生物样品前处置省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

生物样品前处理制作人：叶超第1页研究背景研究背景 1 234生物样品种类目录生物样品储存生物样品预处理克服基质效应方法第2页第3页DistributionMetabolismAbsorptionExcretion生物样品中药品分析测定是定量描述药品体内过程、取得药代参数主要伎俩之一第4页药品浓度低（血液中药品浓度、普通处于ng-pg级水平）干扰组分多（血液成份及其复杂，包含基质，内源性物质及其代谢产物，含有数百乃至几千种化合物）药品在体内除原型还有代谢产物以及和内源性物质结合各种形式存在体内生物样品分析特点体内生物样品分析特点第5页生物样品种类生物样品种类选取标准能够反应出药品浓度与药品效应之间关系易于获取便于处理、适合分析依据不一样目标要求进行选取均匀生物样品生物样品种类血液（全血、血浆、血清）尿液、唾液、胆汁、乳汁、脑脊液、淋巴液、汗液等非均匀生物样品心、肝、肾、脾、肺、脑、胃、肠、子宫、肌肉、皮肤等组织、器官第6页全血全血全血包含液体成份血浆和分散悬浮于其中血细胞全血不易保留，且血细胞中含有很多干扰物质，影响测定，故较少用全血测定药品浓度。仅用于血浆药品浓度太低或者血浆药品浓度波动较大，且难以控制药品，如环抱霉素A。第7页血浆血浆将采取血液置含有抗凝剂（如肝素、EDTA)试管中，混合后，3000-4000r/min离心，分离红细胞，上清液即为血浆。测定血中药品浓度通常是指测定血浆或血清中药品浓度，而不是指含有血细胞全血中 药品浓度。第8页血清血清血清是采血后不加任何抗凝剂，于室温下静置15-30min，待其自然凝结后，离心，分离出上清液。血清较血浆颜色更浅，较血浆少了大部分纤维蛋白，更易进行处理，且血浆及血清中药品浓度测定值通常是相同。第9页选择血浆or 血清u选择血浆理由：1)普通血浆中药品浓度高于血清中药品浓度2)血清形成过程中，血块凝固时，往往易造成吸附损失3)血清需要采血放置一段时间才可制得，对不稳定化合物影响较大4)血浆则可经采血后立刻离心，分离血浆低温保留u选择血清理由：1)血浆中蛋白稍微多，可能会在SPE中产生堵塞柱子情况2)血浆中含有抗凝物质（肝素或EDTA)可能会干扰化合物检测第10页生物样品储存一、冷藏或冷冻采样后除了马上分析外，为预防药品发生改变，应：u短期保留，可4冷藏u长久保留，可-20冷冻，不要重复冻融（大部分药品）u-80，阿莫西林等抗生素二、有时，还应考虑加入稳定剂酶抑制剂：一些酯类药品，如普鲁卡因、阿糖胞苷，易受血浆酯酶作用而发生水解，而应在采样后马上加入酶抑制剂如氟化钠。抗氧化剂：一些易氧化物质，可加入VC或其它氧化剂。如血浆中儿茶酚类药品常规保留仅4周，若加入适量VC，则能保留10周。第11页盐酸班布特罗（前药）体内胆碱酯酶作用下迟缓代谢阻断水解毒扁豆碱(胆碱酯酶抑制剂）特布他林（代谢产物）生物样品储存和预处理(添加酶抑制剂)第12页生物样品储存和预处理(避光）第13页生物样品储存和预处理(PH值和温度）第14页生物样品预处理目123将药品从缀合物（尿）或结合物中释放出来，以测定药品浓度将微量药品从复杂介质中纯化、富集起来预防分析仪器污染，提升测定灵敏度和选择性第15页生物样品惯用处理方法一二二三三沉淀蛋白(PPT)液液萃取(LLE)固相萃取(SPE)u主要考虑生物样品种类、被测药品性质和测定方法三个方面问题：第16页沉淀蛋白u经过沉淀蛋白质能够使结合药品释放出来，到达对待测组分提纯和纯化有机溶剂沉淀法加入中性盐有机酸加入锌盐或铜盐沉淀剂酶解法第17页有机溶剂沉淀法原理加入水溶性有机溶剂，可使蛋白质分子内及分子间氢键发生改变惯用有机溶剂种类乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、四氢呋喃等操作实例50l 血浆+150l甲醇 涡旋1min 3500rpm离心10min 取上清液进样分析第18页有机溶剂沉淀法实例奥氮平第19页有机溶剂沉淀法血浆或血清与有机溶剂体积比为1:13，就能够将90%以上蛋白质除去，采取低温低速3500r/min离心10min便可将析出蛋白质完全沉淀。经验总结优点操作简单，快速，精密度好，为方法开发中优先考虑使用，尤其在LC-MS方法中几乎使用于全部小分子化合物，不论其极性大小化合物回收率靠近100%，几乎全部小分子化合物都被提取，尤其适合用于代谢产物判定缺点只适合用于样品中浓度较高药品测定；样品处理后依然存在很多干扰物质，对结果产生干扰；残余杂质会堵塞色谱柱，污染仪器第20页加入强酸原理当PH低于蛋白质等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀。惯用有机溶剂种类10%三氯醋酸，10%高氯酸等经验总结血清与强酸百分比为1:0.6混合，高速离心，就可除去蛋白质在酸性条件下分解药品不宜本法除蛋白第21页头孢地尼内标 头孢克洛加入强酸实例第22页酶解法原理在测定酸不稳定及蛋白结合牢靠药品，需用酶解法，最惯用酶是蛋白水解酶枯草菌溶素，优点可防止一些药品在酸、及高温条件下降解：对与蛋白质结合牢靠药品（保泰松、苯妥英钠)，可显著改进回收率第23页加入中性盐原理加入中性盐，使溶液粒子强度发生改变。中性盐能将与蛋白质水合水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。惯用中性盐种类饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸橼酸盐操作实例血清和饱和硫酸铵百分比为1:2，混合，离心10000r/min 1-2min，即可除去90%以上蛋白质第24页生物样品惯用处理方法一二二三三沉淀蛋白(PPT)液液萃取(LLE)固相萃取(SPE)u主要考虑生物样品种类、被测药品性质和测定方法三个方面问题：第25页液-液提取方法（LLE）原理药品在体内吸收，需经跨膜转运，所以多数药品含有一定脂溶性生物样品中大多数内源性杂质是强极性水溶性物质u能够依据药品分子与基质之间极性差异，使用适当有机溶剂提取药品，可一次性除去大部分杂质第26页LLE方法需是考虑问题一、溶剂选择标准相同相溶原理进行选取沸点低、易于挥散和浓集无毒、不易乳化含有较高化学稳定性和惰性和水不相溶惯用液-液萃取溶剂正己烷叔丁基甲醚乙醚乙酸乙酯正丁醇极性增加二、有机溶剂和水相体积比有机溶剂相和水相体积比1:1或2:1，由实际情况决定，文件中有10:1以上三、水相PH值对于碱性药品，最正确PH要高于药品PKa1-2单位，对于酸性药品，最正确PH要低于PKa1-2单位，使药品分子以非电离形式存在，从而更易溶于有机溶剂中第27页操作实例LLE方法操作实例萃取剂第28页LLE方法操作实例待测药品：氯雷他定内标：地西泮第29页LLE方法总结优点选择性高，可除去大部分杂质对有机溶剂蒸发后复溶，能够对样品进行浓缩样品较洁净，对仪器污染小不一样PH体系中与不一样萃取剂组合，可控制回收率，并降低基质效应缺点操作繁琐，不能自动化易乳化普通提取回收率较低不适合用于极性大或者易挥发化合物提取因为需要挥发有机溶剂，对于热不稳定化合物也不太适合，容器吸附化合物也有一定困难对于极性相差较大化合物同时提取困难第30页生物样品惯用处理方法一二二三三沉淀蛋白(PPT)液液萃取(LLE)固相萃取(SPE)u主要考虑生物样品种类、被测药品性质和测定方法三个方面问题：第31页固相萃取技术(SPE)固相萃取(Solid Phase Extraction，简称SPE)是从八十年代中期开始发展起来一项样品前处理技术。由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来。主要经过固相填料对样品组分选择性吸咐及解吸过程，实现对样品分离，纯化和富集。主要目标在于降低样品基质干扰，提升检测灵敏度第32页固相萃取技术基本原理和方法基本原理采取选择性吸附、选择性洗脱方式对样品进行富集、分离、纯化，是一个包含液相和固相物理萃取过程；也能够将其近似地看作一个简单色谱过程较惯用方法是使液体样品经过一吸附剂，保留其中被测物质，再选取适当强度溶剂冲去杂质，然后用少许良溶剂洗脱被测物质，从而到达快速分离净化与浓缩目标也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出基本方法第33页固相萃取分离类型反相固相萃取硅胶上键合C18，C8，C2，苯基，腈基流动相极性大于固定相，适合分离中小极性化合物萃取疏水性相互作用正相固相萃取无键合硅胶、或硅胶上键合氰基、NH2、二醇基流动相极性小于固定相，适合于极性化合物萃取亲水性相互作用离子交换萃取硅胶基质离子交换官能团，季胺，氨基、二氨基、苯磺酸基、羧基带有电荷化合物靠静电吸引到带有电荷吸附剂表面吸附型萃取采取极性较强硅胶、硅藻土和氧化铝等吸附剂第34页固相萃取和HPLC相比特点 SPE也是一个柱色谱分离过程，分离机理、固定相和溶剂选择等方面与高效液相色谱（HPLC）有许多相同之处。不过SPE柱填料粒径（40m）要比HPLC填料（310m）大。因为短柱床和大粒径，SPE柱效比HPLC色谱柱低得多。所以，用SPE只能分开保留性质有很大差异化合物。与HPLC另一个差异是SPE柱是一次性使用。第35页固相萃取操作普通有五步：活化甲醇/乙腈 润湿小柱，活化填料；平衡水或适当缓冲液冲洗平衡小柱；上样将样品转移上柱，抽去废液；淋洗水或缓冲液最大程度洗去干扰物；洗脱用小体积溶剂将被测物质洗脱下来并搜集。亲脂型键合硅胶SPE柱试验步骤第36页平衡上样淋洗洗脱基质杂质目标化合物第37页常见固相萃取柱普通C18固相萃取固相萃取材料耐受PH范围窄（2-7.5）硅胶键合吸附剂表面存在未键合硅羟基，对碱性化合物保留较强，用硅胶键合吸附剂处理碱性化合物，回收率通常较低对极性化合物保留差HLB(Hydrophilic-lipophilic Balance Copolymer)PH1-14范围内稳定无裸露硅醇羟基亲水物质和亲脂物质含有均衡保留能力，覆盖了非极性、弱极性、极性化合物第38页Oasis HLB柱（聚合物基质）第39页亲水亲脂柱优点亲水基团（吡咯烷酮基团）和疏水基团（二乙烯基苯）,对极性化合物和非极性化合物都有很好保留，含有亲水亲脂平衡特征含有水可润湿性，填料经活化后，即使柱床干涸，吸附剂对目标物保留也不会发生改变有机聚合物而非硅胶，在pH 0-14 范围内表现稳定有机聚合物基质吸附剂，不存在次级相互作用，用于碱性化合物能够得到满意结果Oasis HLB柱（聚合物基质）第40页Oasis HLB柱（聚合物基质）第41页离子交换与反相模式混合固相萃取强阳离子和反相双重保留基质惯用于提取净化生物基质中弱碱性化合物酸性环境中含氮碱性基团与磺酸基结合酸性药品呈分子状态发生反相结合作用反相作用离子交换第42页离子交换与反相模式混合固相萃取第43页固相萃取法方法总结SPE优点：1、不发生乳化；2、适应极性范围较广；3、提取效率高；4、方便快速；5、溶剂用量少；6、易于自动化；7、室温下操作，尤其适于处理挥发性及对热不稳定药品。当前，商品化固相提取小柱（cartridge）应用已比较普遍。最大缺点：贵 20多元/支第44页三种方法比较：样本较洁净基质效应低操作快速适合各种性质化合物第45页第46页基质效应及其影响l基质效应（martix effect）：定义：样品测试过程中，因为待测物以外其它物质存在，直接或间接影响待测物对应现象如测定血液中红霉素浓度为例，除了红霉素之外蛋白、磷脂、及其它内源性物质为基质共流成份会改变待测化合物离子化效率，引发对待测化合物监测信号抑制或提升第47页基质效应评价方法l柱后灌注法l提取后加入法（相对基质效应评价）MF：基质效应因子MF=Set 2/Set 1IS-normalized MF:内标归一化基质效应因子Set 2:提取空白生物基质，浓缩复溶形成溶液，将待测物与内标加入此溶液中。Set 1:将待测物和内标溶于非生物基质空白溶液，如:用甲醇、乙腈等溶剂直接配制待测物或内标溶液第48页基质效应消除（1）选择适当样品预处理方法蛋白沉淀法 处理后样品不是很洁净、内源性物质较多，从而产生较强基质效应液液提取法和固相萃取法处理后样品较洁净，绝大多数内源性物质易被去除，但操作复杂，可能带来提取回收率低其它问题第49页基质效应消除（2）改变被测物色谱分离条件优化色谱条件使得待测物与内源性杂质分离内源性杂质普通极性大，反相液相中保留时间短适当延长待测组分保留时间，有利于降低基质效应对测定影响第50页基质效应消除（3）采取性质相近或稳定同位素内标同位素标识物为最为理想内标物与待测物化学性质极为相同，基质效应、操作中环境改变等对他们影响也一致选择同系物作为内标第51页（4）改用不一样离子源用于定量离子源：电喷雾离子源（ESI）和大气压化学离子源（APCI）ESI对于基质化合物敏感程度要高于APCIESI离子源基质效应显著能够考虑换APCI离子源基质效应消除第52页基质效应消除（5）其它采取小进样量利用液相色谱电解质效应使用较低流速第53页The End 第54页