我国华南中麝鼩分子系统地理学分析.pdf

Chinese Journal of Wildlife 2024，45（2）：291-297Chinese Journal of Wildlifehttp：/我国华南中麝鼩分子系统地理学分析栾天琪1，郭秋颖1，高艺1，韩美凤1，张春凤2，陈欢1，蔡赫1，金志民1，张隽晟1，刘铸1*（1.牡丹江师范学院生命科学与技术学院，牡丹江，157011；2.黑龙江农业经济职业学院，牡丹江，157011）摘 要华南中麝鼩（Crocidura rapax）亚种分化存在异议。为了明确我国华南中麝鼩的分子系统地理格局，为其分类学提供进一步分子生物学证据，测定了我国贵州华南中麝鼩20个样本的Cyt b基因序列，并结合GenBank下载的19个华南中麝鼩Cyt b基因序列进行一并分析。结果表明：系统发生树首先分成3个大的进化支，即华南中麝鼩华南亚种（C.r.rapax）进化支、西南中麝鼩（C.vorax）进化支、华南中麝鼩台中亚种（C.rapax kurodai）进化支。华南中麝鼩华南亚种分成贵州、云南、四川东南部谱系和四川中西部谱系。遗传距离结果发现，最大遗传距离出现在华南中麝鼩华南亚种四川中西部谱系与华南中麝鼩台中亚种之间（0.118 1），其次是华南中麝鼩华南亚种贵州、云南、四川东南部谱系与华南中麝鼩台中亚种之间（0.117 4）。华南中麝鼩华南亚种2个谱系间遗传距离为0.019 5。中介网络分析也观察到相似分化格局。中介网络图的结果与系统发育关系和遗传距离的结果一致，支持来自台湾的华南中麝鼩样本为独立物种的观点，即台湾长尾麝鼩（C.tadae）。我国华南中麝鼩无亚种分化，分为贵州、云南、四川东南部谱系和四川中西部谱系。在华南中麝鼩的32个样本中发现23个单倍型，核苷酸多样性0.012 85。种群历史分析暗示华南中麝鼩近期尽管经历了种群扩张，但并非为单次急剧扩张。稿件运行过程收稿日期：2023-07-11修回日期：2023-10-24关键词：华南中麝鼩；麝鼩属；分子系统地理学Key words：Chinese white-toothed shr-ew（Crocidura rapax）；Crocidura；Molecular phylogeography中图分类号：Q95文献标识码：A文章编号：2310-1490（2024）-02-0291-07DOI：10.12375/ysdwxb.20240207基金项目：牡丹江师范学院科研项目（GP2022009，HX2023004）；黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目（1452TD008，1451PT008，1451TD002）；黑龙江省自然基金项目（LH2021C095）第一作者简介：栾天琪（1998），男，硕士研究生；主要从事野生动物学研究。E-mail：*通信作者：刘铸，E-mail：野 生 动 物 学 报第45卷Molecular Phylogeographic Analysis of Chinese White-toothed Shrew in ChinaLUAN Tianqi1，GUO Qiuying1，GAO Yi1，HAN Meifeng1，ZHANG Chunfeng2，CHEN Huan1，CAI He1，JIN Zhimin1，ZHANG Junsheng1，LIU Zhu1*（1.College of Life Science and Technology，Mudanjiang Normal University，Mudanjiang，157011，China；2.Hei Long Jiang Agricultural Economics Vocational College，Mudanjiang，157011，China）Abstract：Subspecies differentiation of Chinese white-toothed shrew（Crocidura rapax）is controversial.In order to clarify the molecular phylogeographic pattern of C.rapax and provide further molecular biological evidence for taxonomy，this study analyzed the Cyt b gene sequences of C.rapax（20 samples）collected from Guizhou Province in China together with Cyt b gene sequences of C.rapax（19 samples）downloaded from GenBank.The phylogenetic tree was divided into three main clades：C.r.rapax，C.vorax，and C.rapax kurodai.The C.r.rapax is divided into Guizhou，Yunnan，southeast Sichuan lineage and central and west Sichuan lineage.The results of genetic distance showed that the greatest genetic distance was between central and west Sichuan lineage of C.r.rapax and C.r.kurodai（0.1181），followed by between Guizhou，Yunnan，southeast Sichuan lineage of C.r.rapax and C.r.kurodai（0.1174）.The genetic distance between two lineages of C.r.rapax is 0.0195.A similar geographical patterns was also observed in the median-joining network analysis.The results of median-joining network are consistent with the results of phylogenetic relationships and genetic distance，supporting the view that the sample from Taiwan is a separate species，namely，C.tadae.The C.rapax have no subspecies differentiation in China，and can be divided into Guizhou，Yunnan，southeast Sichuan lineage and central and west Sichuan lineage.Twenty-three haplotypes were found in the 32 samples of C.rapax，and the nucleotide polymorphism was 0.01285.The analysis of population history suggested that C.rapax has experienced population expansion recently，but it is not a single dramatic expansion.华南中麝鼩（Crocidura rapax）隶属劳亚食虫目（Eulipotyphla）鼩鼱科（Soricidae）麝鼩属（Crocidura）。华南中麝鼩自发现后，在相当长的一段时间内被认为是C.russula的一个亚种（C.r.rapax）1。Jiang等2通过形态学分析认为华南中麝鼩和西南中麝鼩（C.vorax）是两个独立的物种，并且两个物种具有较相似的形态，根据形态学相似度将C.kurodai归类于华南中麝鼩。华南中麝鼩的地理分布和亚种分化存在着明显的相关性。一部分学者认为在我国华南中麝鼩具有4个亚种：台中亚种（C.rapax kurodai）分布于台湾；绿岛亚种（C.r.lutaoensis）分布于台湾东南部的绿岛；兰屿亚种（C.r.tadae）分布于台湾东南部的兰屿岛；华南亚种（C.r.rapax）分布于云南、贵州、四川、广东、广西和海南26。另一部分学者认为分布于台湾及其周边岛屿的 3 个亚种（C.r.kurodai、C.r.lutaoensis和C.r.tadae）属于另外一个物种，即台湾长尾麝鼩（C.tadae）的 3个亚种（指名亚种 C.t.tadae、台 湾 亚 种 C.t.kurodai 和 绿 岛 亚 种 C.t.lutaoensis）78，在我国华南中麝鼩无亚种分化，分布于云南、贵州、四川、广东、广西和海南79。可见，华南中麝鼩的亚种分化存在异议。系统地理学是研究物种间及物种内不同类群形成现有分布格局的历史原因和演化过程的一门科学10，分子系统地理学研究为动物分类地位的确定提供了从物种水平到系统发育水平的证据，进而为准确地评价动物物种分布格局奠定良好基础11。鉴于目前缺乏对华南中麝鼩的分子系统地理学系统分析，本研究采集并测序了来自我国贵州的华南中麝鼩Cyt b基因全序列，结合已有报道的我国台湾、四川和云南的华南中麝鼩 Cyt b 基因全序列（GenBank），分析我国华南中麝鼩的分子系统地理格局，292栾天琪等：我国华南中麝鼩分子系统地理学分析第2期进一步为分类学提供分子生物学证据。1研究方法1.1样本采集采用陷阱法，辅以铗捕法采集华南中麝鼩样本。样本采集于我国贵州省，采集时间为2019年1月2021年10月，共采集样本20个，其中安顺地区（262148 N，1055535 E）样本5个（Guizhou AS1Guizhou AS5），毕节地区（262422 N，105444 E）样本 13 个（Guizhou BJ1Guizhou BJ13），六盘水地区（26331 N，1045718 E）样本2个（Guizhou LPS1，Guizhou LPS2）。从GenBank下载了其他地区华南中麝鼩的 Cyt b基因全序列（19个），基本信息见表 1。本研究通过牡丹江师范学院实验动物伦理委员会审查（IACUC-MNU-0-401）。1.2试验方法用剪刀剪取样本腿部肌肉组织，将腿部肌肉组织用酚-氯仿法进行基因组DNA提取。mtDNA的Cyt b基因全序列 PCR 反应体系为 50 L，含 200 mol/L的 dNTP，1.5 mmol/L 的 MgCl2，Primer（L14724/H15915）12各 10 pmol/L，Taq DNA polymerase 2.5 U（大连宝生物），模板为250 ng。PCR扩增的反应条件：94 预变性3 min；94 变性45 s，50 退火50 s，72 延伸45 s，共30个循环；72 延伸7 min，4 保存。PCR扩增产物经纯化回收进行测序（哈尔滨博仕生物技术有限公司）。1.3数据处理使 用 EditSeq（DNAStar 软 件 包）对 试 验 获 得mtDNA Cyt b基因全序列和 GenBank下载华南中麝鼩的序列（表1）进行序列编辑，再利用Clustal W软件进行序列聚类比对13。利用 DnaSP 5.10分析单倍型数量（number of haplotypes，k）、多态位点数量（number of polymorphic sites，s）、单倍型多态性（hap表1GenBank下载的华南中麝鼩Cyt b基因序列Tab.1 The Cyt b gene sequences of Crocidura rapax downloaded from GenBank样本采样地Sampling location1 台湾南投县Nantou County Taiwan Province2台湾台中市Taichung City Taiwan Province3四川省雅江县Yajiang County Sichuan Province4四川省木里藏族自治县Muli Zangzu Autonomous County Sichuan Province5 四川省九龙县Jiulong County Sichuan Province6 四川省小金县Xiaojin County Sichuan Province7 四川省甘洛县Ganluo County Sichuan Province8 四川省得荣县Derong County Sichuan Province9 云南省丽江市Lijiang City Yunnan Province10 云南省泸水市 Lushui City Yunnan ProvinceGenBank号GenBank numberGU358533GU358534GU358535AB057420AB062686AB175086AB115557MN690995MN690996MN690997MN690998MN337427MN337428MN337429KP120863MW682494MW682360MW682357MW682720样本号Sample numberTaiwan NT1Taiwan NT2Taiwan NT3Taiwan NT4Taiwan NT5Taiwan NT6Taiwan TZ1Sichuan YN1Sichuan ML1Sichuan ML2Sichuan JL1Sichuan XJ1Sichuan XJ2Sichuan XJ3Sichuan GL1Sichuan DR1Yunnan LJ1Yunnan LJ2Yunnan LS1293野 生 动 物 学 报第45卷lotype diversity，h）、核苷酸差异平均数（average number of nucleotide differences，i）、核 苷 酸 多 样 性（nucleotide diversity，），计算 Tajima s D 和 Fu s检测中性选择情况，进行显著性检测，并结合种群的增长模型（a population growth-decline model）分析错配分布来检测种群数量扩张情况14。利用 MEGA 5.05 软件，采用最大似然法（maximum likelihood，ML）构建系统发生树15。利用 Network 4.6 构建中介网络图（median-joining network）分析单倍型间进化关系16。2结果2.1系统发育关系以西南中麝鼩和山东小麝鼩（C.shantungensis）为外群，利用ML法构建系统发生树（图1）。系统发生树首先分成3个大的进化支：一是华南中麝鼩华南亚种进化支；二是西南中麝鼩进化支；三是华南中麝鼩台中亚种进化支。西南中麝鼩进化支夹在华南中麝鼩华南亚种进化支和华南中麝鼩台中亚种进化支中间，表现出与华南中麝鼩华南亚种具有较近的亲缘关系。本研究的系统发育关系结果支持来自台湾的华南中麝鼩样本为独立物种的观点，即台湾长尾麝鼩。将华南中麝鼩华南亚种进化支以高支持率（99%）分成两个进化谱系，一个是由贵州所有样本、云南所有样本和来自四川东南部甘洛县的样本构成的贵州、云南、四川东南谱系，另一个是由来自四川中部和西部的样本构成的四川中西部谱系，可见两个谱系分化较为明显。图1基于Cyt b基因构建的华南中麝鼩的ML系统发生树Fig.1 The ML phylogenetic tree of Crocidura rapax based on the Cyt b gene294栾天琪等：我国华南中麝鼩分子系统地理学分析第2期2.2遗传距离计算了华南中麝鼩华南亚种的2个谱系与西南中麝鼩和华南中麝鼩台中亚种的遗传距离（表2）。华南中麝鼩华南亚种的2个谱系间的遗传距离最小（0.019 5），最大的遗传距离出现在华南中麝鼩华南亚种四川中西部谱系与华南中麝鼩台中亚种之间（0.118 1），其次是华南中麝鼩华南亚种贵州、云南、四川东南部谱系与华南中麝鼩台中亚种之间（0.117 4），可见华南中麝鼩华南亚种与华南中麝鼩台中亚种之间的遗传距离较大，超过了西南中麝鼩与两个亚种之间的遗传距离。遗传距离结果与系统发育关系结果一致，支持来自台湾的华南中麝鼩样本为独立物种的观点，即台湾长尾麝鼩。2.3中介网络分析中介网络图（图2）显示出与系统发育关系类似的结果。华南中麝鼩华南亚种贵州、云南和四川东南部谱系的单倍型位于中介网络图的中部，各单倍型间表现出较近的网络关系。华南中麝鼩华南亚种四川中西部谱系位于中介网络图的中部右上方，各单倍型间表现出较近的网络关系，都来自于一个突变节点。西南中麝鼩的单倍型位于中介网络的下方，表现出与华南中麝鼩华南亚种具有较远的网络关系。华南中麝鼩台中亚种的单倍型位于中介网络图的最上方，表现出与华南中麝鼩华南亚种具有较远的网络关系。中介网络图的结果与系统发育关系和遗传距离的结果一致，支持来自于台湾的华南中麝鼩样本为独立物种的观点，即台湾长尾麝鼩。2.4遗传多样性和历史种群动态鉴于系统发育关系、遗传距离和中介网络分析的结果都支持来自台湾的华南中麝鼩样本为独立物种的观点，即台湾长尾麝鼩。本研究只对华南中麝鼩华南亚种包含的样本（32个）进行了遗传多样性和历史种群动态分析。华南中麝鼩的Cyt b基因全序列为1 140 bp，4 种核苷酸碱基含量的平均值分别为A=29.6%，T=31.0%，G=13.2%，C=26.2%，其中T的含量最高，G的含量最低，A+T的含量为 60.6%，明显高于 G+C 的含量（39.4%）。序列包含 68 个变异位点，为 45 个简约信息位点（parsimony informative sites）和23个单变异位点（singleton variable sites），变异位点数占总位点数的5.97%，未发现插入和缺失。华南中麝鼩的遗传多样性参数见表3。在华南中麝鼩的 32个样本中发现 23个单倍型，核苷酸多样性0.012 85。华南中麝鼩的Tajima s D结果（D=-0.542 1，p0.100）尽管不显著，但为负值，Fu s FS结果（FS=-3.771 0，p=0.014）为显著性负值（表3），中性检测结果显示华南中麝鼩近期可能发生过种群扩张。采用错配分布方法对种群历史进行检验，构建的华南中麝鼩错配曲线是多峰曲线（图3），说明华南中麝鼩近期尽管经历了种群扩张，但并非为单次急剧扩张。3讨论Tokuda等17在我国台湾兰屿岛发现了台湾长尾麝鼩。Kuroda 将台湾长尾麝鼩作为南小麝鼩（C.horsfieldii）的一个亚种，并且说明它在台湾主岛没有表2研究类群间的遗传距离Tab.2 Genetic distances between taxa studied研究类群Taxa studied华南中麝鼩华南亚种贵州、云南、四川东南部谱系Guizhou，Yunnan and southeast Sichuan lineage of Crocidura rapax rapax华南中麝鼩华南亚种四川中西部谱系Central and western Sichuan lineage of Crocidura rapax rapax西南中麝鼩Crocidura vorax华南中麝鼩台中亚种Crocidura rapax kurodai华南中麝鼩华南亚种贵州、云南、四川东南部谱系Guizhou，Yunnan and southeast Sichuan lineage of Crocidura rapax rapax0.019 50.108 90.117 4华南中麝鼩华南亚种四川中西部谱系Central and western Sichuan lineage of Crocidura rapax rapax0.110 10.118 1西南中麝鼩Crocidura vorax0.117 0华南中麝鼩台中亚种Crocidura rapax kurodai295野 生 动 物 学 报第45卷分布18。Jameson等19在台湾主岛上发现了南小麝鼩的另外一个亚种（C.h.kurodai）。Fang 等20根据形态学和核型分析，发现C.kurodai与南小麝鼩存在差异，认为C.kurodai为独立物种。Fang等18再次利用形态学和核型分析，认为台湾长尾麝鼩为有效物种，包括 3个亚种：C.tadae kurodai、C.t.tadae、C.t.lutaoensis。近些年，还有很多文献将这些分布于台湾及其周边岛屿的麝鼩归类于华南中麝鼩：台中亚种（C.r.kurodai）、绿岛亚种（C.r.lutaoensis）、兰屿亚种（C.r.tadae）24，6。本研究的系统发育关系、遗传距离和中介网络分析的结果都支持已有文献中认为来自台湾的华南中麝鼩样本为独立物种的观点，即台湾长尾麝鼩。本研究的结果支持已有文献认为台湾长尾麝鼩为独立物种的观点，华南中麝鼩在我国没有亚种分化79。华南中麝鼩被分成两个谱系，即华南中麝鼩贵州、云南、四川东南部谱系和华南中麝鼩四川中西部谱系。由于四川省由北向南的水系较多，推测是水系起到了一定的天然屏障阻隔作用使得华南中麝鼩被分成两个谱系。本研究未能获得我国广东、广西和海南的样本，这些地域华南中麝鼩的分子系统地理学问题有待进一步研究。图2单倍型中介网络（最短树的突变数为330）Fig.2 Median-joining network of haplotypes（number of mutations of the shortest tree=330）表3华南中麝鼩的遗传多样性参数Tab.3 The genetic diversity indices of Crocidura rapax遗传多样性参数The genetic diversity indicesCyt b基因序列的长度/bp Length of Cyt b gene sequence used单倍型数量Number of haplotypes，k多态位点数量Number of polymorphic sites，s单倍型多态性Haplotype diversity，h核苷酸差异平均数Average number of nucleotide differences，i核苷酸多样性Nucleotide diversity，Tajima s DFu s FS华南中麝鼩Crocidura rapax（n=32）1 14023680.98014.6490.012 85-0.542 1；p0.100-3.771 0；p=0.014296栾天琪等：我国华南中麝鼩分子系统地理学分析第2期参考文献：1 ELLERMAN J R，MORRISON-SCOTT T C S.Checklist of 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