 木糖标准溶液配置。vi 100 mM 丙二酸-丙二酸钠缓冲液：A 液：称取 1.660 4 g 丙二酸钠，调节 pH 为 4.5，溶于水中定容至 100mL；B 液：称取 1.040 6 g 丙二酸，溶于水中定容至 100 mL，将 A、B 溶液混合，调节 pH 值为 4.5；vii 0.6 mM 2，2-连氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）溶液：称取 ABTS 0.032 9 g，溶于水中定容至 100 mL；viii 10 mM 硫酸锰溶液：称取 硫酸锰 0.169 g，溶于水中定容至 100 mL；ix 10 mM 过氧化氢溶液：移取 30过氧化氢 0.102 mL，定容至 100 mL，用前现配；x 200 mM 酒石酸缓冲液：配制 A 液：200 mM 酒石酸；B 液 200 mM 酒石酸钠溶液，将两种溶液按比例混合，调节缓冲液 pH 值为 3.0；xi 40 mM黎芦醇：称取黎芦醇0.672 8 g，定容至100 mL。A.3 培养基 CMCNa 基本培养基：称取硫酸铵 2 g、磷酸氢二钾 1 g、磷酸二氢钾 1 g、硫酸镁 0.2 g、硫酸锰 0.02 g、蛋白胨 10 g、羧甲基纤维素钠 10 g，配置 1 L 溶液，121、0.12 MPa 条件下灭菌 20 min；木素基本培养基：称取硫酸铵 2 g、磷酸氢二钾 1 g、磷酸二氢钾 1 g、硫酸镁 0.2 g、硫酸锰 0.02 g、蛋白胨 10 g、木素 1 g，配置 1 L 溶液，121、0.12 MPa 条件下灭菌 20 min；LB 培养基：称取蛋白胨 10 g、酵母粉 5 g、NaCl 10 g，配置 1L 溶液，121、0.12 MPa 条件下灭菌 20 min；产酶培养基:蛋白胨 0.5 g/L、硫酸铵 2.0 g/L、磷酸氢二钾 1.0 g/L、尿素 0.6 g/L、七水硫酸镁 0.05 g/L、七水硫酸锰 0.016 g/L、七水硫酸锌 0.017 g/L、氯化钙 0.02 g/L、氯化钠 0.2 g/L、无菌水 1 L，121、0.12 MPa 条件下灭菌 20 min。玉米秸秆降解培养基：玉米秸秆 50 g/L(1 cm2 cm 茎秆)、硫酸铵 15 g/L、尿素 3 g/L、蛋白胨3 g/L、氯化钙0.1 g/L、七水硫酸镁5 g/L、磷酸氢二钾1 g/L、氯化钠0.1 g/L、七水硫酸铁0.05 g/L、七水硫酸锰0.016 g/L、七水硫酸锌0.014 g/L、氯化钴0.02 g/L、无菌水1 L。A.4 秸秆硬度测定方法 经过一定时间埋土之后，将秸秆挖出用自来水清洗干净，采用烘箱80 烘干48 h。将选相对完整的秸秆，用SY-SO3型茎秆强度测定仪分别测定玉米茎秆的穿刺强度，3次重复，取平均值。A.5 秸秆各主要组分含量的测定 用vosant洗涤法将根系烘干粉粹后过1 mm筛，按照纤维素分析仪（ANKOMA200i）的方法测定木质素、纤维素、半纤维素的含量。B B 附录B （规范性）低温高效秸秆降解菌木质纤维素酶活测定方法 B.1 CMC 酶活性测定 按照国标GB/T 35808规范执行。B.2 木聚糖酶活性测定方法 按照国标GB/T 23874规范执行。B.3 木质素过氧化物酶活性测定 B.3.1 操作步骤 准确移取200 mM酒石酸缓冲液0.5 mL于容积为1.4 mL的比色皿中，加入40 mM黎芦醇0.1 mL。准确加入待测酶50L、蒸馏水350L。在30 条件下水浴10 min，加入浓度为20 mM过氧化氢溶液 0.01 mL启动反应，使用分光光度计迅速测定310 nm处的吸光度，1 min后再测定1次，计算二者之差，即为每分钟的吸光度变化（OD310变化）。B.3.2 酶活计算公式 木质素过氧化物酶酶活=OD310 变化/9.31.01106/X（U/L）X待测酶液体积：50L；木素过氧化物酶催化黎芦醇后形成产物在 310 nm 下的摩尔吸光系数为 9 300 mol-1Lcm-1。B.4 锰过氧化物酶活性测定 B.4.1 操作步骤 准确移取100 mM 丙二酸-丙二酸钠缓冲液0.5 mL 于容积为1.4 mL 的比色皿中，加入10 mM硫酸锰 溶液0.1 mL。准确加入待测酶液50L，加入蒸馏水350L。在30 条件下水浴10 min，加入浓度为10 mM 过氧化氢 溶液0.01 mL 启动反应，使用分光光度计迅速测定270 nm 处的吸光度，1 min后再测定1次，计算二者之差，即为每分钟的吸光度变化（OD270变化）。B.4.2 酶活计算公式 锰过氧化物酶酶活=OD270 变化/11.5901.01106/X(U/L)X待测酶液体积：50L；锰过氧化物酶氧化后的复合物在 270 nm 下的摩尔吸光系数为 11590 mol-1Lcm-1。B.5 漆酶活性测定 B.5.1 操作步骤 准确移取 100 mM 丙二酸-丙二酸钠缓冲液、0.6 mM ABTS 溶液各 10 mL，混合，摇匀，在 30 条件下水浴10 min。取上述混合试剂1 mL于容积为1.4 mL的比色皿中，在420 nm 处调零。准确加入待测酶液50L，立即记录吸光值，每隔30 s 记录1次，共3次，取平均值，折算成每分钟的吸光度变化（OD420变化）。B.5.2 酶活计算公式 漆酶酶活=OD420/36（1+X/1000）106/X（U/L）X待测酶液体积：50L；漆酶催化ABTS形成的产物摩尔吸光系数为36 000 mol-1Lcm-1。