Vero细胞HCP宿主残留蛋白ELISA试剂盒说明书分析.doc

Vero 细胞 HCP（宿主细胞蛋白）

Vero细胞宿主蛋白酶联免疫检测
目录 #F500
预期用途

该试剂盒用于检测用Vero 细胞.生产制品中与否有宿主蛋白残留。仅供研究和工业生产，不能用于人和动物诊断。

总结与阐明

病毒疫苗或其他治疗用蛋白在Vero细胞中体现使商业用大量生产药物原料产品经济简便措施。生产和纯化这些产品过程中会残留Vero细胞中某些蛋白质（称为宿主细胞蛋白，HCPs）而导致污染。这种污染可以减少药物疗效，引起毒副反应和免疫学反应，因此最佳在实际生产制品过程中将HCPs减少到最低水平。
某些运用抗体来除HCPs免疫学措施，如Western Blot 和ELISA被广泛使用。虽然Western blot是一种检测HCPs有效措施，但它受到了某些限制。由于它过程复杂且技术依赖性强，需要操作者对成果进行分析解释。并且，它在本质上是一种定性检测，不能定量分析。Western blot敏感性易受被检测样品量影响，也受目产品浓度干扰。因此Western blot可用来检测纯化上游蛋白质，而对纯化下游或终产品检测敏捷度与特异性较低。本试剂盒中用到ELISA措施克服了Western Blot缺陷，将敏感度提高了100倍。
ELISA操作简朴、客观、可获得半定量成果，是纯化工艺，过程控制，常规质量检测最佳选择。这个试剂盒可与纯化过程中残留可独立污染产品所有HCPs反应，就这个意义上来说，这个试剂盒是通用。用Vero细胞轻度裂解物获得抗体并经亲和纯化，得到最终抗体可以与用于生产多种病毒疫苗和蛋白质产品四种商用细胞系反应。这一分析表明，绝大多数HCP存在于多种Vero细胞系和纯化过程中。假如你需要一种更为敏感和特异性措施去检测样品中HCP量，Cygnus Technologies企业为你推荐一种优于2D Western blot措施，我们将这个措施称为2D HPLC-ELISA。2D HPLC-ELISA相较于2D Western blot来说敏感性强，特异性高。要想更多理解此措施，请联络我们企业服务部门。
使用特殊措施制备抗体，以减少低分子量和低免疫原性污染物以及高分子量组分。例如本试剂盒，可以作为一种工艺过程开发工具来监控清除宿主细胞污染物最佳条件，以及保证最终产品公布。
这种敏感性高酶联免疫吸附试剂盒已被用于检测终产品HCP，通过对来自不一样生长状态和纯化过程4种疫苗产品中间产品和最终产品实际检测来得到成果。我们鼓励该试剂盒每个使用者进行类似验证研究以证明它符合他们分析需求。这个试剂盒能满足你们样品需求，不用再运用其他特异性试验，由于那些试验提供信息对这个通用试剂盒来说是反复多出。不过，假如你验证研究表明此试剂盒中抗体与你样品中HCP不能充足反应，那就需要同步运用一种特异性ELISA，且需要特异性强抗血清。或者，假如该试剂盒中使用多克隆抗体能提供足够敏感性和广泛抗原反应性，可用它替代本试剂盒中经共纯化污染物制作原则品，从而在特异HCP检测过程中到达更好精确性。使用更多抗原和抗体所做特异性分析法应用理论上具有更好特异性，但由于它过于特异而不能检测出由于操作不规范或过程变化后产生某些新或非经典污染物。由于这个原因，我们提议用品有广泛反应性“通用”宿主细胞蛋白检测试验分析最终产品纯度，虽然可使用过程特异性分析。假如你认为有必要进行过程特异性分析检测， Cygnus Technologies企业将运用其已经验证措施开发这种抗体并按顾客规定进行检测。

检测原理

Vero细胞检测是一种双位点酶联免疫检测。样品中包括Vero Cell HCPs蛋白与标识有抗-Vero Cell抗体辣根过氧化酶同步反应，反应在之前涂有一层吸附性抗-Vero Cell蛋白抗体微量滴定板中进行。免疫反构成为夹层构造：固相抗体-HCP-酶标识抗体。反应结束后清洗微量滴定板，清除未结合反应物。添加TMB作用底物反应。微量滴定板读数器上测定水解物浓度，水解物浓度与Vero Cell HCPs蛋白浓度成正比。

试剂&材料（试剂盒提供）

成分 产品 #
抗-Vero cell:HRP F501
羊抗Vero cell亲和纯化抗体，用辣根过氧化酶标识。
排列在加有防腐剂试剂盒中， 1x12mL
Anti-Vero cell coated微量滴定板 F502*
12×8孔 装在具有干燥剂袋子内
Vero cell HCP原则液 F503
具有Vero cell HCP、牛血清白蛋白与防腐剂。
规格有 0, 2, 8, 25, 75和 200ng/mL . 1 mL/瓶
终止液 F006
0.5N硫磺酸 1x12mL
TMB F005
3,3’,5,5’-四甲基联苯胺. 1x12mL
清洗物（20倍浓缩） F004
含防腐剂Tris缓冲液 1x50ml
*除了#F505，所有成分都可单独购置

储存&稳定性

*为了保持稳定，所有试剂应储存在2°C至8°C，直到打印所示截止日期为止
*若作为底物试剂在450nm吸光度不小于0.1，则不要使用
*试剂盒所带复原液在保质期前都是稳定

材料和器材（试剂盒不提供）

能在450&650nm对微量滴定板进行读数分光光度计（假如你微量滴定板不能不提供双波长分析，你可以读取450nm波长）
移液枪 50µL 和100µL
多头或多道移液器 100µL
微量滴定板旋转器 150 - 200 rpm
样品稀释液 推荐用Cat # 1028
蒸馏水
1L洗涤瓶，用来稀释洗液

警告

*仅供研究和工业使用
*终止液是0.5N硫磺酸，严禁眼睛、皮肤或衣服与之接触。试剂盒其他试剂均无害
*该试剂盒只能由有资格技术人员操作

试剂预处理

*将所有试剂放到室温下
*用蒸馏水将浓缩洗液稀释到1L，在试剂盒上贴上标签，写上组别和失效日期，储存在4°C

注意事项

1.对洗板，除去过量未反应试剂对保持试验反复性和敏捷度是必不可少。我们强烈提议不要使用自动化或其他手动操作真空吸尘装置清洗板，由于这样会减少特异性吸光度，增长非特异吸光度，使精确度变化。下面简介人工清洗程序在一般状况下只导致较低背景干扰，且特异性吸光度高，精确度更好。
2.样品中HCP浓度高时可观测到高剂量钩状效应或低水平线性稀释。高剂量钩效应是由于在纯化上游阶段样品HCP浓度过高，相对来说抗体较低而引起。浓度不小于1mg/mL 样品，其吸光度低于200 ng/mL原则液。当抗体浓度超过HCP浓度时，也会出现钩效应。在这种状况下，未稀释样品吸光度也许低于试剂盒最高原则液吸光度。然而，这些样本不能显示伴随稀释度增长，HCP浓度也增长线性关系。钩状效应最常出目前纯化上游阶段。假如也许出现钩状效应，我们需要对已稀释样品进行检测。假如未稀释样品中HCP浓度低于已稀释样品中HCP浓度，则也许引起钩状效应。这样样品至少要稀释到用试验中间品和终成品验证了需要稀释最低程度（MRDS）。在保证记录学精确度状况下，一系列能检测出相似HCP值样品稀释度中，MRD是第一种符合规定稀释度。据报道，样品稀释度与HCP值关联是在已建立MRD基础上修正。所用稀释剂应当精确回收。首选稀释剂是我们规格为100ml、500ml或1l/瓶 Cat# I028。本试剂盒原则液也是由这种稀释液制备。当样品用1028稀释时，其稀释模型开始靠近原则，从而减少用其他稀释液所导致任何错误。其他要用稀释液必须测试非特异性结合，并用它们回收 已稀释200ng/mL原则液，措施如下文所述。

局限性

*在依托这种检测来检测宿主细胞残留蛋白之前，每一种试验室都应当验证该试剂盒抗体和检测程序特异性、精确性和精确度与否符合规定。可以从我们企业服务部门或网站获得验证试验措施。

*在本试验中使用原则品包括用常规措施在疫苗产品初次收获液中溶解Vero细胞HCPs。在该试剂盒中使用用来分析抗体1D Western blot可识别经敏感蛋白染色（如银染和胶体金染色）大多数PAGE分离条带。由于Vero 细胞系大多数HCPS会体现出足够抗原量，该试剂盒应当有足够抗体活性与你细胞系充足反应。不过，我们不能保证该试剂盒能检测出你们生产过程中所有蛋白质或蛋白质片段。假如你但愿用比 western blot 更为敏捷措施来检测该试剂盒中抗体与你HCPs与否充足反应，我们将为你提供通过ELISA后用2D-HPLC分离HCPs措施。

*某些样品基质也许会干扰试验。本试剂盒使用原则品试图模拟经典样品与基质矩阵。然而，潜在产品自身或样品基质中其他成分也许对本试验产生某些正向或负向干扰。高或低PH值，去垢剂，尿素，高浓度盐和有机溶剂是已知干扰原因。提议对所有样品基质进行测试以排除干扰，用经稀释200ng/ml原则液，1/4基质不含或含非常低HCP。假如要用原则品检测未知样品，则需添加30到50 ng/mL原则品HCP值。至于怎样定量样品基质值，请征询企业服务部门。

*防止对具有叠氮化钠（NaN3）样品进行测定，由于它会破坏辣根过氧化酶连接活性，测得HCP值偏低。

试验方案

* 该测定是非常强大，可通过变化孵育时间、样本大小及它后续反应等试验中可变原因可提高敏感性，增长分析范围或减少样本基质干扰。在修改我企业推荐措施之前请联络我们，我们将以最佳方式输入数据以保证到达您期望目。
*试验指定使用经认证微量滴定板振动器或旋转器进行免疫学操作。这些设备可以从大多数试验室购置，不需要在企业买。或者你也可以直接在我们企业购置经验证，预校准微量滴定板振动器。假如你没有这样装置，可以直接在板中孵育，不需要震荡，但要将免疫孵育时间延长到一种小时左右来到达使用振荡器所到达效果。孵育时前30min不要振荡，否则会导致背景污染或减少精确度。
*将所有试剂放到室温下。设置板分光光度计测试波长为450nm，650nm处读数为作为参照。
*彻底清洗是保证本试验性能必不可少环节。我们强烈提议不要使用自动化或其他真空吸尘装置清洗板。本试验推荐手工清洗措施是保证精确性、敏感性和对性首选。有关此措施更详细信息可以从企业服务部门或网站获得。
*所有原则品、对照品和样品至少应做一次反复试验。
*试验板孔加入试剂次序应一致，以保证所有反应孔孵育时间一致。
*作一种工作记录，以确定检测时原则品、对照品和样品各自位置。
*提议您试验室对每一种过程对照品进行测试，以保证所有试剂和程序是对。强烈规定你用来自所用细胞系样品基质和HCP做一种经典样品矩阵作为对照。这些对照品可分装到单次使用小瓶中，并保留在0度使其长时间保持稳定。
*假如该底物具有明显蓝颜色，也许是在检测之前已被污染。假如100µL底物吸光度加上以100µL水为空白对照时吸光度超过0.1，我们就需要更换新底物，否则试验敏感性会受影响。
*应在加入终止液后30min内读板，由于蛋白质着色会伴随时间推移而褪色。

质量控制

*反复样品精确度用两者平均比例计算。在8-200ng／mL样品范围内，变异系数不不小于10%，而样品＜8 ng/ml时，变异系数可不小于10%。
*当以水为底物进行空白对照时，最佳吸光度应 < 0.1.
*提议各试验室检测每个过程中质量控制样品，以保证所有试剂和程序是对。

成果计算

原则液可用于制作原则曲线，原则液浓度相称于免疫反应HCP总浓度。根据测定小孔中原则液吸光值绘制原则曲线。数据分析可以使用计算机选配曲线，例如点到点、三次样本函数或四参数逻辑曲线。不要使用线性回归分析修改样品吸光值，这样会出现明显误差。也可以手工绘图，Y轴标注吸光度，X轴标注浓度。然后根据样品吸光值计算出样品中HCP浓度。

试验环节
1. 分别移取50µL原则液、对照物和样品至待测孔
2. 移取100µl anti-Vero Cell:HRP(#F501)至每孔
3. 密封滴定板，摇床室温(24°C + 4°)温育2小时，180rmp
4.直接倾到或用移液管轻轻吸走孔内溶液，并用吸水纸吸干残留液。350 µL清洗缓冲液冲洗四次。擦干微量滴定板外液体，由于任何残留物都会影响读数。清洗缓冲液不能长时间停留在孔内。加TMB前不能让孔内干燥。
5. 加100µl TMB 作用物(#F005)
6. 室温静置30min,不需摇床
7. 加100µl反应终止液(#F006)
8. 分光光度计450/650nm读数，以空白对照调零。

范例

孔
含量
抗体 450nm
抗体
量
1A
0原则品
0.112

1B
0原则品
0.109
0.111

1C
2ng/mL
0.142

1D
2ng/ml
0.141
0.142

1E
8ng/ml
0.205

1F
8ng/ml
0.208
0.207

1G
25ng/ml
0.400

1H
25ng/ml
0.421
0.411

2A
75ng/ml
0.957

2B
75ng/ml
1.013
0.985

2C
200ng/ml
2.299

2D
200ng/ml
2.316
2.308

2E
样品A
0.213

2F
样品A
0.209
0.211
8.4
2G
样品B
0.939

2H
样品B
0.982
0.961
72.9

性质

Cygnus Technologies用老式措施对试剂盒性能进行了如下验证。假如需要话，认证汇报可从企业网站获得。此验证在本质上是通用，并且是为了补充而不是替代某些顾客和产品应当具有由每个试验室进行资格验证。但这些试验室必须对他们自己样本做一次试验矫正。此外，本试验范围内产生来源于HCPs任何样品类型均应进行稀释线性以保证检测精确性，并确定具有足够抗体与你HCPs充足反应。每个试验室和技术人员在规定精确性检测过程中应当具有如下描述能力。更多提议做验证程序可在企业服务部门或网站获得。

敏感度
最低检测限（LOD）定义为比空白对照平均值高两倍样品浓度。LOD是~ 0.7 ng/mL.
最低定量限（LOQ）被定义为浓度变化系数（CVS）是不不小于20%时可测到最低浓度。 LOQ is <2 ng/mL。

精确度
组内（20个反复）和组间（10个试验）精确度有3个水平（~ 8ng／ml）、中（~ 25ng/ml）、高浓度（~ 75ng／ml）检测成果决定。CV比例为三个水平所测平均值除以原则偏差再乘以100。

水平
组内CV
组间CV
低
6.9%
4.4%
中
5.5%
3.7%
高
3.5%
3.6%

特异性/交叉反应
对4中商用商业Vero细胞株进行1D Western blot and ELISA分析 表明，在所有细胞系中大多数蛋白质是保守。因此此措施也可用来检测其他Vero细胞株HCP。1D/2D Western blot与ELISA无关，且不能用银染或胶体金染色技术对非特异蛋白进行染色。虽然如此，银染成果和western blot成果不一致并不一定意味着没有抗那种蛋白抗体或用 ELISA 不能检测到那种蛋白质。假如你想在检测试剂盒中抗体与 HCPs反应时用比western blot更为敏感和特异措施， Cygnus很快乐可以提供服务和/或基于2D高效液相色谱法 ELISA分析 HCPs征询。这种措施已被证明在检测HCP时具有更高敏捷度和精确度。同样用于捕捉抗体和HRP标签可以单独购置 如# VC 807-AF。
没有用这个试剂盒对非HCP成分交叉反应进行广泛研究。由于存在正向干扰，如交叉反应性和非特异性结合，您应当确定您样品中成分。有关负向干扰研究如下文描述。

矫正/干扰试验
纯化和Vero细胞体现药物原料最终配置用到多种缓冲基质通过已知数量Vero细胞HCP蛋白质来评价，本试剂盒用该蛋白质制备原则品。由于检测目是尽量减少基质干扰，大部分缓冲液产生可接受矫正范围定义为80-120%。这个试剂盒使用原则品包括8mg/ml牛血清白蛋白，目在于模拟非特异性蛋白去影响大多数样品蛋白或病毒产品。然而某些产品高浓度也许会干扰测量HCPs精确性。在一般状况下，PH极端值（<5.0和＞8.5），高浓度盐，高浓度多糖和大多数洗涤剂可导致低矫正率。每个操作者应保证他们样品基质能得到对矫正。这样试验可以通过稀释试剂盒提供200ng/ml原则品到样品基质中进行，如“Limitations”部分所述。 Cygnus 可提供HCP更多浓度梯度(Cat # F503H at 100µg/mL) 用于制备试剂盒原则物，最终为您样品回收和对照分析做准备。

钩状效应量
把 HCPs浓度＞200ng/mL测定作为未知数。钩状效应容量，定义为能
产生吸光度读数不小于1000 µg/mL，不不小于200 ng/mL浓度范围。

订购信息&客服

预定订单或想得到更多信息，请联络 Cygnus Technologies:

Cygnus Technologies, 有限企业
地址4701 Southport Supply Rd. SE, Suite 7
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传真: 9