化学生物学化学物质与酶省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

第七章第七章化学物质与酶相化学物质与酶相互作用互作用第1页v自自然然界界中中发发觉觉酶酶已已达达30003000各各种种，而而且且这这个个数数目目伴伴随随基基因因工工程程和和蛋蛋白白质质工工程程方方面面研研究究发发展展而而大大大大增增加。加。v酶酶能能够够直直接接作作为为药药品品用用于于医医药药工工业业，如如溶溶菌菌酶酶可可治治疗疗各各类类炎炎症症，如如咽咽喉喉炎炎、口口腔腔溃溃疡疡、慢慢性性鼻鼻炎炎、带带状状疤疤疹疹及及各各种种刀刀伤伤引引发发发发炎炎等等，天天冬冬酞酞胺胺酶酶治治疗癌症，治疗血栓尿激酶等。疗癌症，治疗血栓尿激酶等。v酶酶也也广广泛泛应应用用于于食食品品工工业业、化化学学工工业业、医医药药工工业业、环环境境保保护护工工业业等等，在在临临床床检检验验、生生物物分分析析等等领领域域也广泛使用。也广泛使用。第2页v另另外外，每每种种酶酶都都有有一一定定抑抑制制剂剂，这这类类抑抑制制剂剂能能够够参参加加生生物物代代谢谢过过程程化化学学调调控控，所所以以有有些些酶酶抑抑制制剂剂可能属于毒物，而有些抑制剂能够作为药品使用。可能属于毒物，而有些抑制剂能够作为药品使用。v酶酶抑抑制制剂剂作作为为新新药药寻寻找找与与开开发发，在在近近一一、二二十十年年来分子生物学发展基础上得以实用化。来分子生物学发展基础上得以实用化。v化化学学物物质质（无无机机物物质质、有有机机物物质质和和高高分分子子物物质质）与与酶酶相相互互作作用用包包含含化化学学物物质质对对酶酶激激活活作作用用、抑抑制制作用、改性作用和酶对化学物质催化作用等。作用、改性作用和酶对化学物质催化作用等。第3页第一节第一节 化学物质对酶抑制作用化学物质对酶抑制作用v凡凡能能降降低低酶酶促促反反应应速速度度作作用用，称称为为酶酶抑抑制制作作用用。能能使使酶酶活活性性受受抑抑制制物物质质，称称为为酶酶抑抑制制剂剂。近近年年来来对对酶酶抑制作用研究进展快速。抑制作用研究进展快速。v因因为为经经过过酶酶抑抑制制作作用用研研究究，不不但但对对了了解解酶酶专专性性，酶酶活活性性部部位位物物理理和和化化学学结结构构，酶酶动动力力学学性性质质以以及及酶酶作作用用机机制制等等；而而且且对对了了解解药药品品和和毒毒物物作作用用于于机机体体方方式式及及机机理理等等也也有有主主要要意意义义；对对代代谢谢路路径径中中酶酶调调整整也也能提供信息。能提供信息。v抑抑制制剂剂之之所所以以能能抑抑制制酶酶促促反反应应，主主要要是是因因为为它它们们能能使使酶酶必必需需基基因因或或活活性性部部位位性性质质和和结结构构发发生生改改变变，从从而造成酶活性降低或丧失。而造成酶活性降低或丧失。v按按抑抑制制剂剂作作用用方方式式不不一一样样，酶酶抑抑制制作作用用可可分分为为可可逆逆和不可逆两种类型。和不可逆两种类型。第4页一、可逆抑制作用一、可逆抑制作用v按可逆抑制剂对酶按可逆抑制剂对酶底结合影响不一样，可分为底结合影响不一样，可分为许多类型，它们反应历程可用一通式表示许多类型，它们反应历程可用一通式表示：第5页速度方程通式速度方程通式v依据此反应历程依据此反应历程,依据快速平衡学说或恒态学说依据快速平衡学说或恒态学说推导，得到其总速度方程通式以下推导，得到其总速度方程通式以下在不一样抑制作用中，仅在于在不一样抑制作用中，仅在于K Ki i和和K Ki i两个数值两个数值不一样，普通可分为不一样，普通可分为4 4种类型：即竞争性抑制、非种类型：即竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合性抑制。竞争性抑制、反竞争性抑制和混合性抑制。将该方程作双倒数处理，可得将该方程作双倒数处理，可得第6页1 1，竞争性抑制作用，竞争性抑制作用v竞争性抑制作用中竞争性抑制作用中I I只与自由酶结合，因而阻止只与自由酶结合，因而阻止S S与酶结合。而与酶结合。而S S又不能与又不能与EIEI结合，结合，I I也不能与也不能与ESES结结合，所以合，所以EISEIS不存在；不存在；EIEI亦不能分解成产物。亦不能分解成产物。第7页v个个 竞竞 争争 性性 抑抑 制制 剂剂 只只 增增 加加 酶酶 底底 结结 合合 表表 现现Km(Kmapp)Km(Kmapp)，即即I I浓浓度度增增加加，KmappKmapp就就增增加加；而而VmaxVmax则则保保持持不不变变。在在竞竞争争性性抑抑制制剂剂存存在在下下,要要到到达达最最大大反反应应速速度度VmaxVmax，必必须须加加入入更更高高底底物物浓浓度度。如如SS100Km100Km时，时，VmaxiVmaxi可达可达VmaxVmax。v竞争性抑制剂对酶促反应抑制程度，决定于竞争性抑制剂对酶促反应抑制程度，决定于II，SS，K Km m和和K Ki i大小。大小。II一定，增加一定，增加S,S,降低降低抑制程度；抑制程度；SS一定，增加一定，增加II，增加抑制程度，增加抑制程度，K Ki i值较低时，任何给定值较低时，任何给定II和和SS，抑制程度都较，抑制程度都较大；大；K Km m值越低，在一定值越低，在一定SS、II下，抑制程度越下，抑制程度越小。小。第8页竞争性抑制作用双倒数图竞争性抑制作用双倒数图 第9页竞争性抑制作用竞争性抑制作用KiKi求解求解 v从从双双倒倒数数图图计计算算出出表表观观米米氏氏常常数数K Kmappmapp，然然后后代代入入K Kmapp=mapp=K Km(1+I/m(1+I/K Ki)i)可计算出可计算出KiKi。v从从双双倒倒数数图图求求得得各各I I浓浓度度下下K Kmappmapp值值对对对对应应II再再作作图图，从从再再制制图图纵纵截截距距可可直直接接测测得得K Km m，从从其其横横截截距距可可直接测得直接测得K Ki i。v从不一样固定从不一样固定II下所作一簇直线斜率下所作一簇直线斜率1/S1/S对对应对对应II再制图，其纵截距为再制图，其纵截距为K Km/Vmax,m/Vmax,斜率为斜率为Km/VmaxKiKm/VmaxKi，横截距即为，横截距即为-K Ki i。第10页DixonDixon作图法求作图法求K Ki i 第11页竞争性抑制剂竞争性抑制剂ICIC5050值值 v取决于试验所用酶和底物浓度，当酶浓度固取决于试验所用酶和底物浓度，当酶浓度固定时，定时，ICIC5050值与值与K Ki i、K Km m和底物浓度和底物浓度SS呈以下呈以下关系：关系：v依据该方程式，当底物浓度大于依据该方程式，当底物浓度大于K Km m值时，值时，ICIC5050值高于值高于K Ki i值，尤其当底物浓度较高时，值，尤其当底物浓度较高时，K Ki i值值偏低愈加显著。偏低愈加显著。第12页第13页竞争性抑制剂结构特征竞争性抑制剂结构特征 v底物类似物底物类似物v因为人们对一个酶所催化底物性质了解比因为人们对一个酶所催化底物性质了解比较多，所以，经常利用酶底物类似物作为较多，所以，经常利用酶底物类似物作为竞争性抑制剂研究一些三维结构不清楚酶竞争性抑制剂研究一些三维结构不清楚酶活性中心结构。另外，也能够依据底物结活性中心结构。另外，也能够依据底物结构特点设计一些临床上使用药品。构特点设计一些临床上使用药品。第14页v比如，比如，-葡糖苷酶抑制剂如阿卡波糖葡糖苷酶抑制剂如阿卡波糖(acarbose)(acarbose)、伏格列波糖（伏格列波糖（voglibosevoglibose）和米格列醇）和米格列醇（MiglitolMiglitol）第15页v黄嘌呤氧化酶催化次黄嘌呤氧化成黄嘌呤，进而黄嘌呤氧化酶催化次黄嘌呤氧化成黄嘌呤，进而被氧化成尿酸，黄嘌呤氧化酶抑制剂被氧化成尿酸，黄嘌呤氧化酶抑制剂-别嘌呤醇别嘌呤醇治疗痛风病就是经过抑制黄嘌呤氧化酶，降低尿治疗痛风病就是经过抑制黄嘌呤氧化酶，降低尿酸生物合成。酸生物合成。第16页过渡态类似物过渡态类似物v酶催化化学反应效率高原因在于酶能与高能酶催化化学反应效率高原因在于酶能与高能态过渡态相结合，从而大大降低了化学反应态过渡态相结合，从而大大降低了化学反应活化能。活化能。v假如对催化某一特定生物化学反应酶三维结假如对催化某一特定生物化学反应酶三维结构尚不清楚，能够依据其生化反应过程，设构尚不清楚，能够依据其生化反应过程，设计合成含有特定结构、疏水性匹配、电子和计合成含有特定结构、疏水性匹配、电子和空间原因与过渡态类似稳定化合物，作为该空间原因与过渡态类似稳定化合物，作为该酶特异抑制剂，这无疑为药品合理分子设计酶特异抑制剂，这无疑为药品合理分子设计提供了另一强有力伎俩。提供了另一强有力伎俩。第17页v比比如如，乙乙酰酰胆胆碱碱酯酯酶酶(AChE)(AChE)羟羟基基与与酯酯酶酶酯酯解解部部位位形形成成共共价价键键，其其四四价价氮氮上上强强正正电电荷荷与与酯酯酶酶阴阴离离子子部部位位呈呈静静电电联联接接。酶酶乙乙酰酰化化很很快快造造成成酯酯键键断断裂裂和和胆胆碱碱消消除除，乙乙酰酰化化酶酶随随即即与与水水反反应应而而使使酶酶再再生生并并放出乙酸。放出乙酸。v氨基甲酸酯杀虫剂是乙酰胆碱酯酶水解过渡态稳氨基甲酸酯杀虫剂是乙酰胆碱酯酶水解过渡态稳定类似物，能与乙酰胆碱酯酶结合部位紧密结合定类似物，能与乙酰胆碱酯酶结合部位紧密结合而抑制乙酰胆碱酯酶。而抑制乙酰胆碱酯酶。第18页v又如苯甲酰丙氨醛是胰凝乳蛋白酶过渡态又如苯甲酰丙氨醛是胰凝乳蛋白酶过渡态抑制剂，其结构类似底物苯甲酰苯丙氨酰抑制剂，其结构类似底物苯甲酰苯丙氨酰化合物与酶形成共价中间物中底物酰基部化合物与酶形成共价中间物中底物酰基部分，比底物中肽键羰基更易受到酶活性中分，比底物中肽键羰基更易受到酶活性中心羟基亲核进攻，但不能形成酰化酶共价心羟基亲核进攻，但不能形成酰化酶共价中间物。中间物。第19页其它化合物其它化合物 v有有些些化化合合物物平平面面结结构构与与底底物物并并不不相相同同，但但立立体体构构象象十十分分相相近近，也也能能够够成成为为竞竞争性抑制剂。争性抑制剂。v非甾体抗炎药是一类含有非甾体抗炎药是一类含有不一样结构类型化合物，不一样结构类型化合物，因为选择性地抑制环氧合因为选择性地抑制环氧合酶活性，用作抗炎止痛药。酶活性，用作抗炎止痛药。环氧合酶抑制剂消炎痛和环氧合酶抑制剂消炎痛和底物花生四烯酸三维结构，底物花生四烯酸三维结构，整个分子立体构象中，羧整个分子立体构象中，羧基和双键配置有某种相同基和双键配置有某种相同性，因而竞争性地与环氧性，因而竞争性地与环氧合酶结合。合酶结合。第20页v塞来克西塞来克西(Celebrex)(Celebrex)作为环氧合酶（作为环氧合酶（COX2COX2，炎症细胞产生酶）特异性抑制剂，难以，炎症细胞产生酶）特异性抑制剂，难以进入开口较小进入开口较小COX1COX1活性中心通道，故而不活性中心通道，故而不能对其产生抑制作用，但仍能进入口径稍能对其产生抑制作用，但仍能进入口径稍大，后段略有柔性大，后段略有柔性COX2COX2通道，而能对通道，而能对COX2COX2产生抑制作用。产生抑制作用。第21页v一一些些竞竞争争性性抑抑制制剂剂化化学学结结构构与与底底物物结结构构没没有有任任何何关关系系，其其抑抑制制作作用用原原理理是是抑抑制制剂剂与与一一些些酶酶活活性性中中心心金金属属离离子子络络合合，妨妨碍碍了了底底物物进进入入，从从而而起起到到抑抑制制酶酶活活性目标。性目标。v比如比如5-5-脂氧合酶脂氧合酶(LOX)(LOX)活性中心含有一个非血红素活性中心含有一个非血红素铁原子，经过铁原子，经过FeFe2+2+与与FeFe3+3+循环实现其催化功效。该循环实现其催化功效。该酶一些抑制剂（酶一些抑制剂（CGS-23885,A-76745CGS-23885,A-76745）就是经过铁）就是经过铁螯合而与底物竞争性地与酶活性中心结合。螯合而与底物竞争性地与酶活性中心结合。第22页2 2，非竞争性抑制作用，非竞争性抑制作用 v经典非竞争性抑制经典非竞争性抑制剂不影响酶剂不影响酶-底物底物结合；底物也不影结合；底物也不影响酶响酶-I-I结合；结合；S S和和I I都可可逆独立地结都可可逆独立地结合于酶不一样部位合于酶不一样部位上；而且上；而且ESIESI为端为端点复合物。点复合物。第23页非竞争性抑制作用双倒数方程非竞争性抑制作用双倒数方程第24页非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用Ki Ki 求解求解 v从从II0 0和和II为为某某一一固固定定浓浓度度所所作作1/1/对对1/S1/S双双倒倒数数图图纵纵截截距距可可直直接接测测得得1/Vmax1/Vmax和和(1/Vmax)(1/Vmax)(1+I/Ki)(1+I/Ki)，从而计算出，从而计算出KiKi。v从从不不一一样样固固定定II所所作作双双倒倒数数图图斜斜率率1/S1/S对对II再制图可求得再制图可求得KiKi。v从不一样固定从不一样固定II所作双曲数图纵截距对所作双曲数图纵截距对II再制图，从其横截距可直接到得再制图，从其横截距可直接到得K Ki i。第25页DixonDixon作图法求作图法求KiKi 第26页非竞争性抑制剂非竞争性抑制剂ICIC5050值值 v非竞争性抑制剂非竞争性抑制剂ICIC5050值与底物浓度关系以下：值与底物浓度关系以下：v依据该式，当底物浓度较高时，依据该式，当底物浓度较高时，ICIC5050值靠近于值靠近于KiKi值；当底物浓度较低时，值；当底物浓度较低时，ICIC5050值显著低于值显著低于KiKi值。值。第27页非竞争性抑制剂结构特征非竞争性抑制剂结构特征 v因为非竞争性抑制剂并非结合于酶活性中心底物结因为非竞争性抑制剂并非结合于酶活性中心底物结合位点，而是活性中心附近一些区域或基团，不影合位点，而是活性中心附近一些区域或基团，不影响酶与底物亲和力。响酶与底物亲和力。v而非竞争性抑制剂作用部位不是十分清楚，所以，而非竞争性抑制剂作用部位不是十分清楚，所以，不能依据酶底物及酶活性中心结构设计非竞争性抑不能依据酶底物及酶活性中心结构设计非竞争性抑制剂。制剂。v当前所发觉一些酶非竞争性抑制剂大多数都是随机当前所发觉一些酶非竞争性抑制剂大多数都是随机筛选得到化合物。筛选得到化合物。第28页v比如，染料木素（比如，染料木素（genisteingenistein）对于）对于-葡萄糖葡萄糖苷酶抑制作用就是非竞争性抑制作用。他克林苷酶抑制作用就是非竞争性抑制作用。他克林(tacrine)(tacrine)是治疗老年痴呆症乙酰胆碱酯酶非是治疗老年痴呆症乙酰胆碱酯酶非竞争性抑制剂。竞争性抑制剂。第29页 3 3，反竞争性抑制作用，反竞争性抑制作用v反竞争性抑制剂反竞争性抑制剂I I不不能与自由酶结合，能与自由酶结合，而只能与而只能与ESES可逆结可逆结合生成不能分解成合生成不能分解成产物产物EISEIS。这一点与。这一点与竞争性抑制相反，竞争性抑制相反，K Ki i值为值为，EISEIS只能只能解离成解离成ES+IES+I，而，而不能解离成不能解离成EI+SEI+S。第30页v反竞争性抑制程度取决于反竞争性抑制程度取决于II、SS、K Ki i和和K Km m等。等。它抑制程度随底物浓度增加而增加。它抑制程度随底物浓度增加而增加。v反竞争性抑制剂使酶反竞争性抑制剂使酶KmKm值降低，即值降低，即KmappKmappKmKm。v从这点看，反竞争性抑制剂不是一个抑制剂，而从这点看，反竞争性抑制剂不是一个抑制剂，而像是一个激活剂。它之所以造成对酶促反应抑制像是一个激活剂。它之所以造成对酶促反应抑制作用，完全是因为它使作用，完全是因为它使VmaxVmax降低而引发。所以假降低而引发。所以假如如SS很小，反应主要为一级反应，则抑制剂对很小，反应主要为一级反应，则抑制剂对VmaxVmax影响几乎完全被对影响几乎完全被对KmKm相反影响所抵消。这时相反影响所抵消。这时几乎看不到抑制作用。几乎看不到抑制作用。第31页反竞争性抑制作用双倒数方程反竞争性抑制作用双倒数方程 第32页反竞争性抑制剂结构特征反竞争性抑制剂结构特征 v反竞争性抑制在单底物酶催化反应中比较少反竞争性抑制在单底物酶催化反应中比较少见见v胎盘碱性磷酸酯酶以葡萄糖胎盘碱性磷酸酯酶以葡萄糖-6-6-磷酸或磷酸或-萘酚萘酚磷酸酯为底物时，磷酸酯为底物时，L-L-苯丙氨酸为反竞争性抑苯丙氨酸为反竞争性抑制剂；制剂；v顺铂对乙酰胆碱酯酶抑制作用也是属于反竞顺铂对乙酰胆碱酯酶抑制作用也是属于反竞争类型。争类型。第33页v在双底物反应中，反竞争性抑制比较多见，如乒在双底物反应中，反竞争性抑制比较多见，如乒乓机制酶促反应时，因为乓机制酶促反应时，因为I I能够与能够与EBEB复合物结合，复合物结合，对一个底物（对一个底物（A A）表现竞争性抑制化合物（）表现竞争性抑制化合物（I I）对）对另一个底物（另一个底物（B B）展现反竞争性抑制。）展现反竞争性抑制。v如抗坏血酸对兔肌乳酸脱氢酶抑制作用，抗坏血如抗坏血酸对兔肌乳酸脱氢酶抑制作用，抗坏血酸相对于酸相对于NADHNADH表现为乳酸脱氢酶反竞争抑制，相表现为乳酸脱氢酶反竞争抑制，相对于丙酮酸为乳酸脱氢酶竞争性抑制剂。对于丙酮酸为乳酸脱氢酶竞争性抑制剂。第34页 4 4，混合性抑制作用，混合性抑制作用v混合性抑制作用中混合性抑制作用中S S和和E E或或EIEI都能够结合，都能够结合，I I也也可和可和E E或或ESES结合，但亲和力都不相等，表明结合，但亲和力都不相等，表明S S和和I I对酶结合互有影响，对酶结合互有影响，K Ki i和和K Ki i二者既不二者既不等于无穷大，又互不相等，等于无穷大，又互不相等，KsKsi i和和K Ks s也不相也不相等。相关可逆抑制作用通式就是混合性抑制等。相关可逆抑制作用通式就是混合性抑制作用公式。作用公式。第35页v当用双倒数方程作图时，有抑制剂和无抑制剂当用双倒数方程作图时，有抑制剂和无抑制剂直线既不平行，又不相交于纵轴或横轴，而是直线既不平行，又不相交于纵轴或横轴，而是相交于横轴负侧上方（第二象限）或下方（第相交于横轴负侧上方（第二象限）或下方（第三象限）三象限）第36页二、不可逆抑制作用二、不可逆抑制作用v这类抑制作用抑制剂与酶分子上某基团以牢这类抑制作用抑制剂与酶分子上某基团以牢靠共价健结合使酶失活。不能用透析、超滤靠共价健结合使酶失活。不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。等物理方法除去抑制剂而使酶复活。v不可逆抑制作用特点是随时间延长会逐步地不可逆抑制作用特点是随时间延长会逐步地增加抑制，最终到达完全抑制增加抑制，最终到达完全抑制。第37页 1 1，非专一性不可逆抑制作用，非专一性不可逆抑制作用v(1)(1)酰化剂酰化剂 可用通式表示为可用通式表示为RCOXRCOX。比如，。比如，醋酸酐、三氟乙酸硫醇酯、乙酰咪唑等。醋酸酐、三氟乙酸硫醇酯、乙酰咪唑等。它们对酶酰化反应以下式它们对酶酰化反应以下式：第38页v磷酰化剂亦属这类，如二异丙氟磷酸酯磷酰化剂亦属这类，如二异丙氟磷酸酯(DFP)(DFP)以及以及16051605、10591059等有机磷酸农药以等有机磷酸农药以及神经毒剂。及神经毒剂。DFPDFP能使乙酰胆碱酯酶分子能使乙酰胆碱酯酶分子中一个丝氨酸侧链中一个丝氨酸侧链(Ser-CH(Ser-CH2 2OH)OH)磷酸化而磷酸化而使酶失活。使酶失活。第39页(2)(2)烃基化剂烃基化剂v可用通式可用通式R-XR-X表示。如卤烃衍生物，因为卤原子表示。如卤烃衍生物，因为卤原子强电负性，使烃基带部分正电荷，有利于酶上一强电负性，使烃基带部分正电荷，有利于酶上一些亲核基团攻击，反应以下式：些亲核基团攻击，反应以下式：第40页(3)(3)含活泼双键试剂含活泼双键试剂v含活泼双键试剂，如含活泼双键试剂，如N-N-乙基顺丁烯二酰亚胺、丙乙基顺丁烯二酰亚胺、丙烯氰等，它们可与酶分子上烯氰等，它们可与酶分子上-SH-SH、-NH2-NH2等基团起加等基团起加成反应，以下式：成反应，以下式：第41页(4)(4)亲电试剂亲电试剂v常见有四硝基甲烷，它可使酶分子上酪氨酸常见有四硝基甲烷，它可使酶分子上酪氨酸侧链硝基化。产物含有特殊光谱性质，易于侧链硝基化。产物含有特殊光谱性质，易于被检测。反应以下式：被检测。反应以下式：第42页2 2，指向活性部位抑制剂，指向活性部位抑制剂 v 指向活性部位抑制剂作用特征是指向活性部位抑制剂作用特征是,抑制剂分子中含抑制剂分子中含有化学活泼功效基，它与酶活性部位处基团或原子有化学活泼功效基，它与酶活性部位处基团或原子发生共价结合，使酶失活。发生共价结合，使酶失活。v这类抑制剂通常是在物物分子所特有识别基团上连这类抑制剂通常是在物物分子所特有识别基团上连接或修饰有反应活性化学基团或原子，当抑制剂与接或修饰有反应活性化学基团或原子，当抑制剂与酶形成初始可逆性复合物后，该反应活性功效基与酶形成初始可逆性复合物后，该反应活性功效基与酶活性中心发生化学反应，形成共价键，以致改变酶活性中心发生化学反应，形成共价键，以致改变了酶氨基酸残基排布了酶氨基酸残基排布(构象构象)而失活而失活 第43页v引入化学活性基团有卤代酰基，卤代酮、偶氮引入化学活性基团有卤代酰基，卤代酮、偶氮岭甲基酮、环氧基、亚磺酰氟、不饱和键、二岭甲基酮、环氧基、亚磺酰氟、不饱和键、二硫键、光敏基团等。硫键、光敏基团等。v这类抑制剂与酶反应速率应比类似非酶性反应这类抑制剂与酶反应速率应比类似非酶性反应快，比如，含有很好离去基团有机磷化合物对快，比如，含有很好离去基团有机磷化合物对丝氨酸蛋白酶不可逆抑制作用是因为在活性部丝氨酸蛋白酶不可逆抑制作用是因为在活性部位丝氨酸处发生磷酰化，生成磷酰化酶。位丝氨酸处发生磷酰化，生成磷酰化酶。v这些抑制剂并非单纯活泼磷酰化试剂，因为它这些抑制剂并非单纯活泼磷酰化试剂，因为它们对于亲核试剂反应活性并不高。比如，对丝们对于亲核试剂反应活性并不高。比如，对丝氨酸蛋白酶和乙酰胆碱酯酶磷酰化速率比与水氨酸蛋白酶和乙酰胆碱酯酶磷酰化速率比与水反应速率快反应速率快10108 8-10-101212倍倍。第44页3 3，酶自杀性底物抑制作用，酶自杀性底物抑制作用 v这类抑制剂展现其活性是在酶催化过程实现。这这类抑制剂展现其活性是在酶催化过程实现。这类抑制剂结构与底物有很大相同性，与酶分子有类抑制剂结构与底物有很大相同性，与酶分子有较高亲和力，它本身无化学活性或者没较高亲和力，它本身无化学活性或者没 有化学活性基团，有化学活性基团，但在酶催化作用但在酶催化作用 下，产生了化学活下，产生了化学活 性亲电性基团，性亲电性基团，从而与酶活性部位从而与酶活性部位 处亲核性基团发生处亲核性基团发生 不可逆结合反应，不可逆结合反应，使酶失活。使酶失活。第45页自杀性底物含有以下结构特征和性能自杀性底物含有以下结构特征和性能v(1)同正常底物化学结构含有相同性；同正常底物化学结构含有相同性；v(2)(2)能够同酶结合成复合物，有较大亲和力；能够同酶结合成复合物，有较大亲和力；v(3)(3)在在通通常常状状态态下下，有有低低反反应应性性能能或或化化学学惰惰性性基基团或结构片断；团或结构片断；v(4)(4)在在酶酶催催化化阶阶段段，可可将将惰惰性性基基团团转转化化为为反反应应性性能强中间体；能强中间体；v(5)(5)与酶活性部位发生化学反应，尤其是共价键与酶活性部位发生化学反应，尤其是共价键合，使酶不可逆失活。合，使酶不可逆失活。第46页酶自杀性底物功效基团类型酶自杀性底物功效基团类型 第47页v酶自杀性底物特异性是基于它与正常底物结构酶自杀性底物特异性是基于它与正常底物结构相同性、这是酶与该抑制剂结合成复合物并经相同性、这是酶与该抑制剂结合成复合物并经催化反应暴露出活性基团前提。催化反应暴露出活性基团前提。v所暴露出反应活性基团大多是亲电基团。所暴露出反应活性基团大多是亲电基团。v比如比如,不饱和羰基不饱和羰基(醛、酮、亚胺或酯等醛、酮、亚胺或酯等)，与酶分子亲核基团发生迈克尔加成反应与酶分子亲核基团发生迈克尔加成反应 第48页v,不饱和羰基产生是酶催化反迈克尔加不饱和羰基产生是酶催化反迈克尔加成，生成负碳型中间体被负电性羰基共成，生成负碳型中间体被负电性羰基共振稳定化，使邻位碳发生消去反应或去振稳定化，使邻位碳发生消去反应或去质子化，生成邻位不饱和键。质子化，生成邻位不饱和键。第49页四种类型可逆抑制比较四种类型可逆抑制比较 v不一样类型可逆抑制作用能够利用双倒数作不一样类型可逆抑制作用能够利用双倒数作图法来区分，依据图中有没有抑制剂时直线图法来区分，依据图中有没有抑制剂时直线是否相交于是否相交于1/S1/S轴，还是轴，还是1/V1/V轴就能够区分。轴就能够区分。第50页 表7-1 四类可逆抑制剂动力学比较抑制类型抑制类型速率方程速率方程表观表观K Km m表观表观 VmaxVmax无抑制无抑制K Km mV Vmaxmax竞争性竞争性增大增大不变不变非竞争性非竞争性不变不变减小减小反竞争性反竞争性减小减小减小减小混合性混合性减小或增大减小或增大减小减小第51页第二节第二节 化学物质对酶激活作用化学物质对酶激活作用 v有些化学物质作用与抑制剂作用相反，对酶起着激有些化学物质作用与抑制剂作用相反，对酶起着激活作用，加强酶作用效果。活作用，加强酶作用效果。v在一些情况下，只有在激活剂存在下，酶催化反应在一些情况下，只有在激活剂存在下，酶催化反应才能进行，或者说只有在激活剂存在下催化反应速才能进行，或者说只有在激活剂存在下催化反应速度才能测得出来。度才能测得出来。v凡凡是是能能提提升升酶酶活活性性物物质质，都都称称为为激激活活剂剂，激激活活剂剂普普通通是是无无机机离离子子活活简简单单有有机机化化合合物物，而而高高分分子子物物质质较较少。少。第52页激活剂激活机制激活剂激活机制v激激活活剂剂之之所所以以能能够够提提升升酶酶催催化化活活性性，其其主主要要原原因因有有两种：两种：v一一是是激激活活剂剂与与酶酶分分子子结结合合，改改变变了了酶酶活活性性中中心心及及其其附附近近构构象象，从从而而增增强强了了酶酶与与底底物物亲亲合合能能力力，或或者者是是增加了产物离去速度，进而提升酶催化活力；增加了产物离去速度，进而提升酶催化活力；v二二是是激激活活剂剂与与底底物物分分子子结结合合再再与与酶酶分分子子结结合合，使使底底物物分分子子电电子子密密度度或或分分子子张张力力发发生生改改变变，有有利利于于产产物物形成，从而提升酶催化活力。形成，从而提升酶催化活力。第53页一、激活剂类型一、激活剂类型 v激激活活剂剂类类型型除除了了在在生生物物体体内内起起激激活活作作用用蛋蛋白白质质分分子子（如如酶酶原原激激活活）以以外外，按按照照分分子子大大小小能够分为三种类型。能够分为三种类型。v即：无机离子、有机分子和高分子物质。即：无机离子、有机分子和高分子物质。第54页1 1，含有巯基还原剂，含有巯基还原剂 v半胱氨酸、半胱氨酸、2-2-巯基乙醇和还原型谷胱甘肽等都含有巯基乙醇和还原型谷胱甘肽等都含有巯基，能够使酶分子中被氧化巯基，能够使酶分子中被氧化-SH-SH基还原，从而提升基还原，从而提升酶催化活力。酶催化活力。v如半胱氨酸、如半胱氨酸、2-2-巯基乙醇和还原型谷胱甘肽等对腺巯基乙醇和还原型谷胱甘肽等对腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、木瓜蛋白酶、蜡样芽苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、木瓜蛋白酶、蜡样芽胞杆菌蛋白酶、胞杆菌蛋白酶、D-D-甘油醛甘油醛-3-3-磷酸脱氢酶等均含有激磷酸脱氢酶等均含有激活作用。活作用。v半胱氨酸半胱氨酸 (20mM)(20mM)、2-2-巯基乙醇巯基乙醇(10mM)(10mM)和谷胱甘肽和谷胱甘肽 (10mM)(10mM)分别使未活化腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶分别使未活化腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性提升活性提升1.31.3、3.53.5和和2.82.8倍。倍。第55页巯基配位作用巯基配位作用v这这些些含含有有巯巯基基化化合合物物还还能能够够作作为为金金属属酶酶活活性性中中心心轴轴向向配配体体从从而而激激活活酶酶催催化化作作用用，如如巯巯基基苯苯甲甲酸酸、巯巯基基乙乙酸酸、半半胱胱氨氨酸酸对对细细胞胞色色素素 P450P450、过过氧氧化化氢酶激活作用。氢酶激活作用。v过过氧氧化化氢氢酶酶被被巯巯基基乙乙酸酸激激活活后后，其其kmkm值值减减小小、kcat/kmkcat/km增增大大，即即巯巯基基乙乙酸酸能能够够提提升升过过氧氧化化氢氢酶酶对底物亲和力及底物专一性。对底物亲和力及底物专一性。v巯巯基基乙乙酸酸一一样样能能够够引引发发过过氧氧化化氢氢酶酶可可见见光光谱谱蓝蓝移移及及酶酶分分子子色色氨氨酸酸残残基基荧荧光光强强度度减减小小，从从而而使使过过氧氧化化氢氢酶酶活活性性中中心心铁铁卟卟啉啉周周围围环环境境发发生生改改变变，以以到到达提升酶活力之目标。达提升酶活力之目标。第56页2 2，多羟基化合物，多羟基化合物 v多羟基化合物如甘油、乙二醇、糖类物质等不但能多羟基化合物如甘油、乙二醇、糖类物质等不但能够作为酶稳定剂使用，而且它们对许多酶含有激活够作为酶稳定剂使用，而且它们对许多酶含有激活作用。作用。v比如，在比如，在 MgMg2+2+或或 MnMn2+2+存在情况下，蔗糖对天冬氨存在情况下，蔗糖对天冬氨酸酶含有较强激活作用，天冬氨酸酶催化活力同不酸酶含有较强激活作用，天冬氨酸酶催化活力同不加蔗糖时相比可提升加蔗糖时相比可提升5.185.18倍，一样当甘油加入含酶倍，一样当甘油加入含酶体系，酶活力有一定程度提升。体系，酶活力有一定程度提升。v这种激活作用可能与甘油和蔗糖羟基相关，且这种这种激活作用可能与甘油和蔗糖羟基相关，且这种激活作用必须与激活作用必须与MgMg2+2+或或 MnMn2+2+离子结合起来才能发挥离子结合起来才能发挥作用。作用。第57页v另另外外，对对腺腺苷苷二二磷磷酸酸葡葡萄萄糖糖焦焦磷磷酸酸化化酶酶起起激激活活作作用用物物质质除除了了半半胱胱氨氨酸酸、2-2-巯巯基基乙乙醇醇和和还还原原型型谷谷胱胱甘甘肽肽等等以以外外，3-3-磷磷酸甘油是其最有效激活剂。酸甘油是其最有效激活剂。v用用0.1mol/L 0.1mol/L 3-3-磷磷酸酸甘甘油油作作为为激激活活剂剂可可使使腺腺苷苷二二磷磷酸酸葡葡萄萄糖焦磷酸化酶糖焦磷酸化酶VmaxVmax提升近提升近4 4倍。倍。v3-3-磷磷酸酸甘甘油油对对腺腺苷苷二二磷磷酸酸葡葡萄萄糖糖焦焦磷磷酸酸化化酶酶激激活活取取决决于于3-3-磷磷酸酸甘甘油油与与腺腺苷苷二二磷磷酸酸葡葡萄萄糖糖焦焦磷磷酸酸化化酶酶巯巯基基结结合合和和环环境境值。值。v氧氧化化或或除除去去巯巯基基，腺腺苷苷二二磷磷酸酸葡葡萄萄糖糖焦焦磷磷酸酸化化酶酶活活性性显显著著下下降降；在在只只有有3-3-磷磷酸酸甘甘油油作作为为腺腺苷苷二二磷磷酸酸葡葡萄萄糖糖焦焦磷磷酸酸化化酶酶激激活活因因子子情情况况下下,对对3-3-磷磷酸酸甘甘油油有有很很大大影影响响，在在pHpH值值为为7.57.5、8.08.0、8.58.5和和9.09.0时时,腺腺苷苷二二磷磷酸酸葡葡萄萄糖糖焦焦磷磷酸酸化化酶活性分别提升了酶活性分别提升了3.13.1、2.92.9、4.84.8和和9.59.5倍。倍。第58页v乙二醇在乙二醇在0.30.33mol/L3mol/L浓度范围内对浓度范围内对-葡萄葡萄糖醛酸苷酶含有激活作用，其最适浓度为糖醛酸苷酶含有激活作用，其最适浓度为1.5mol/L1.5mol/L。v其激活机理可能是因为乙二醇与底物水解其激活机理可能是因为乙二醇与底物水解产物产物-葡萄糖醛酸形成苷式结合，降低了葡萄糖醛酸形成苷式结合，降低了产物抑制效应，从而提升了酶促反应，使产物抑制效应，从而提升了酶促反应，使酶活性升高。酶活性升高。第59页3 3，变性剂，变性剂 v一一些些变变性性剂剂如如脲脲、盐盐酸酸胍胍等等能能够够完完全全破破坏坏酶酶蛋蛋白白空空间间构构象象，使使酶酶失失去去活活性性。不不过过当当变变性性剂剂浓浓度度较较低低时时，酶酶蛋蛋白白仅仅仅仅发发生生了了部部分变性。分变性。v因因为为酶酶活活性性中中心心附附近近多多肽肽链链柔柔性性，部部分分变变性性使使活活性性中中心心空空间间构构象象发发生生改改变变，有有利利于于底底物物结结合合以以及及产产物物离离去去，从从而而使使酶酶催催化化活活性提升。性提升。第60页v比如，在比如，在5 5 C C、2020 C C、3030 C C，鸡肝二氢叶酸，鸡肝二氢叶酸还原酶伴随盐酸胍浓度还原酶伴随盐酸胍浓度增加而增高，线经历一增加而增高，线经历一个激活过程后，再开始个激活过程后，再开始失活。失活。2mol/L2mol/L脲可使二脲可使二氢叶酸还原酶活力提升氢叶酸还原酶活力提升3.63.6倍，而且酶活力能倍，而且酶活力能够稳定够稳定1212小时。小时。4mol/L4mol/L脲可使二氢叶酸还原酶脲可使二氢叶酸还原酶催化活力提升大约催化活力提升大约5 5倍，倍，但激活后酶很快失去活但激活后酶很快失去活力。力。曲线曲线1 1和和2 2是在脲加入后马上检测，是在脲加入后马上检测，曲线曲线3 3和和4 4是在脲加入是在脲加入1212小时后检测小时后检测 第61页v一样不一样浓度脲和一样不一样浓度脲和盐酸胍也能够激活腺盐酸胍也能够激活腺苷酸激酶，当脲浓度苷酸激酶，当脲浓度低于低于1.8mol/L1.8mol/L时，腺时，腺苷酸激酶二级和三级苷酸激酶二级和三级结构没有尤其显著改结构没有尤其显著改变，不过酶催化活力变，不过酶催化活力却显著提升，在脲浓却显著提升，在脲浓度到达度到达1mol/L1mol/L时，提时，提升了升了1.6 1.6 倍。而伴随倍。而伴随脲浓度增加，酶催化脲浓度增加，酶催化活力没有继续提升，活力没有继续提升，反而开始下降。反而开始下降。-278nm-278nm处处光光吸吸收收改改变变；-222nm-222nm处处CDCD光光谱谱改改变；变；-酶相对活性酶相对活性-ANS-ANS荧光标识相对强度；荧光标识相对强度；-ANS-ANS荧光标识慢荧光标识慢相速度常数相对值相速度常数相对值 第62页不一样浓度下不一样浓度下ANSANS与腺苷酸结合慢相速率常数与腺苷酸结合慢相速率常数 第63页4 4，有机溶剂和表面活性剂，有机溶剂和表面活性剂 v在一些情况下，低浓度有机溶剂和表面活性在一些情况下，低浓度有机溶剂和表面活性剂能够有利于底物溶解，同时也能够使酶分剂能够有利于底物溶解，同时也能够使酶分子部分变性，从而提升酶分子催化活性。子部分变性，从而提升酶分子催化活性。v如在如在5%-10%5%-10%乙醇乙醇-磷酸盐缓冲溶液中，酪氨酸磷酸盐缓冲溶液中，酪氨酸酶和漆酶催化活力能够提升酶和漆酶催化活力能够提升30-50%30-50%。第64页v而甲醇、乙醇、丙醇和丁醇对青霉素而甲醇、乙醇、丙醇和丁醇对青霉素V V酰化酶诱导激活酰化酶诱导激活过程中，醇分子是以有机分子形式起作用。其激活机过程中，醇分子是以有机分子形式起作用。其激活机制如图所表示。制如图所表示。第65页第66页表面活性剂表面活性剂v如如Tween Tween 8080处处理理Bacillus Bacillus megateriummegaterium酯酯酶酶，可可使使酶酶催催化化对对硝硝基基苯苯酚酚己己酯酯KmKm值值降降低低，而而Kcat/KmKcat/Km值值提提升升1414倍。倍。v非非离离子子表表面面活活性性剂剂浓浓度度在在0.1%0.1%0.8%0.8%时时，吐吐温温8080、聚聚乙乙二二醇醇等等作作为为纤纤维维素素酶酶激激活活剂剂，可可使使纤纤维维素素酶酶活力提升活力提升20%-50%20%-50%。v而而阴阴离离子子表表面面活活性性剂剂浓浓度度在在0.1%0.1%0.8%0.8%时时，如如十十二烷基磺酸钠也可作为纤维素酶激活剂。二烷基磺酸钠也可作为纤维素酶激活剂。第67页5 5，小分子有机化合物，小分子有机化合物 v在有机胺类化合物（二乙胺、二异丙胺、三乙胺、在有机胺类化合物（二乙胺、二异丙胺、三乙胺、吡啶等）存在下，磷酸三酯酶催化活性伴随有机