生物技术综合实验COMPREHENSIVEEXPERIMENTSOFBIOTECHNOLOGY省公共.pptx

生物技术综合试验生物技术综合试验Comprehensive experiments of biotechnology 第1页主要内容主要内容 ContentsContents：一、课程介绍一、课程介绍 核酸分离与纯化核酸分离与纯化 Isolation and Purification of Nucleic Acid二、电泳技术二、电泳技术 Agarose Gel Elrctrophoresis and SDS-PAGE 三、聚合酶链式反应技术三、聚合酶链式反应技术 Polymerase Chain Reaction四、四、DNADNA序列测定序列测定 DNA Sequencing五、分子杂交技术五、分子杂交技术 Molecular Hybridization Southern,Northern and Western Blot六、基因文库和六、基因文库和cDNAcDNA文库构建文库构建 Construction of cDNA Library and DNA Library 七、外源基因克隆与表示七、外源基因克隆与表示 Heterogenic Gene Cloning and Expression八、蛋白质分离、纯化技术八、蛋白质分离、纯化技术 Isolation and Purification of Protein第2页1 1 表示蛋白质分离沉淀表示蛋白质分离沉淀第3页蛋白质分离搜集菌体搜集菌体洗涤洗涤破碎细胞破碎细胞等电沉淀盐析沉淀高分子物质分级沉淀分级沉淀超声破碎化学法溶菌酶上清液上清液培养基培养基第4页1.1 凝胶过滤层析凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶小球含有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液经过凝胶过滤层析柱时，溶液中物质就按不一样分子量筛分开了。第5页凝胶过滤层析柱第6页胶球大小-介质离子粗细影响流动(1)胶球颗粒有一定大小，一般可分为corse,medium,fine,superfine四种粗细(grade)；越粗胶体，流率越好，但分辨率越差。因胶球外面缓冲液是由胶球表面向内扩散，样本蛋白质也是以扩散方式进入胶球，再由中心向外扩散出来。胶球半径越大，扩散距离越大，效果越差。(2)下列图说明这种扩散介质机制。而近年来因材料科学进步，发展出通透性特强胶球，缓冲液可直接浸润而进入胶球，不需经过扩散作用，是为dispersion弥散式胶体，效果较好且快速。商品化称为perfusionchromatography。第7页胶球大小胶球大小-介质离子粗细影响流动介质离子粗细影响流动第8页第9页二、二、离子交换层析离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相系统中进行。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子组成。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物吸附作用进行。第10页第11页两大类离子交换介质两大类离子交换介质由介质带电基团不一样，可分为两大类：介质带电基团(counter ion)(1)阳离子交换介质(cation exchanger)：载体-阴离子基团.阳离子(2)阴离子交换介质(anion exchanger)：载体-阳离子基团.阴离子 第12页阳离子：两价阳离子 NH4+K+Na+H+Li+阴离子：I-Br-Cl-HCO3-CH3COO-,OH-第13页四、四、亲和层析亲和层析 亲和层析原理与众所周知抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应机理相类似，每对反应物之间都有一定亲和力。在亲和层析中是特异配体才能和一定生命大分子之间含有亲和力，并产生复合物。实质上亲和层析是把含有识别能力配体L（对酶配体能够是类似底物、抑制剂或辅基等）以共价键方式固化到含有活化基团基质M（如活化琼脂糖等）上，制成亲和吸附剂ML，或者叫做固相载体。而固化后配体仍保持束缚特异物质能力。第14页第15页第16页特异性配体亲和层析法与通用性配体亲和层析法特异性配体亲和层析法：配体普通为复杂生命大分子物质（如抗体、受体和酶类似底物等），它含有较强吸附选择性和较大结协力。通用性配体亲和层析法：配体则普通为简单小分子物质（如金属、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、含有较高吸附容量，经过改进吸附和脱附条件可提升层析分辨率。第17页金属螯合亲和层析a.许多蛋白分子上带有金属离子，则此蛋白质可能会吸附该金属。b.若把某金属固定到固相载体上，则此载体将会专一性地吸附需要此金属蛋白质。c.基因操作时，经常在表示蛋白质末端加上一段含有六个His片段；则此表示蛋白质，可以吸附到含有镍吸著剂上，可以用咪唑流洗出来。d.这种载体上结合有某些可与金属产生配位键基团(如nitrilotriaceticacid)，这些基团与金属离子结合(如镍离子)后，即可成为亲和吸附剂。第18页第19页疏水性层析法(1)蛋白质分子表面有部份疏水性区域，若在一极性很强环境中，则会被吸附在非极性固定相载体上；若环境极性降低，则可被洗脱出来，即为疏水性层析法(hydrophobicinteractionchromatography,HIC)。(2)HIC没有亲和层析析法那么强专一性，较似离子交换法，但所依据作用力，则是非极性基团间疏水性引力。第20页反相层析法(1)是HIC及离子交换法综合体，但属于一个partition层析；可使用离子交换(或类似HIC)介质。(2)混合极性及非极性溶液为流动相，当流动相通入介质后，介质表面可固定其中极性溶液(若使用HIC介质则固定非极性者)，样本分子会在此二相中进行partition分离。(3)因固定相及流动相极性刚好相反，故名reversephase。第21页第22页第23页离子交换层析第24页树脂材质疏水性：聚苯乙烯-苯二乙烯亲水性：纤维素（cellulose）、葡聚糖凝胶（Sephadex gel）和 琼 脂 糖 凝 胶（Sepharose）特征是含有亲水性和较大表面积，对生物活性物质而言，是一个较为温和环境，同時也是大分子所适用分离纯化材质第25页第26页离子交换剂选择保持欲分离物质生物活性。已知等电点物质，在高於等电点pH条件下，因帶有负电荷，应采取阴离子子交換，在低於等电点pH下，則采取阳离子交換。未知等電點物質，在一定pH條件下進行電泳，向陽極移動較快物質，在同樣條件下可被陰離子交換劑吸附，向陰極移動較快物質可被陽離子交換劑吸附。第27页第28页緩衝液選擇緩衝液離子以不干擾分離物活性測定、不影響待測物溶解度、不發生沉澱為原則；使用陰離子交換纖維時要選用低於交換劑離子pK值緩衝液，若欲分離物質屬於酸性，則緩衝液pH值要高於該物等电点；用陽離子交換纖維時要選用高於pK值緩衝液，目标物屬於鹼性物質話，緩衝液要低於該物等電點pH值。所使用緩衝液pH只要比樣本蛋白質pI稍高或低1pH單位即可。第29页DonnanEffect與pH變化離子交換介質表面微環境會比緩衝液高或低一個pH單位。第30页離子交換樹脂前處理離子交換樹脂使用前，先以蒸餾水除去其內之雜質，並以NaOH和HCl處理樹脂，使其上官能基完全露出。再以水清洗至pH7.0，最後用欲使用緩衝液浸泡。第31页(1)離子交換介質與蛋白質結合量有一定程度，稱為該交換介質容量(capacity)；若超過此一容量，多出樣本會直接流出。(2)交換介質結合容量大小，受層析條件不一样、蛋白質種類不一样、緩衝液不一样、pH或離子濃度不一样等，有很大差異。如DEAE-SepharoseCL-6B每100mL可結合11克白蛋白，但對ferritin只有0.4克。介質容量有限第32页可用 pH 或 盐 梯度洗脱方式有：连续梯度(continuous gradient)及 阶段梯度(stepwise gradient)。洗脱洗脱第33页第34页第35页离子交换法操作关键点离子交换法操作关键点1胶体平衡：用过胶体要再生完全平衡在缓冲液中；2洗脱方式：通常都以氯化钠进行连续梯度洗脱；3浓度体积：高低限洗脱液浓度及体积第36页离子交换层析应用制备、纯化生命物质测定蛋白质等电点第37页凝胶过滤层析第38页凝胶分类1）葡聚糖凝胶2）琼脂糖凝胶3）聚丙烯酰胺凝胶第39页凝胶过滤法应用脱盐和浓缩分离生命物质去热源物质（糖蛋白）测定分子量第40页亲和层析第41页亲和层析法基质选择理想基质：1）极低非特异吸附性；2）高度亲水性3）很好理化稳定性4）含有大量化学基团，能有效活化，易和配体结合；5）含有适当多孔性第42页纤维素、聚丙烯酰胺、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔性玻璃珠；用在蛋白質，仍以聚糖類為最正确。以Sepharose為例，可自行用CNBr活化，使糖分子接上-O-CN(cyanateester)基，再與配体上胺基反應。有些親和層析法使用spacerarm來降低配体立体障礙第43页第44页第45页影响亲和层析原因样品体积和流速温度第46页親和層析法應用1.核酸純化：單股DNA與纖維素（cellulose）組合凝膠，已成為分離mRNA主要方法之一將單股DNA接在Sepharose上，純化DNA聚合酶或RNA聚合酶。2.激素受體（receptor）純化3.抗體與抗原純化4.酶和酶抑制劑純化第47页第48页液相柱层析总结第49页介質粒子越細，色析法解析力就越佳，但流動相流速也就越慢。流速太慢反而會導致解析力變差。第50页第51页第52页第53页第54页