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蛇足石杉资源分布和种植方面的研究进展 杨秋容夏玉玲摘要：为了合理开发和利用珍稀药用植物蛇足石杉的药用价值，本文对蛇足石杉的资源分布和栽培种植方面的研究成果进行了总结分析，并对今后的研究进行展望。关键词：蛇足石杉；野生资源；内生真菌；种植繁殖；组织培养：Q949.95 ： A ： 1674-0432（2014）-17-27-4蛇足石杉Huperzia serrata（Thunb.） Trev.为石杉科植物石杉属的一种，高等植物图鉴称为蛇足石杉，植物名实图考和全国中草药汇编称为千层塔。各地还有各种别名，如金不换、虱子草、狗牙齿、矮松、山芝、蛇足草、矮杉树、救命王、宝塔草、万年杉、打不死、矮罗汉、虱婆药、雪山一枝蒿等。蛇足石杉是一类多年生小型蕨类植物，常土生、附生于阴凉潮湿的苔藓层环境中或林荫湿地或沟谷石上，分布于东北、长江流域及华南、西南各地。1、2中国民间一直用全草来治疗跌打损伤、毒蛇咬伤、烧伤烫伤、淤血肿痛、内伤吐血等。31972年国内首次在动物试验中报道其所含生物碱石杉碱甲HupA有松弛横纹肌作用，4随后又发现HupA对记忆衰退、重症肌无力和多发梗死性痴呆均有显著疗效，且石杉碱甲具有低毒、高效、可逆和高选择性的特点，是乙酰胆碱酯酶抑制剂，对老年痴呆症有显著疗效。1993年美国FDA批准石杉碱甲片属于类胆碱能剂，已被国际上列为第二代的乙酰胆碱酯酶抑制剂之一。5目前市场上成品药有哈伯因和双益平，石杉碱甲透皮吸收贴片也获得国家食药局验收通过。由于石杉碱的疗效特殊，国内外学者对它的全合成、衍生物及类似物的合成作了大量的工作。6、7HupA结构复杂，目前很难人工合成，工业提取所需原料还完全依赖野生资源。天然HupA主要来源于石杉科植物，而本科中石杉属植物中HupA含量最高，马尾杉属植物也含很高的HupA。目前制药厂生产的HupA制剂主要以野生的蛇足石杉为主要原料。蛇足石杉虽然分布较广，但是它对生境求较高，加上植株矮小，生长周期长，单位时间、单位面积产量和天然总贮存量均很低，经20多年的极度采挖，野生资源遭到严重破坏。故充分了解蛇足石杉的资源分布并合理利用野生资源，同时研究先进的种植技术，以达到既防病治病又能保护资源的目的是目前研究者的当务之急。1 蛇足石杉植物的生物学特性1.1 典型形态8、9蛇足石杉为多年生蕨类植物。高1024厘米，全株暗绿色。营养器官包括根、茎、叶。其中根为不定根，和真菌共生形成内生真菌的外生菌根，常伸入土中或基质吸收营养。茎的表皮外被角质层，皮层含叶绿体，能进行光合作用，皮层细胞内含生物碱结晶，有14回二叉分枝，顶端常有细小芽胞，芽胞落地成新苗。叶绿色，螺旋状着生，叶薄纸质，等面叶，上表皮细胞内含有生物碱结晶，孢子叶与营养叶同形或异形。繁殖器官是蛇足石杉的孢子。1.2 生活史10蛇足石杉的孢子存在于孢子囊中，成熟时横裂出孢子。孢子萌发后，先形成初生的配子体，30天左右变成成熟的配子体。成熟的配子体能独立生活，通常贴在地面上利用苗根获取营养，配子体会产生颈卵器和精子器，而精子和卵在潮湿的环境下完成受精。受精卵发育成胚，幼胚暂时寄生在配子体上，长大后配子体死亡，孢子体独立生活。幼孢子体的顶端先长一片幼叶，随着幼苗的长大，相继长新叶，等到幼苗长至23厘米时，开始出现二叉分枝。1.3 生长特性11-12蛇足石杉为丛生的草本植物，常土生或伴生于苔藓层中，分布在海拔3002700米的山地密林下、沟谷阴湿土中及潮湿背阴的岩石陡壁上；在中亚热带南部亚区和南亚热带有团块状分布现象，但仍以散生状分布为主；群落上层乔木树种主要有毛竹、三尖杉，灌木树种有栅木、金银花、映山红、紫金牛等，草本植物有蕨、多花黄精、三脉紫菀、泽兰等，伴生植物有金发藓及暖地大叶藓等。不定根和真菌共生，菌丝就代替了根毛，增加了根系的吸收面积。10植物生长缓慢，配子体和孢子体阶段均需要与土壤中的特定真菌共生形成菌根才能生长。13蛇足石杉在野生条件下通过孢子繁殖和生殖芽繁殖。14千层塔具有二叉分蘖的特征。2 蛇足石杉植物的资源分布2.1 石杉科植物的资源存量石杉科（Huperziaceae）分类学上的地位是蕨类植物门石松亚门石松纲石松目。该科植物古生代曾繁盛，是最古老的植物类群之一。但随着自然环境的改变，现大多数种类已灭绝。仅少数种类残存于人烟稀少的原始森林中，生长极其缓慢，对环境要求甚为苛刻。全球该科植物约170余种，广泛分布于世界各地。石杉科植物在我国南北均产，现存两属马尾杉属（Phlegmariurus（Herter）Holub）分布于长江以南，现知23种；石杉属（Huperzia Bern.）广泛分布于全国，现知25种，15-17其中可以作为石杉碱甲天然来源的植物包括蛇足石杉、华南马尾杉、藤石松和石杉近缘种小接筋草。蛇足石杉属于石杉科石杉属（狭义）蛇足石杉组Sect.Serratae （Rothm.）Hollub的一种。2.2 蛇足石杉的资源分布2.2.1世界范围内的资源分布 11蛇足石杉及其各种变种广布于亚洲、大洋洲、中美洲、俄罗斯、太平洋等地。主要分布在亚洲热带和亚热带地区，其次向北通过日本列岛和朝鲜半岛可到达我国东北及与我国东北毗邻的西伯利亚相对较湿润的地区，向东在太平洋及中美洲的岛屿也有少量分布。从世界范围来看，中国海南省是蛇足石杉的分布中心。2.2.2 国内的资源分布 11除西北、华北的干燥少雨和盐碱地所属地区外，蛇足石杉在我国大约20个省市都有分布：向北达黑龙江，向南到海南岛，西至西藏，向东到沿海各省。如：黑龙江（饶江）、吉林（长白山、抚松）、江苏（宜兴）、安徽（黄山、宁国、九华山、浩寨）、浙江（衢州、昌化、天童山、遂昌、天台、天目山、孝丰、杭州、庆元、泰顺、龙泉、西天目山、鄞县、宁海、乐清、云和、江山）、江西（井冈山、寻邬、庐山、奉新、铅山、萍乡、安福、宜丰、玉山、黄岗、大余、广昌、瑞金、石城、双龙、宁岗）、福建（泰宁、长汀、崇安、南靖、上杭、南平、连城、沙县、建阳、德化、龙岩）、台湾（阿里山）、湖南（龙山、宜章、武岗、黔阳、雪峰山、道县、宁远、汝山、慈利、衡山、南岳、江华、保靖）、广东（信宜、五华、紫金、罗浮山、阳山、乐昌、增城、封川、连县、乳源、修仁、龙门）、广西（大明山、凭祥、龙胜、武鸣、大苗山、龙津、临桂、大瑶山、陵乐、灵川、宾阳、马山、百色、元宝山、环江）、海南（海南）、四川（峨眉山、都江堰、雷波、沐川、古蔺、名山、洪雅、马边、汉源、雅安、天全、筠连、南充）、重庆（重庆、江津、南川、石柱）、贵州（贵阳、松桃、印江、江口、安龙、兴仁、凯里、平坝）、云南（昆明、绥江、永善、景东、广南、泸水、大关、福贡、元江、腾冲、镇康、砚山、西畴、屏边、贡山、峨山、麻栗坡、文山、金平、富宁、勐连）、西藏（察隅、黑脱）。 3 蛇足石杉种植的生境要求3.1 海拔蛇足石杉海拔分布范围为较广。11，16、18蛇足石杉从502700米均有分布，而3001500米分布较多；蛇足石杉种群在海拔650900 米时植株长势较好，分布相对集中；不同海拔处理对千层塔生物学产量具有极显著的作用，其中1200米海拔下试验的产量最高。即不同地区、不同海拔对蛇足石杉的分布和长势、产量的影响可以看出，蛇足石杉与海拔有一定的关系。但影响蛇足石杉生长繁殖与产量的主要因子可能是与海拔有关的土壤、微生物以及伴生物种等因子。16野生千层塔资源主要有3种类型，即类型A、类型B和类型C，分别分布在海拔8001200米、12001600米和16001800米的生态区域，每种类型的分布存在明显的海拔界限，以团块状和散生状分布为主。从上述研究可见，大面积人工种植蛇足石杉，最好选择在低、中海拔的地区种植为佳。3.2 温湿度除黄河流域和西北地区外，蛇足石杉从黑龙江至海南20多个省市均有分布，主要分布在亚热带地区，可见蛇足石杉的适应温度范围较广。从孢子萌发至成熟孢子体形成均需要较高的湿度。水分是决定初生孢子体（原叶体）成苗的关键因子。可见蛇足石杉对湿度的要求较高，较低的湿度不适宜生长。14、20、21蛇足石杉适宜在毛竹林下气温20以上、相对湿度90%以上的高温高湿下生长、发育；而石杉碱甲含量并不随着温度的升降呈现显著变化，但蛇足石杉近缘种皱边石杉中的石杉碱甲含量与产地的年平均温度会呈现明显的负相关。19高温胁迫试验结果显示，高温对蛇足石杉的生长有明显影响，其生长温度在2530为宜，长时间持续超过35对其生长有明显的影响，40为极限高温，短期内会引起植株死亡。 22试验证明蕨类植物整个育苗过程中湿度都必须保持在80%以上，否则就会因条件不适宜延迟发育或死亡。15蛇足石杉在繁殖阶段，孢子母细胞必需在水分充足的条件下才能顺利完成发育和分裂，在有水的环境下形成受精卵；大田栽培蛇足石杉时也应保持阴湿的环境才能保证它完成生活史。14栽培蛇足石杉时夏季的相对湿度应控制在80%以上。16郁闭度较高，年降雨量1500毫米以上，空气湿度78%以上，土壤中含水量高的条件有利于蛇足石杉的生长，但过高的降雨量不利于石杉碱甲的合成。20但是蛇足石杉的芽孢繁育技术要求芽孢育苗基地须做好排水、灌溉等规划设计，薄膜湿度在80%以上。由此看出，人工种植蛇足石杉时，严格控制好温湿度，能有效提高蛇足石杉的产量和质量。3.3 光照蛇足石杉的叶片和茎均含叶绿体，能进行光合作用，故需在一定光照条件下才能健康生长，而蛇足石杉喜阴湿环境中，较强的光照则不利于生长。14用遮阳网平铺2层种植蛇足石杉的成活率最好，用遮阳网平铺1层和垂直铺1层蛇足石杉抽出新梢的高度最高，而过高或过低的光照强度均不利于蛇足石杉的生长。光照强度为13303000 lx时蛇足石杉生长较好，生产上可以采用覆盖1层遮阳网或在毛竹林下栽培繁育。20在芽孢繁育体系的建立上提出基地建立需要搭设荫棚，阳光交钱的顶部和侧面用23层遮阳网，阴面只用1层遮阳网或防虫网，达到遮光度80%。18不同遮阳度处理对千层塔生物学产量具有极显著的作用，其中以林地自然遮阳为产量最高；NFT扦插育苗要求外植体生根部位必须保持黑暗状态。23较高的光照度破坏了蛇足石杉体内PPO、POD和CAT活性的平衡，同时导致蛇足石杉体内可溶性糖和可溶性蛋白含量大幅度变化，指出较低光照度（1200 lx）比较适合蛇足石杉的生长。24对蛇足石杉扦插繁殖时采用的8001200lx的光照强度进行处理，以促进插条成活。12培养茎尖诱导愈伤组织，如果用全光照培养45天，外植体都发白死亡；用暗培养，茎外植体始终保持嫩绿，2个半月后长出淡黄色的愈伤组织；用自然光照培养2030天能长出灰白色的幼根，说明千层塔外植体在培养时不需要外加光源。25Dean P.Whittier对近缘种植物孢子培养发现，暗培养有利于孢子萌发，这种现象是否适用于对蛇足石杉孢子还有待深入研究。可见，在人工栽培和组织培养蛇足石杉时，严格控制光照。3.4 土壤26有机质是土壤养分的主要来源，不同区域生长的千层塔和长势和石杉碱甲的含量不同。蛇足石杉适宜生长在富含腐殖质的土壤表层，而沙壤、轻壤、排水不良的粘土等都不利于其生长。30蛇足石杉对土壤有机质与全氮的要求高于庄稼土与腐殖土，且蛇足石杉还需要更多的铅和锰。16蛇足石杉适合生长的土壤要求有机质含量为6.18%9.75%、pH4.755.31。13腐殖土与河沙的混和土壤作蛇足石杉的扦插基质比腐殖土或河沙单独作为基质要好，最佳的生根基质要求基质多孔，通气和排水良好，并能保持湿润。21蛇足石杉为酸性指示植物，在碱性土壤中不可能生长，蛇足石杉适宜在酸性土壤（pH3.514.02）中生长，所以在栽培过程中应特别注意土壤酸碱度的调控；且同属植物皱边石杉中石杉碱甲含量与土壤中速效钾的含量呈正相关。27蛇足石杉适合生长在P、S、K、Ca、Al和Zn富集度较高的土壤中。可见，人工培育蛇足石杉时应注意土壤或培养基为弱酸性，多施用农家肥和氮肥，并注意各营养元素的协调与合理配合。3.5 伴生物种20中国蛇足石杉常分布于暖温带和亚热带常绿阔叶林区域、季风常绿阔叶林及其退化的次生生态系统中。海南省蛇足石杉的伴生植物主要有栎属、厚皮香、毛棉杜鹃、海南五针松以及新叶蕨、岩姜蕨等。12千层塔属阴生蕨类植物，野生居群多分布在杂木林、灌木丛和毛竹林内，具有相当郁蔽的小环境，特别是在毛竹林下千层塔生长良好。28蛇足石杉主要分布在原生常绿阔叶林、各种次生林及人工林下的荫湿生境，在群落中处于从属地位。11人工柳杉林或阴坡的人工杉木林和毛竹林也有利于蛇足石杉的分布，而阳性人工林如松林和阳坡的天然林或人工植被却很少有分布。29蛇足石杉的伴生物种共有73种，其中双子叶植物68种，乔木1种灌木层51种，草本19种，藤本植物2种，优势种为毛竹。可见，蛇足石杉最好种植在阴湿的人工林或次生林中，特别是毛竹林中。 3.6 内生真菌26，31，32蛇足石杉的孢子萌发过程有真菌介入，对配子体的生长发育有重要影响。蛇足石杉的内生真菌主要种属有：点霉属、组丝核菌属、顶孢霉属、单轴霉属、青霉属、头孢霉属、镰刀菌属、交链孢属、支顶包属、曲菌属和藻状菌等。内生真菌在蛇足石杉不同部位的数量、分布、种群和作用上存在有差异。蛇足石杉内生真菌中，点霉属、组丝核菌属、交链孢属和曲菌属为优势种群。内生真菌在蛇足石杉的组织分布差别较大，有一定的组织选择性，以茎中最多，其次为叶片，根中最少。蛇足石杉的内生真菌能显著提高蛇足石杉扦插生根率，增加生根条数；其中镰刀菌属可以产石杉碱甲，小叶蛇足石杉的内生真菌混合培养物也检测到石杉碱甲；提供合适的支顶包属菌发酵条件，能有效提高石杉碱甲产量。茎点霉菌最适生长温度为26，最适pH4.0，适合在黑暗下生长。由此可见，蛇足石杉往往与内生真菌形成共生体，人工栽培种植过程中需要合理利用内生真菌来促进植物生长发育，提高生物产量和经济产量，但是对蛇足石杉的组织培养来说，需要不断摸索消毒灭菌方法，达到既能消毒灭菌，又不影响蛇足石杉的生物产量和经济产量的目的。4 蛇足石杉的栽培种植方法从上述蛇足石杉的生境要求可以看出，蛇足石杉的栽培种植需要的条件较为苛刻。目前蛇足石杉通常通过三种方式成苗：孢子繁殖、芽胞繁殖、分株繁殖，现在也可以采用组织培养快速繁殖。4.1 孢子繁殖13蛇足石杉在野生条件下主要通过孢子和生殖芽繁殖。但孢子萌发周期长，萌发后在地下形成配子体，需615年才能成熟，还有报道从孢子萌发到植株成熟需要1520年。事实上蛇足石杉通过生殖芽繁殖的现象也很少，极大地限制了蛇足石杉野生资源再生。4.2 芽孢繁殖33在夏末秋初蛇足石杉植株的顶端开始发育出芽孢，每个枝条长出24个，到了春季，芽孢逐渐发育成熟，脱离母株，在适宜的条件下可以萌发成新的植株。而且芽孢繁殖所需要的时间比孢子繁殖要短。只是多数植株不能长出芽孢。所以研究芽孢的发生机理对芽孢繁殖很有帮助。4.3 分株繁殖14蛇足石杉具有二叉分蘖的特征，上年所生新梢茎端一般都具有2个萌蘖，当年每个萌蘖抽出1个新梢，每个新梢年生长高度约35厘米。以后每年通过这种生长方式进行增殖。33蛇足石杉不能采用“采收枝条，保留茎干”的方式进行收割，茎段扦插能够生根，但不能长芽，12个月后茎段枯黄。但在天然生境中蛇足石杉采用扦插和压条方式繁殖，成苗率高，是一种可行的繁殖方式。34蛇足石杉的扦插试验表明，高浓度的萘乙酸不利于发根，而高浓度的吲哚丁酸十分有利于发根；已萌芽的插条生根率、平均生根量和平均根等指标明显高于不萌芽插条，且死亡率较低；以腐殖土+河沙（11）混和土壤为基质，生根率、平均生根量、均根长和根分叉率比河沙与腐殖土单独作基质的高。盛束军等对蛇足石杉扦插繁殖研究表明，采用扦插效果最好为2000毫克/公斤吲哚丁酸，其次为1000毫克/公斤生根粉。最佳的生根基质以腐殖土与河沙的混和土壤作扦插基质好。关于穗条方面，萌芽的插条比不萌芽的插条扦插效果好。100%河沙扦插效果最好，生根率可达40%以上。4.4 组织培养快速繁殖目前，国内外对石杉科植物的组织培养研究较少。由于蛇足石杉中有大量内生菌，组织培养中外植体需要进行多次灭菌，换土栽培也不易成活。12用MS或1/2MS培养基对蛇足石杉外植体培养的影响差异不大，但在培养基中加入5毫克/升 2，4-D和毫克/升 KT到MS培养基上培养，就可诱导出愈伤组织；外植体在培养时不需要外加光源。37蛇足石杉的组织培养过程中，选取茎尖或芽胞作外植体比以叶作外植体污染率要低。35如果用茎段作外植体，需先预处理，再用47热水浴处理1小时，之后用70%酒精处理30秒，最后0.1%升汞处理7分钟后，能达到较好的表面消毒及内生菌消除的效果；如果用孢子囊和茎尖作外植体，也需先预处理后，再经过70%酒精处理30秒，0.1%升汞处理4分钟即可达到较好的表面消毒效果。试验发现，孢子囊和茎尖几乎不含内生菌，是可作为组织培养较好的外植体。36以蛇足石杉茎尖为外植体，适宜的初代培养基为MS+0.05mol/L IBA+1.4mol/L KT+2mg/L谷氨酰胺。消毒方法用0.1% 升汞液灭菌3分钟，再用无菌水冲洗5次较理想。5 展望蛇足石杉在资源分布调查、生境条件研究和栽培方法上都有较系统的研究，现在当务之急是保护野生资源，加大人工栽培技术和组培快繁技术的不断完善，以达到合理开发和利用的目的。参考文献1 李建宗.湖南植物志，第一卷M.长沙：湖南科学技术出版社，2004：175.2 浙江药用植物志编写组编.浙江药用植物志（上册）M.杭州：浙江科学技术出版社，1980：51.3 王月蛾，岳冬贤，唐希灿.石杉碱甲的抗胆酯碱酶作用J.中国药理学报，1996，12（7）：110-113.4 MA X Q，TAN C H，ZHU D Y，et a1.Huperzine A from Huperza species An ethnopharmacolgical review J.Journal of Ethnopharmacology，2007，113：15-34.5 叶金翠，陈国神，曾苏.石杉碱甲透皮吸收贴片的含量测定与有关物质研究J.中国药学杂志，2006，41（20）：1589-1591.6 余红英，孙远明，杨跃生.蛇足石杉生物碱的研究J.时珍国医国药，2002，13（3）：176-178. -全文完-