NY∕T 4194.1-2022 化学农药 鸟类急性经口毒性试验准则 第1部分：序贯法.pdf

2022?11?11发布2023?03?01实施化学农药鸟类急性经口毒性试验准则第1部分：序贯法17中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXX65.050CCS B4194.12022Chemical pesticideGuideline for avian acute oral toxicity testPart 1:Sequential procedure中华人民共和国农业农村部发 布N Y/T 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.NY/T 化学农药 鸟类急性经口试验准则 分为个部分:第部分:序贯法;第部分:经典剂量效应法.本文件是NY/T 化学农药鸟类急性经口试验准则 的第部分.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口.本文件负责起草单位:农业农村部农药检定所.本文件主要起草人:周艳明、袁善奎、刘伟、单炜力、周欣欣、陈朗、蓝帅.N Y/T 化学农药鸟类急性经口毒性试验准则第部分:序贯法范围本文件规定了用序贯法测定鸟类急性经口毒性的试验方法.本文件适用于化学农药,生物化学农药和植物源农药可参照执行,不适用于微生物农药.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.NY/T 农药登记环境风险评估指南第部分:鸟类术语和定义下列术语和定义适用于本文件.逆转 r e v e r s a l在个相邻的处理组中,低剂量处理组的死亡率高于高剂量处理组死亡率的现象.部分死亡p a r t i a lk i l l多只受试鸟给予同样剂量的被试物,死亡率介于 的现象.试验概述试验由多个阶段组成,每个阶段将被试物按设计剂量经口灌喂至受试鸟嗉囊或腺胃.给药后,观察 d,通常根据给药后d各处理组受试鸟的死亡情况估算半致死剂量(L D)并设置下一阶段的试验剂量.以全部阶段的试验结果计算被试物对受试鸟的L D、置信区间和剂量效应曲线斜率.试验方法 受试鸟选择受试鸟应满足以下要求:物种宜选择吐食习性低的鸟类,如鸡形目的日本鹌鹑(C o t u r n i xj a p o n i c a)或山齿鹑(C o l i n u sv i r g i n i a n u s);为开展物种敏感性分布或在风险评估中使用毒性终点的几何平均值,可选择雁形目的绿头鸭(A n a sp l a t y r h y n c h o s)、鸽形目的原鸽(C o l u m b a l i v i a)、雀形目的斑胸草雀(T a e n i o p y g i ag u t t a t a,曾用名:P o e p h i l ag u t t a t a)、鹦形目的虎皮鹦鹉(M e l o p s i t t a c u su n d u l a t u s)等鸟类;受试鸟在本实验室中的自然死亡率应;应选择人工繁育的鸟类,不应使用野生鸟类;受试鸟应为不处于繁殖期的成鸟;宜使用野生表型的鸟类,不能使用野生表型时应选择不同表型杂交的鸟类;受试鸟应为同一来源、同一繁殖种群,宜定期远亲交配以保持遗传异质性;受试鸟日龄应大致相同.试验可使用单一性别受试鸟,也可混用雌鸟和雄鸟.对于可能导致雌雄鸟类敏感性差异的被试物,试验设计应能分别计算对雌性和雄性的L D.N Y/T 受试鸟驯养和试验条件 每处理只受试鸟时,应单笼饲养;每处理多只受试鸟时,至少在给药后前d应单笼饲养以便观察并记录每只受试鸟的症状.对斑胸草雀等群居物种,鸟笼应紧靠在一起,其他物种也宜将鸟笼紧靠在一起,除非鸟表现出攻击行为.每只鸟最小栖息面积为:原鸽 c m、绿头鸭 c m、日本鹌鹑和山齿鹑 c m、斑胸草雀和虎皮鹦鹉 c m.鸟笼底部应为网状结构,网眼大小应能使粪便落下且不应影响鸟类活动.原鸽、斑胸草雀和虎皮鹦鹉的鸟笼中应设置栖木.试验可在人工控制的环境下进行,也可在符合要求的温度和湿度下进行.日本鹌鹑、山齿鹑和绿头鸭的试验温度应为 ,但试验期间波动应尽可能小.鸟类饲养和观察室内应通风良好,空气每小时至少交换 次.日本鹌鹑、山齿鹑和绿头鸭每日光照时间为h,其他鸟类可延长至 h.应提供充足的饲料和水,并及时更换.可使用商品饲料和维生素,但应符合所用物种的营养需求.试验期间和给药前 d应避免药物治疗.饲料和水应定期测定重金属(如砷、镉、铅、汞、硒等)和持久性农药(如有机氯农药等)等污染物.受试鸟准备每只受试鸟均应有单独标识.试验开始前应在试验条件下预养至少 d,预养期间死亡率的鸟类不应用于试验.给药 被试物置于胶囊中或溶解、分散于合适的载体后,经口灌喂至受试鸟嗉囊或腺胃;对于液体制剂,也可直接经口灌喂至受试鸟嗉囊或腺胃.当被试物可被水溶解或分散时,应首先考虑使用水作为载体,其次可考虑溶解或乳化于玉米油等食用油中,均不可行时再考虑其他载体.使用水以外的载体时,应了解载体的毒性,载体不应引起吐食.注:可用食用色素亮蓝(C A S:)等与粪便颜色明显不同的无毒染料使饲料染色,以观察是否出现吐食现象.吐食可能与给药技术或被试物性质有关,减少给药体积、使用胶囊或更换载体可能消除或降低吐食频率.特别是使用雀形目鸟类时,宜先进行预试验来评估受试鸟的吐食习性,如果仍然存在吐食现象应考虑更换另一种鸟类.受试鸟存在吐食现象时不能精确计算出L D,仅能得出被试物的L D 大于引发吐食和死亡的最低剂量.每只受试鸟的给药剂量应根据给药前 h内该鸟所测个体体重确定.给药体积应尽量小,不应超过m L/g体重,处理组和对照组的所有受试鸟的给药体积/体重比应相同.给药前一晚受试鸟应禁食 h h,日本鹌鹑等较大的受试鸟宜整夜禁食,体重 g的受试鸟应禁食h.观察 给药后按以下要求确定观察频率和时间:给药后hh应持续观察受试鸟的中毒症状及是否出现吐食;给药后hd应在光照期内至少等间隔观察次中毒症状;给药后d d每日应至少观察次中毒症状;给药后 d仍能观察到中毒症状或死亡时,应延长观察时间至无中毒症状,某一试验阶段延长观察时间,后续试验阶段也应延长观察时间.应观察记录每只受试鸟的吐食、中毒症状及缓解表现、异常行为、体重,受试鸟出现死亡时应记录死亡时间.物理损伤等明显不是被试物导致的偶然死亡应在结果计算中排除.对照组出现偶然死亡时,应增加对照组的受试鸟数量.应在给药前及给药后d、d和 d测定受试鸟的体重;给药后dd应每日测定食物消耗量,其后应测定d d和d d的食物消耗量.若延长观察时间,最后一次体重和食物消耗量应在试验结束时测定.所有死亡受试鸟应进行大体解剖、试验结束时对处理组和对照组的未死亡受试鸟进行大体解剖以鉴别偶然死亡和中毒症状,处理组和对照组均未出现死亡和明显中毒症状时可不解剖.试验期间,按附录A判断受试鸟状态,其有明显疼痛或处于濒死状态时,经试验项目负责人评估继续观察不能得出对试验有用的信息时,应实施安乐死并计入死亡数.N Y/T 试验程序 限度试验 对毒性可能较低的被试物,宜开展限度试验.按NY/T 计算出的鸟类P E Da c u t e的 倍或 m g被试物/k g体重(取高值)设置限度试验剂量,处理组和对照组各只鸟,给药后观察 d.若处理组受试鸟均未死亡,表明在 置信水平下被试物的L D 限度剂量,试验可终止.限度试验的流程按附录B的B 操作.若处理组中有只受试鸟死亡,其他受试鸟未出现中毒症状,可再用只鸟按限度剂量给药并观察 d.第次限度剂量给药或序贯法试验可在 d观察期内开始.若整个处理组 只受试鸟中仅有只死亡且其他受试鸟未出现中毒症状,表明在 置信水平下被试物的L D 限度剂量,试验可终止.经试验项目负责人和委托方协商也可不进行第次限度剂量给药,直接进行序贯法试验第阶段试验.若处理组受试鸟全部死亡,进行序贯法试验的第阶段试验.若只受试鸟的处理组中有只受试鸟死亡且其余受试鸟出现中毒症状,或有只只受试鸟死亡,或 只受试鸟的处理组中出现只或只以上死亡时,进行序贯法试验的第阶段试验.按附录C估算L D,当限度剂量为 m g被试物/k g体重时可按表估算.表根据限度试验死亡率估算L D 死亡率,预估L D,m g被试物/k g体重 序贯法试验 序贯法试验概述 对毒性可能较高的被试物,可直接开展序贯法试验.序贯法试验的流程见附录B的B ,典型的个阶段试验、天观察期的时间线示例见附录D的D .当试验目的是为开展物种敏感性分布而获得L D 时,可仅进行第阶段和第阶段的试验,并计算L D,但此时无法得出置信区间.当个以上处理组出现部分死亡或逆转时,采用最大似然法计算被试物对受试鸟的L D.判断部分死亡和逆转的示例见附录E的E .第阶段试验 确定剂量按以下要求确定第阶段试验的试验剂量:根据被试物对啮齿类动物或其他鸟类的试验结果,或限度试验结果预估L D;最低剂量(剂量)预估L D、最高剂量(剂量)预估L D;当最高剂量 m g被试物/k g体重时,最高剂量设定为 m g被试物/k g体重并重新计算最低剂量(最低剂量最高剂量/);公比为 ;根据最低剂量和公比计算剂量和剂量,剂量剂量公比,剂量剂量公比.给药根据 计算的剂量,按 的要求给药,每剂量只鸟.观察观察一段时间(通常为d),记录受试鸟死亡情况并按表估算L D,继续观察至 d.若观察到延迟效应,应延长观察时间.若根据第d的情况判断仍可能出现受试鸟死亡,应待所有存活受试鸟恢复后再估算L D.若估算L D 前的观察期延长,后续阶段也应在估算L D 前相应延长观察期.N Y/T 表根据第阶段结果估算L D 的方法剂量剂量剂量剂量估算的L D OaOOO(剂量剂量c)/OOOXb(剂量剂量)/OOXO(剂量剂量)/OXOO剂量XOOO(剂量剂量)/OOXX(剂量剂量)/OXXO剂量XXOO(剂量剂量)/OXOX(剂量剂量)/XOXO(剂量剂量)/XOOX剂量OXXX(剂量剂量)/XOXX(剂量剂量)/XXOX剂量XXXO(剂量剂量)/XXXX(剂量d剂量)/a“O”代表受试鸟存活.b“X”代表受试鸟死亡.c仅用于估算L D,剂量剂量公比.d仅用于估算L D,剂量剂量/公比.第阶段试验 确定剂量按以下要求确定第阶段试验的试验剂量:根据第阶段试验结果或出现部分死亡的限度试验结果估算L D;最低剂量(剂量)预估L D、最高剂量(剂量)预估L D;当最高剂量 m g被试物/k g体重时,最高剂量设定为 m g被试物/k g体重并重新计算最低剂量(最低剂量最高剂量/);公比(最高剂量/最低剂量)/;按公式()计算个中间剂量,i.d o s eil d o s es t epi()式中:d o s ei 第i个剂量;l d o s e 最低剂量;s t e p 公比.给药根据 计算的剂量,按 的要求给药,每剂量只鸟.观察 观察一段时间(通常为d,但若第阶段延长观察时间时,应相应延长观察时间),记录受试鸟死亡情况、统计逆转数,用限度试验、第阶段和第阶段的数据按多元概率比回归模型(p r o b i t模型)估算L D 及剂量效应曲线的斜率(斜率),继续观察至 d.若 d后观察到延迟效应,应延长观察时间.若根据第d的情况判断仍可能出现受试鸟死亡,应待所有存活受试鸟恢复后再估算L D.若估算L D 前的观察期延长,后续阶段也应在估算L D 前相应延长观察期.若逆转,进行第 a阶段试验,否则进行第 b阶段试验.当试验目的是为开展物种敏感性分布而获得L D 时,观察至 d,用限度试验、第阶段和第阶段的数据按多元概率比回归模型计算L D,试验结束.N Y/T 第 a阶段试验 确定剂量按以下要求确定第 a阶段试验的试验剂量:第阶段试验估算出的斜率 时,斜率设定为;斜率时,斜率设定为;不能计算斜率时,斜率设定为;低剂量(/斜率)预估L D,高剂量(/斜率)预估L D;当高剂量 m g被试物/k g体重时,高剂量设定为 m g被试物/k g体重并重新计算低剂量 低剂量高剂量/(/斜率).给药根据 计算的剂量,按 的要求给药,每剂量只鸟.观察观察至 d(若第阶段或第阶段延长观察时间,应相应延长观察时间),用限度试验、第阶段、第阶段和第 a阶段的数据按多元概率比回归模型计算L D 和斜率,试验结束.若不符合多元概率比回归模型,应在报告中说明,并以死亡率最接近 的剂量(低于 和高于 各个)的几何平均值作为L D,也可用插值法或移动平均法估算L D.第 b阶段试验 确定剂量按以下要求确定第 b阶段试验的试验剂量:最低剂量(剂量)预估L D、最高剂量(剂量)预估L D;当最高剂量 m g被试物/k g体重时,最高剂量设定为 m g被试物/k g体重并重新计算最低剂量(最低剂量最高剂量/);公比(最高剂量/最低剂量)/;按公式()计算个中间剂量,i.给药根据 计算的剂量,按 的要求给药,每剂量只鸟.观察观察一段时间(通常为d,但若第、阶段延长观察时间应相应延长观察时间),记录受试鸟死亡情况,用限度试验、第、b阶段的数据按多元概率比回归模型估算L D 及斜率,继续观察至 d.若 d后观察到延迟效应,应延长观察时间.若根据第d的情况判断仍可能出现受试鸟死亡,应待所有存活受试鸟恢复后再估算L D.若估算L D 前的观察期延长,后续阶段也应在估算L D 前相应延长观察期.若逆转或部分死亡,不需进行第阶段试验.观察至 d,用限度试验、第阶段、第阶段和第 b阶段的数据按多元概率比回归模型计算L D 和斜率,试验结束.第阶段试验 确定剂量按以下要求确定第阶段试验的试验剂量:最低剂量(剂量)预估L D、最高剂量(剂量)预估L D;当最高剂量 m g被试物/k g体重时,最高剂量设定为 m g被试物/k g体重并重新计算最低剂量(最低剂量最高剂量/);公比(最高剂量/最低剂量)/按公式()计算个中间剂量,i.给药根据 计算的剂量,按 的要求给药,每剂量只鸟.观察观察至 d,用限度试验、第阶段、第阶段、第 b阶段、第阶段的数据按多元概率比回归模型计N Y/T 算L D 和斜率,试验结束.若在第阶段结束后不能得出最大似然估计,应在报告中说明,并以死亡率最接近 的剂量(低于 和高于 各个)的几何平均值作为L D,也可用插值法或移动平均法估算L D.对照组 对照组应使用只与处理组同批孵化的鸟,采用与处理组相同的载体(或胶囊)虚拟给药,并在与处理组相同的环境条件下观察.在虚拟给药前、给药后第d、第d、第 d称重.虚拟给药应安排在处理组第次给药当天.出现以下情况时,对照组应再增加只鸟:新试验阶段受试鸟与试验最初受试鸟不是同批孵化的,应以该批次受试鸟设置对照组;不同试验阶段给药体积不同时,应以该阶段给药体积为对照组虚拟给药.该情况可能出现在最高剂量增加时,需要更大体积来得到合适的溶液或悬浮液;各阶段间隔时间延长或有明显区别时,应在序贯法试验中间阶段(如第阶段或第阶段)开始时为对照组虚拟给药.数据处理 原始数据应以表格形式记录并报告每只受试鸟的试验数据,包括剂量、受试鸟数量、中毒症状、死亡数和实施安乐死的数量、每只受试鸟的死亡时间、中毒症状出现和终止的时间、体重、食物消耗量、大体解剖结果.统计方法 应使用多元概率比回归模型计算L D 和斜率.若第阶段试验结果不能得出最大似然估计,应在报告中说明,并以死亡率最接近 的剂量(低于 和高于 各个)的几何平均值作为L D,也可用插值法或移动平均法估算L D.使用F i e l l e r定理、似然比法或二项式法计算L D 的置信区间.当试验目的是为开展物种敏感性分布而获得L D,仅进行至第阶段试验时,也应使用多元概率比回归模型计算L D,但不应在报告中提供剂量效应曲线的斜率和L D 的置信区间.可使用序贯设计计算器(S e q u e n t i a lD e s i g nC a l c u l a t o r,S E D E C)设计试验剂量并计算试验结果.质量控制对照组受试鸟死亡率不应.试验报告试验报告至少应包括以下内容:a)被试物:)通用名、化学名、化学文摘登录号(C A S号)、结构式、纯度;)来源、批号、有效期、稳定性;)物理性状、水中溶解度及其他相关的理化性质.b)试验方法和试验体系:)试验类型;)受试鸟的物种、品系、来源、日龄、体重及健康状况;)试验方法的详细描述.c)试验过程:)试验浓度设计(处理组和重复的数量、是否单笼饲养);)实验动物驯养时间和分配程序;)给药方法(是否采用胶囊、采用的载体、单位体重给药体积);N Y/T )实验动物饲养条件(鸟笼的规格和材料、温度、湿度、光照时间、光照度);)饲料和饮用水(适用性、标识、来源、组成、热量值、污染物测定结果);)观察的频率、时间和方法(健康/死亡、体重、食物摄入量);)统计方法.d)试验结果:)死亡(死亡时间、中毒症状);)分别以m ga i/k g体重和m g被试物/k g体重计的L D、剂量效应曲线的斜率、置信区间;)回归模型拟合度的指标描述;)症状出现和终止的时间(记录时间应精确到分钟);)大体解剖检查结果;)每只受试鸟的体重数据;)饲料消耗量数据.N Y/T 附录A(规范性)受试鸟明显疼痛和濒死状态的判定A 明显疼痛的判定受试鸟出现以下症状之一时,可认定受试鸟出现明显的疼痛:异常发声;异常攻击性;异常姿势;对触摸的异常反应;异常动作;自残;开放性伤口或皮肤溃疡;呼吸困难;角膜溃疡;骨折;不愿移动;外观异常;体重快速减轻、快速消瘦或严重脱水;大量出血.A 濒死状态的判定受试鸟出现以下症状之一时,可认定受试鸟处于濒死状态:长时间行走障碍使鸟类无法饮水进食或长期厌食;严重体重减轻、极端消瘦或严重脱水;大量失血;证据表明出现不可逆器官衰竭;长期对外部刺激缺乏自主反应;持续出现呼吸困难;长时间无法保持站立;持续性抽搐;自残;长时间腹泻;体温显著持续下降.N Y/T 附录B(规范性)限度试验流程B 限度试验流程见图B ,图中仅显示了处理组.图B 限度试验流程N Y/T B 序贯法试验流程序贯法试验流程见图B ,图中仅显示了处理组.图B 序贯法试验流程N Y/T 附录C(规范性)根据限度试验结果估算L D 的方法按公式(C )估算L D.L D p r o b i t l gl d()()(C )式中:p r o b i t 概率单位,根据限度试验的受试鸟死亡率按表C 选择;l d 限度剂量,单位为m g被试物/k g体重(毫克被试物每千克体重).表C 概率单位的选择死亡率,p r o b i t N Y/T 附录D(资料性)序贯法试验时间线示例序贯法试验时间线示例见图D ,图中仅显示了处理组.图D 阶段序贯法试验时间线示例N Y/T 附录E(资料性)确定部分死亡和逆转个数的示例本附录给出确定部分死亡和逆转个数的示例.其中,剂量从左至右依次增加,部分死亡用“”标记,逆转用表格中阴影部分表示.示例:第阶段使用只鸟,第阶段使用 只鸟,共 只鸟、个剂量.共有个部分死亡、个逆转,进行第 a阶段试验.见表E .表E 完成第阶段进行第 a阶段试验的示例死亡数量鸟类数量死亡率,示例:第阶段使用只鸟,阶段使用 只鸟,共 只鸟;两个阶段最低和最高剂量相同,共 个剂量.共有个部分死亡、个逆转,进行第 b阶段试验.见表E .表E 完成第阶段进行第 b阶段试验的示例死亡数量鸟类数量死亡率,示例:第阶段使用只鸟,第阶段使用 只鸟,第阶段使用 只鸟,共 只鸟、个剂量.共有个部分死亡、个逆转,试验结束.见表E .表E 个部分死亡、个逆转的示例死亡数量鸟类数量死亡率,示例:第阶段使用只鸟,第阶段使用 只鸟,第阶段使用 只鸟,共 只鸟、个剂量).共有个部分死亡、个逆转,试验结束.见表E .表E 个部分死亡、个逆转的示例死亡数量鸟类数量死亡率,示例:第阶段使用只鸟,第阶段使用 只鸟,第阶段使用 只鸟,共 只鸟、个剂量).共有个部分死亡、个逆转,进行第阶段试验.见表E .N Y/T 表E 个部分死亡、个逆转的示例死亡数量鸟类数量死亡率,N Y/T 参考文献O E C D()G u i d e l i n e f o rT h eT e s t i n go fC h e m i c a l sN o A v i a nA c u t eO r a lT o x i c i t yT e s tO E C D()O E C DS e r i e so nT e s t i n ga n dA s s e s s m e n t,N o G u i d a n c eD o c u m e n tO nt h eR e c o g n i t i o n,A s s e s s m e n t,a n dU s eo fC l i n i c a lS i g n sA sH u m a n eE n d p o i n t s f o rE x p e r i m e n t a lA n i m a l sU s e dI nS a f e t yE v a l u a t i o nU SE P A()E c o l o g i c a lE f f e c t sT e s tG u i d e l i n e sO C S P P :A v i a nA c u t eO r a lT o x i c i t yT e s tO E C D()S e q u e n t i a lD e s i g nC a l c u l a t o rAT o o l f o rU s ew i t hO E C DT G :A v i a nA c u t eO r a lT o x i c i t yT e s t